土壤盐碱化是限制植物生长和生产的重要因素^[1-2]。种植适应盐碱地生长的植物是治理盐碱、改善盐碱地区生态环境的有效措施。以往的盐胁迫研究主要以单盐作为胁迫盐, 但就我国而言, 大面积的盐碱地中, 除新疆和松花江部分地区土壤以硝酸盐为主外, 其他地区主要是含有Na⁺、K⁺、Mg²⁺的3种阳离子和CO₃^2-、HCO₃^-、Cl^-、SO₄^2-的4种阴离子的复合盐碱地, 所含盐分复杂, 盐化与碱化往往相伴发生^[3], 生态破坏力也比单独的中性盐更大。因此, 混合盐碱胁迫是实际存在的主要问题。根据这一现状, 人们将NaCl、Na₂SO₄、NaHCO₃、Na₂CO₃按不同比例混合, 人工模拟混合盐碱胁迫条件, 对燕麦^[4]、绿豆^[5]、红砂^[6]、桑树^[7]、甜瓜^[8]、向日葵^[9]等多种植物展开了研究。盐胁迫和碱胁迫是两种不同性质的胁迫。在混合盐碱胁迫中, 既有盐胁迫也有碱胁迫, 二者间具有协同效应。碱胁迫强度较低时盐胁迫起主导作用, 碱胁迫强度较高时碱胁迫起主导作用。其中缓冲量和盐度是复杂盐碱条件对植物胁迫作用的主导因素^[10-13]。王晨等^[14]发现, 随着胁迫强度的增加, 甜高粱幼苗茎叶鲜重呈下降趋势, 相对电导率和脯氨酸含量均呈上升趋势, 而SOD活性则表现出先升后降趋势。刘晓静等^[15]研究表明, 随着盐浓度的升高, 紫花苜蓿幼苗叶绿素含量呈先增加后减少趋势。闫艳华等^[16]指出, 随着盐pH的升高, 番茄幼苗受害加重, MDA含量增加, SOD、POD活性呈先升高后降低趋势。

柳树为杨柳科柳属(Salix)植物, 其树干高大通直, 生长快, 寿命长, 材质优, 抗性强, 既是重要的园林绿化植物, 也是用材林和农田防护林的常用树种^[17]。目前, 关于柳树耐盐性的研究主要以中性盐NaCl胁迫^[18]和碱性盐Na₂CO₃、NaHCO₃胁迫^[19-20]为主, 而其对于混合盐碱胁迫的响应研究较少。“盐柳1号”(Salix psammophila ‘Yanliu NO. 1’)来源于内蒙古沙漠地带的灌木北沙柳, 是山东省林业科学研究院经过十多年的研究和选育, 从中选育出的一个乔木品种。本研究将NaCl、Na₂SO₄、NaHCO₃、Na₂CO₃按不同比例混合, 模拟出12种盐度和碱度各不相同的盐碱条件, 对盐柳1号盆栽幼苗进行处理, 研究混合盐碱胁迫对盐柳1号幼苗生长和渗透调节物质含量的影响, 以探索盐柳1号的耐盐碱范围和耐盐碱生理特性。

1 材料与方法 1.1 材料培养

试验材料为柳树无性系“盐柳1号”(山东省林业科学研究院提供), 取长15 cm、直径1 cm左右的柳树当年生插条, 于2016年3月份定植于口径和高均为15 cm的塑料花盆内, 栽培基质为洗净的河沙和适量珍珠岩, 并用多菌灵进行消毒。每盆1株, 每3盆一组作为3个重复。扦插定植后, 用1/2Hogland营养液进行浇灌并在温室内培养, 温室内的昼夜温度为25/18℃。培养45 d后, 选取长势相对一致的柳树幼苗进行试验。

