化感作用(Allelopathy)是近年来化学生态学领域的研究热点之一, 它主要指植物(或微生物)之间相互抑制或促进的生物化学作用^[1], 供体产生化感物质后通过淋溶、挥发、根系分泌或残体分解等途径释放到环境中, 从而影响到受体植物的生长和发育。供体植物(或微生物)与受体植物(或微生物)属于同一物种时, 就称为自毒作用^[2]。其中抑制性的化感-自毒作用更为普遍, 受到研究者重视, 成为近年来植物化感研究的一种趋势^[3-4]。

杨树(Populus)是中国重要的人工林栽培树种之一, 2015年杨树栽培面积已超0.067亿hm², 居世界首位。杨树在集约栽培中会出现土壤病或树病, 其中连栽障碍的问题较为常见^[5]。所谓“连栽障碍”, 是指植物在单一连栽/作的条件下, 随着栽培时间增长而地力逐代衰退、植物质量随之下降的现象。对于植物连栽障碍的研究, 早期大多从土壤养分匮乏和人工抚育的角度对其发生机制进行阐释^[6-7]；近期的研究指出：连栽障碍的发生与植物在连栽过程中积累一定质量浓度的自毒物质从而产生抑制性的自毒作用有关^[8-9], 自毒作用很可能是连栽障碍的关键诱因。学界对杨树化感/自毒作用的研究已有涉足, 如探讨杨树不同器官的浸提液或分解物对作物生长的影响^[10-12]、研究外源自毒物质对杨树的抑制效应与修复^[13-15]、比较不同抚育方式或不同品种的杨树自毒效应^[16-17]等, 但目前尚缺乏基于长期数据的杨树化感生物测定的报道, 各研究样本的时长最多不超过10a。而在抚育实践中, 长期集约连栽人工林是普遍存在的, 长期连栽年限与自毒作用的关系值得探讨。本研究以单一连栽时间达40a的长期集约种植杨树人工林作为研究对象, 并选取Ⅰ代林(连栽10a)、Ⅱ代林(连栽30a)、Ⅲ代林(连栽40a)3个连续时间的人工林土壤为样本形成对照, 以揭示人工林连栽及土地利用的临界年限。

确认植物是否存在化感-自毒作用, 用模式植物对研究对象进行生物测定(bioassay)是最常用的方法。目前对连栽作物的化感生物测定较为充分^[18-20], 而连栽人工林受树木生长周期和野外条件的影响, 取样比较困难, 通常采用模拟试验进行生物测定^{[13, 21]}, 只有少数报道以直接取样于连栽样地的样本配置成母液进行生物测定^[22]。本研究采取野外采样的方式, 选取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代连栽杨树林土壤为样本, 对杨树的根部进行生物测定。根际是植物与环境进行物质与能量交换的活跃区域, 研究显示多年生植物的根际土与非根际土土壤微生物群落存在差异^[23], 这可能是根系区域发生化感作用的证据。本文通过对不同代际杨树林土壤的生物测定和营养液对照实验, 旨在探察长期集约连栽是否有可能导致杨树林在土壤中逐步积累具备显著自毒效应的毒性物质、以及推断杨树发生自毒作用的途径, 以期为从化学生态学的角度解决杨树人工林连栽障碍和土地利用时限问题提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验区概况

黄淮海平原是中国杨树人工林的主要栽培区之一。本研究选择江苏省徐州市西北部的丰县大沙河林场(34°79′ N, 116°57′ E)作为实验区, 区内林地的抚育管理措施具有一致性。样区3个林代的基本信息如表 1所示:生物量逐代下降, 显示出连栽障碍的特点。其中Ⅰ代林的土壤栽植年限约为10a, Ⅱ代林约为30a, Ⅲ代林约为40a。杨树品种均为意大利引进欧美杨无性系72杨P. euramericana ‘San Martino’, 其特点为生长期较长、林积生长较快。

1.1.2 采样方法

2013年5月, 在大沙河林场选取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代杨树林样地, 土壤质地均为砂土。每代试验样地随机选取10株杨树。采样木树高12—14m、胸径18—20cm、树龄约10a。每株杨树分别采集一袋(170mm×240mm自封袋)根际土壤和一袋非根际土壤。根际土壤采用抖落法采集直径＜0.5cm的杨树细根上附着的土壤(1—2mm), 连同细根一起放入袋内。非根际土壤为根区域内非附着于根际的土壤。在选取的10株杨树中任选其中5株, 在距离树干约90cm无根系处随机选取两点, 用内径6cm的取土环刀采集土壤样品, 每个林代10个样品用于测定土壤理化性质。回实验室后取出根际土壤中的细根切碎, 剩余根际土壤过0.25mm筛去除杂物, 切碎后的细根仍旧放进过筛后的土壤样品中, 混匀风干备用。非根际土壤直接过0.25mm筛风干备用。对土壤化学性质的测定每个指标设立3次重复。