1.2 模拟盐碱设计

将2种中性盐NaCl、Na₂SO₄和2种碱性盐NaHCO₃、Na₂CO₃按不同比例混合, 按碱性盐比例逐渐增大的顺序分成3个处理组(分别用A、B、C表示)。每组内设4个浓度梯度(分别用1、2、3、4表示), 其混合盐总浓度依次为50、100、150、200 mmol/L, 其中A₁表示A处理组浓度为50 mmol/L的处理, 依此类推。共模拟出12个混合盐碱组合。从表 1可以看出, 组内pH值的变化明显小于组间, 因此分析数据时以同组各浓度pH值的平均值作为该组的pH值, 所以A、B、C处理组的pH值分别为8.04、8.66、9.47。

1.3 盐碱胁迫

选13组长势相对一致的柳树幼苗, 1组浇1/2Hogland营养液作为对照, 其余12组进行A₁—A₄、B₁—B₄、C₁—C₄的编号, 分别用含有相应浓度的混合盐溶液进行胁迫处理, 处理间隔为3 d, 每次浇100 mL/盆。为避免盐冲击现象, 胁迫处理时盐浓度每次增加50 mmol/L, 直至达到设定浓度。处理期间, 定期定量补水。胁迫处理14 d后采集柳树幼苗相应部位的功能叶片进行指标测定。

1.4 指标测定 1.4.1 株高生长量的测定

测定胁迫前后各处理组柳树幼苗的株高H₁和H₂, 株高生长量=胁迫后的株高H₂-胁迫前的株高H₁。

1.4.2 丙二醛(MDA)含量的测定^[21]

称取0.5 g植物样品, 先加10%三氯乙酸(TCA)2 mL, 研磨匀浆后再加入3 mL TCA进一步研磨, 研磨后所得匀浆在3000 r/min下离心10 min, 取所得上清液2 mL于带塞玻璃试管中, 加入0.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液2 mL, 混合后于沸水浴上反应20 min, 迅速冷却后离心, 上清液分别于532、600、450 nm波长下测定吸光度值。对照管以2 mL蒸馏水代替提取液。

1.4.3 脯氨酸含量的测定^[22]

称取0.5 g植物样品置带塞玻璃试管中, 加入5 mL 3%磺基水杨酸溶液, 在沸水浴中提取10 min(提取过程中要经常摇动), 冷却后过滤于干净的试管中, 滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2 mL提取液于另一干净的带塞玻璃试管中, 加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮试剂, 在沸水浴中加热30 min, 溶液即呈红色。冷却后加入4 mL甲苯, 摇荡30 s, 取上层液在3000 r/min下离心5 min。轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色皿中, 以甲苯为对照, 在520 nm波长处比色, 求得吸光度值。

1.4.4 可溶性糖含量的测定^[22]

称取0.3 g植物样品, 剪碎, 放入带塞玻璃试管中, 加入10 mL蒸馏水, 于沸水中提取30 min(提取2次), 提取液过滤入25 mL容量瓶中, 反复漂洗试管及残渣, 定容至刻度。吸取样品提取液0.5 mL于20 mL刻度试管中, 加蒸馏水1.5 mL, 然后向试管中加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5 mL浓硫酸, 充分震荡, 立即将试管放入沸水浴中, 逐管均保温1 min, 取出后自然冷却至室温, 以空白作参比, 在630 nm波长下测定吸光度值。

1.5 数据处理

运用Excel 2016、SPSS 19.0对试验数据进行处理和分析, 采用单因素方差分析对不同盐浓度和不同pH值下各生理指标的差异性进行显著性分析, 多重比较采用Duncan法。

2 结果与分析 2.1 盐碱胁迫对柳树幼苗株高生长量的影响

衡量植物耐盐性最直接的指标就是盐胁迫后植株的高度, 它是体内各种代谢反应的综合表现^[23]。在混合盐碱胁迫下, 盐柳1号幼苗的生长受到了不同程度的抑制。如图 1所示, 随着盐浓度的增大, A、B、C处理组的株高生长量均呈降低趋势, 且均显著低于CK(P < 0.05), 并在盐浓度200 mmol/L时均降至最小值。其中, A处理组的株高生长量相对CK依次降低了27.20%、45.48%、53.18%、61.32%；B处理组的株高生长量与CK相比依次降低了29.65%、46.82%、63.77%、68.67%；C处理组幼苗的株高生长量与CK相比依次降低了31.22%、55.96%、66.33%、73.02%, 且在盐浓度高于150 mmol/L时叶片全部枯黄。在同等盐浓度条件下, 随着碱性盐比例(pH值)的增高, 盐柳1号幼苗的株高生长量均呈降低趋势。在盐浓度50、100和150 mmol/L时, A、B、C处理组的株高生长量差异均不显著(P > 0.05)。