1.1.3 供试植物

种子萌发试验选取敏感植物莴苣(Lactuca sativa)为供试受体, 与相关报道一致^[24-25]。选取颗粒饱满、大小一致、无发霉无破损的莴苣种子, 乙醇消毒后超纯水冲洗干净备用。植株生长试验所用的扦插杨树条采自与土壤样本同一地点的植株, 截取长度20cm、直径约为2cm的杨树条做为供试受体, 超纯水清洗干净备用。

1.2 方法 1.2.1 土壤理化性质

土壤化学性质测定的具体操作参考文献进行^[26]：采用便携式pH计测定土壤pH值；采用半微量凯氏定氮法测定全氮含量；采用碱解扩散法测定速效氮含量；采用硫酸-高氯酸消煮法测定全磷含量；采用碳酸氢钠浸提钼锑抗比色法测定速效磷含量。

土壤物理性质的计算方式如下：

其中,

不同代际杨树林土壤理化性质分析结果见表 2。

1.2.2 种子萌发生物测定试验方法

将50粒莴苣种子置于铺有两层滤纸、直径为12cm的培养皿中。光周期20℃, 16 h；暗周期15℃, 8 h。种子萌发以破皮发芽为标准。3d后统计种子发芽数。

(1) 根际土壤浸提液与非根际土壤浸提液抑制活性初步筛选：将Ⅰ代林、Ⅱ代林和Ⅲ代林根际土壤浸提液和非根际土壤浸提液分别加入培养皿, 质量浓度均为1g/mL, 对照为3 mL纯水, 共7个处理, 每个处理设3次重复。

(2) 根际土壤的抑制种子萌发浓度梯度试验：为进一步确定连栽杨树人工林根际土壤浸提液抑制种子萌发的浓度依赖性以及最低抑制浓度, 将Ⅰ代林、Ⅱ代林和Ⅲ代林的根际土壤母液稀释后分别配置成0.1、0.2、0.5、0.8、1 g/mL的培养溶液, 加入培养皿, 每个培养皿摆放莴苣种子50粒, 共15个处理, 每个处理3次重复。

当抑制率>0, 表示浸提液对种子萌发具有抑制作用；当抑制率 < 0, 表示浸提液对种子萌发具有促进作用。

1.2.3 扦插杨树水培试验方法

购置塑料小桶若干, 桶口放置白色塑料泡沫, 将杨树扦插条从泡沫插入深入到桶内, 每个桶插入5根枝条, 整齐排列, 用泡沫固定好位置。

(1) 不同代际杨树林根际土壤浸提液对水培扦插杨树生长发育的影响：将质量浓度均为1g/mL的Ⅰ代林、Ⅱ代林和Ⅲ代林根际土壤浸提液加入各小桶作为第1处理组, 对照为纯水；另将质量浓度均为1g/mL Ⅰ代林、Ⅱ代林和Ⅲ代林根际土壤浸提液与霍格兰德营养液一起加入各小桶作为第2处理组, 对照为纯水+营养液。两组共8个处理, 每个处理重复5次。

(2) 不同质量浓度的根际土壤浸提液对水培扦插杨树生长发育的影响：将Ⅲ代林的根际土壤母液稀释后分别配置成0.1、0.2、0.5、0.8、1 g/mL的培养溶液, 加入小桶, 对照为1L纯水。共6个处理, 每个处理5次重复。