2.2 盐碱胁迫对柳树幼苗叶片丙二醛(MDA)含量的影响

盐碱胁迫下植物体内氧自由基代谢失衡, 细胞膜受到活性氧攻击产生膜质过氧化, 最终细胞膜的结构和功能遭到破坏。如图 2所示, 随着盐浓度的增大, A、B、C处理组的MDA含量均呈整体升高趋势, 且均高于或显著高于CK。其中, A处理组的MDA含量增幅较小, 与CK相比差异均不显著(P > 0.05)；B处理组的MDA含量在盐浓度大于100 mmol/L时开始显著增加(P < 0.05)；C处理组的MDA含量均显著高于CK(P < 0.05)。A、B处理组的MDA含量在盐浓度200 mmol/L时均达到最大值, 分别相对CK增加了23.82%、154.29%；C处理组的MDA含量在盐浓度100 mmol/L时达到最大值, 与CK相比显著增加了41.83%(P < 0.05)。在盐浓度50 mmol/L时, A、B、C处理组的MDA含量差异均不显著(P > 0.05)。

2.3 盐碱胁迫对柳树幼苗叶片脯氨酸含量的影响

游离脯氨酸是一种可溶性蛋白, 与水具有极强的吸附性, 是参与植物渗透调节的主要物质之一。如图 3所示, 随着盐浓度的增大, A、B、C处理组的游离脯氨酸有不同程度的积累。其中, A、C处理组的脯氨酸含量均呈先升高后降低趋势, 且分别在盐浓度150、50 mmol/L时达到最大值, 分别相对CK增加了72.58%、14.66%；B处理组的脯氮酸含量在盐浓度150 mmol/L时达到最大值, 与CK相比显著增加了158.75%(P < 0.05)。从整体来看, A、C处理组的脯氨酸含量增幅较小, 与CK相比差异均不显著(P > 0.05)；B处理组的脯氨酸含量在100 mmol/L以下盐浓度范围内增加缓慢, 而在高盐胁迫下骤然增加。在同等盐浓度条件下, A、B、C处理组的脯氨酸含量差异均不显著(P > 0.05)。

2.4 盐碱胁迫对柳树幼苗叶片可溶性糖含量的影响

随着盐浓度的增大, A、B、C处理组的叶片可溶性糖含量呈间断性积累(图 4)。其中, A处理组的叶片可溶性糖含量呈先升高后降低趋势, 与CK相比差异均不显著(P > 0.05), 并在盐浓度100 mmol/L时达到最大值, 相对CK增加了35.25%；B处理组的可溶性糖含量在盐浓度150 mmol/L时开始显著增加, 在盐浓度200 mmol/L时达到最大值, 与CK相比显著增加了313.99%(P < 0.05)；C处理组的叶片可溶性糖含量均显著高于CK(P < 0.05), 且在盐浓度100 mmol/L时达到最大值, 与CK相比显著增加了48.45%(P < 0.05)。在盐浓度50 mmol/L时, A、B、C处理组的可溶性糖含量差异均不显著(P > 0.05)。

2.5 胁变指标与盐浓度和pH值的方差分析

方差分析表明(表 2), 不同盐浓度和盐组合(pH值)以及两者间的交互作用对盐柳1号幼苗的叶片MDA含量和可溶性糖含量的影响均达到极显著(P < 0.01)；不同盐浓度对株高生长量和脯氨酸含量的影响均达极显著水平(P < 0.01)；不同pH值对株高生长量的影响达到极显著(P < 0.01), 对脯氨酸含量的影响不显著(P > 0.05)；交互作用对株高生长量和脯氨酸含量的影响均不显著(P > 0.05)。盐浓度对各胁变指标的影响明显大于pH值的影响。