生长抑制率(%)=(第30天对照生长长度-第30天处理生长长度) /第30天对照生长长度×100%

当抑制率>0, 表示浸提液对扦插枝条生长具有抑制作用；当抑制率 < 0, 表示浸提液对扦插枝条生长具有促进作用。

光周期20℃, 16 h；暗周期15℃, 8 h。每3d换新溶液1次, 30d后剪下胚芽和根, 进行长度测量。

1.3 数据分析

统计采用单因素方差分析(ANOVA)和最小显著极差法(LSD)检验, 主要用Excel 2007和SPSS 19.0完成。

2 结果 2.1 莴苣种子萌发的生物测定试验 2.1.1 根际土壤与非根际土壤的化感活性对照试验

根际土壤浸提液对莴苣种子的萌发具有显著的抑制作用, 而非根际土壤浸提液对莴苣种子的萌发抑制不显著(图 1)。其中, 与纯水对照组84.5%的萌发率相比, 无论是Ⅰ代林、Ⅱ代林还是Ⅲ代林, 根际土壤组的莴苣种子萌发率均显著减少, 萌发率最高不超过60%, 尤其是Ⅲ代林的萌发率仅为48.7%, 达到极显著抑制的水平(P < 0.01)；而非根际土壤组只有Ⅲ代林的土壤浸提液显著抑制了莴苣种子的萌发(P < 0.05), 其萌发率为72.7%, 而Ⅰ代林与Ⅱ代林土壤浸提液的种子萌发率分别为83.0%和79.7%, 与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。此外, 根际土壤与非根际土壤的处理组内呈现一致的规律：Ⅰ代林与Ⅱ代林对莴苣种子的萌发抑制性无显著差异(P>0.05), 而Ⅲ代林的土壤浸提液与前两代林相比, 对莴苣种子萌发有显著的抑制性, 其中根际土壤组呈现极显著的差异(P < 0.01)。由此可见, 根际土壤能够明显抑制莴苣种子的萌发, 而Ⅲ代林的根际土壤对种子萌发的抑制效应最显著。

2.1.2 根际土壤的抑制种子萌发浓度梯度试验

结果如图 2所示：随着根际土壤的浸提液质量浓度的增高, 其对莴苣种子的萌发抑制率增大。其中Ⅱ代林和Ⅲ代林在0.1g/mL的低浓度时能够促进萌发率增长(萌发率高于对照)。而3个林代的抑制趋势略有不同：其中Ⅰ代林随着浓度增大, 抑制率增大的幅度最小, Ⅱ代林接近线性趋势, Ⅲ代林随着浓度升高而增大抑制萌发率的幅度最大。0.2—0.5g/mL的浓度范围内, 3个林代的抑制萌发率最接近。

2.2 根际土壤浸提溶液抑制杨树植株生长试验 2.2.1 不同代际杨树林根际土壤浸提液对水培扦插杨树生长的影响

如实验结果所示：根伸长方面, Ⅰ代、Ⅱ代、Ⅲ代林的土壤浸提液在营养液组与无营养液组的抑制趋势完全一致：Ⅰ代林比对照组根伸长长度略大, 但差异不显著；Ⅱ代林比Ⅰ代林根伸长长度显著降低、Ⅲ代林比Ⅱ代林根伸长长度显著降低(图 3)；胚芽生长长度方面, 两组中Ⅲ代林的胚芽生长长度均比Ⅱ代林显著降低、Ⅰ代林与对照组的胚芽生长长度均无显著差异, Ⅱ代林与Ⅰ代林在无营养液组的胚芽生长长度没有显著差异, 但营养液组中, Ⅱ代林比Ⅰ代林的土壤浸提液显著抑制了胚芽生长长度(图 3)。

因此总体而言, 无论在营养液组还是无营养液组, 杨树的胚芽生长长度和根伸长长度均随着代际增大呈现一致的降低趋势, 并且营养液组比无营养液组的抑制程度更显著。

2.2.2 不同质量浓度的根际土壤浸提液对水培扦插杨树生长的影响

随着Ⅲ代林根际土壤浸提液质量浓度增大, 扦插杨树胚芽生长长度和根伸长长度都显著降低, 而浸提液对胚芽生长长度和根伸长长度的抑制率随浓度增大而增大(表 3)。

胚芽生长长度随土壤浸提溶液浓度的升高而呈现逐渐降低的趋势, 抑制率呈现逐渐升高的趋势, 其中在最低浓度0.1g/mL时抑制率为负, 即与对照相比, 土壤浸提液对胚芽生长有促进作用。土壤溶液浓度为0.5g/mL时胚芽生长长度为4.88cm、抑制率为14.7%, 与溶液浓度在0.1、0.2g/mL和1g/mL时均存在显著差异, 但与0.8g/mL浓度无显著性差异。

与胚芽生长长度类似, 根伸长长度随土壤浸提溶液浓度的升高亦呈现逐渐降低的趋势, 抑制率呈现逐渐升高的趋势, 其中在最低浓度0.1g/mL时抑制率为负, 即与对照相比, 土壤浸提液对根伸长有促进作用。土壤溶液为0.8g/mL时根伸长长度为4.12cm、抑制率为39.2%, 两者与溶液在0.1、0.2g/mL和1g/mL浓度时均存在显著差异, 与溶液在0.5g/mL时无显著性差异。