3 讨论与结论

植物在环境胁迫下生长会受到抑制, 混合盐碱胁迫对植物生长的影响尤为显著^[24]。本研究中, 在混合盐碱胁迫下, 盐柳1号幼苗的生长受到了不同程度的抑制。A、B、C处理组的株高生长量随着盐浓度、pH值的递增均呈降低趋势, 尤其是在碱性盐比例较高的C处理组(pH值为9.47), 在高盐胁迫下盐柳1号幼苗的叶片全部枯黄(C₃、C₄)。这说明在混合盐碱胁迫下, 盐柳1号幼苗不仅受到盐浓度的影响, 而且还受到高pH的协同作用, 这与李玉梅在牛叠肚幼苗上的研究结果类似^[25]。

植物遭受逆境胁迫时细胞膜首先会受到伤害, 丙二醛(MDA)是植物膜脂过氧化的产物, MDA含量越高, 说明植物受伤害的程度越大^[26]。闫永庆等^[27]研究表明, 随着盐、碱浓度的加大, 白刺叶片质膜所受伤害逐渐增大, MDA含量增加。本研究中, 在混合盐碱胁迫下, 盐柳1号幼苗的叶片MDA含量随着盐浓度的增大有不同程度的增加, 这表明氧自由基已诱发膜脂过氧化, 细胞膜受到不同程度的伤害。其中, A处理组的MDA含量增加幅度不大, 说明盐柳1号幼苗叶片质膜受伤害程度不大；B处理组的MDA含量在盐浓度高于100 mmol/L时骤然增加, 说明盐柳1号幼苗叶片膜质过氧化程度加剧, 植株受害加重；C处理组幼苗在盐浓度高于150 mmol/L时叶片全部枯黄, 说明盐柳1号幼苗已失去对盐碱胁迫的应激能力。

盐胁迫会造成植物渗透胁迫、膨压丧失^[28], 植物体通过增加渗透调节物质来增大细胞质浓度, 以平衡液泡和细胞质的水势, 平衡渗透势, 防止液泡从细胞质中吸水, 避免细胞质这个代谢中心受到影响^[29-31]。脯氨酸和可溶性糖是植物体内重要的渗透调节物质, 郝凤等^[32]研究发现, 随着盐碱胁迫浓度的增大, 植物体在积累脯氨酸的同时, 糖的合成也增加。本研究中, 随着盐浓度的增大, 盐柳1号幼苗的叶片脯氨酸和可溶性糖含量均有所上升。在低盐胁迫下(100 mmol/L以下), A、B、C处理组的脯氨酸和可溶性糖含量变化均不明显；在高盐胁迫下(150 mmol/L以上), A处理组的脯氨酸和可溶性糖含量增加不显著, B处理组的脯氨酸和可溶性糖含量骤然增至最大值, C处理组幼苗的叶片全部枯黄。说明盐柳1号幼苗对混合盐碱胁迫具有一定的耐受性, 当超过耐受范围时植株大量积累脯氨酸和可溶性糖, 以此来缓解盐碱胁迫带来的伤害, 直至承受不住高盐高碱的胁迫作用而死。

混合盐碱胁迫并不是盐、碱两种胁迫的简单叠加, 而是有一定协同效应^[33]。本研究中, 在低盐度时(50 mmol/L), pH值虽然由7.91增至9.33, 但叶片MDA含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量的变化均不明显, 说明单纯碱胁迫作用较小；在低碱度时(A组), 虽然盐浓度由50 mmol/L增至200 mmol/L, 但叶片MDA含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量的增加幅度不大, 说明单纯盐胁迫作用也较小。而当盐胁迫与碱胁迫共同作用时(C₃、C₄), 盐柳1号幼苗的叶片全部枯黄, 说明盐与碱的协同效应会对植物造成更大的伤害。

本研究结果表明, 在高盐低碱或高碱低盐的条件下盐柳1号幼苗可以正常生长, 盐浓度低于100 mmol/L的混合盐碱胁迫对盐柳1号的生理变化影响不大；盐浓度高于150 mmol/L, pH＞9.51时会对盐柳1号造成较大的伤害。