3 讨论

化感作用的发生途径主要有挥发、淋溶和根系分泌3种, 本研究的结果表明杨树人工林的根际土壤相较于非根际土壤, 对测试种子的萌发具有更显著的抑制作用, 这种“根际效应”与已有的报道结论一致^[27-28], 该结果也提示连栽杨树林更主要通过根际集聚化感物质而非枯落物淋溶化感物质的路径产生自毒效应；而连栽年限最长的Ⅲ代林无论是根际土壤还是非根际土壤的浸提液都显示出对测试种子的萌发抑制作用, 加上在Ⅲ代林阶段, 土壤的酸性程度较前两代林显著增大(表 2), 很有可能与枯落物的长期淋溶作用相关, 因此推测到了连栽后期, 杨树根系分泌物与枝叶淋溶均有可能成为化感作用的发生途径。已有报道显示, 生长期较长的森林的确可以通过枝叶淋溶的途径逐渐积累自毒物质, 如天山云杉在天然更新过程中, 针叶通过淋溶作用对更新种子产生自毒作用从而阻碍森林更新^[8]。而长期连栽杨树的枯落物淋溶作用与植株自毒效应的相互关系与内在机理需要进一步澄清和研究。

本研究的结果证实杨树人工林根际土壤浸提液在低质量浓度时, 可能对种子萌发和植株生长具有促进作用, 而在高质量浓度时, 对两者只有抑制作用, 并且浓度越大、抑制性越强。这与普遍报道的化感物质对植株生长具有“低浓度促进、高浓度抑制”的浓度效应的结果相一致^[29-31]。“浓度效应”的产生应与化感作用的浓度依赖性有关, 也证实了化感物质在田间条件下需要积累到致毒浓度才有可能对植株产生抑制性。需要指出的是, 本研究的结果显示出植物在连栽环境中, 其根际物质的浓度效应与植物的连栽年限相关：连栽时间最长的Ⅲ代林在根际土壤低质量浓度时对植物生长具有促进作用, 而栽种时间最短的Ⅰ代林在低浓度时并不显示对种子萌发的促进作用(图 2)。亦即连栽时间越长其浓度依赖性越显著。这个结果在以往的报道中尚不多见, 该现象进一步提示连栽之后的植物在根部积聚的物质很可能正是具有浓度效应的化感/自毒物质, 尤其在连栽后期土壤中自毒物质的积累已经较为充分, 其“低促高抑”的特征也比前两代林显著, 成为引发连栽障碍的重要因素。

本文结果表明随着连栽年限增加, 植株的自毒效应显著增大而生长质量降低, 这与一些学者采用土培实验对连作植物进行自毒作用研究的结果相一致^[32-33]。有研究报道显示植物连栽障碍与土壤有效养分的降低有关^[34], 在人工林抚育实践中也采用增肥措施来解决连栽障碍, 因为长期连栽常常伴随土壤养分结构的恶化。在本研究中, 连栽林代出现不同程度的养分恶化：尽管抚育措施相同, 但土壤中速效氮的含量出现逐代下降、Ⅲ代林土壤的速效磷含量也显著低于前两代林(表 2)。然而, 本研究所采用表明添加营养液的方式没有缓解连栽土壤浸提液对植株生长的抑制作用, 甚至抑制作用相较于无营养液组更显著(图 3)。这至少表明对于长期集约连栽的杨树, 仅用施用营养液来改善连栽障碍的依据是不充分的。添加营养液不能改变抑制作用的原因可能是自毒物质本身会限制植物吸收养分的有效性或恶化土壤养分结构^[35], 自毒物质积累越多, 对植株吸收养分的限制越强。但由于施肥存在多样化的措施, 增施氮肥、绿肥等是否能够有效遏制连栽杨树自毒作用则有赖于下一步在土培实验中进行验证。基于本研究已有的结果, 本文支持近期以来从化感作用的角度阐释连栽障碍的发生机制, 并推断长期连栽使得自毒物质积聚在植物根部(或其它重要器官), 抑制植物生长发育与种内更新, 引发连栽障碍。

4 结论

(1) 连栽杨树人工林土壤对植物的抑制性自毒作用主要发生在杨树根际部分, 根系分泌的方式是杨树人工林主要的自毒作用途径。

(2) 杨树人工林根际土壤的自毒作用具有浓度效应：随着自毒物质的浓度增大, 对植株的生长抑制性增强。但在低浓度时有时会促进植株的生长。

(3) 根际土壤对杨树生长的抑制作用随着连栽林代的增加而显著, 而采用增施营养的措施不一定缓解连栽时间过长对植株生长的抑制性。

(4) 长期连栽杨树土壤产生显著的自毒效应, 建议人工杨树林连栽30年后应改变土地利用方式。