生态学报  2015, Vol. 35 Issue (9): 3052-3059

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阴环, 李晓晨
YIN Huan, LI Xiaochen
基于线粒体DNA序列的秦岭地区淡足青步甲种群遗传结构分析
Population genetic structure of the ground beetle Chlaenius pallipes from the Tsinling Mountains based on mitochondrial DNA analysis
生态学报, 2015, 35(9): 3052-3059
Acta Ecologica Sinica, 2015, 35(9): 3052-3059
http://dx.doi.org/10.5846/stxb201311262821

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收稿日期：2013-11-26
修订日期：2014-07-29
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阴环, 李晓晨. 基于线粒体DNA序列的秦岭地区淡足青步甲种群遗传结构分析[J]. 生态学报, 2015, 35(9): 3052-3059.
YIN Huan, LI Xiaochen. Population genetic structure of the ground beetle Chlaenius pallipes from the Tsinling Mountains based on mitochondrial DNA analysis[J]. Acta Ecologica Sinica, 2015, 35(9): 3052-3059.
基于线粒体DNA序列的秦岭地区淡足青步甲种群遗传结构分析
阴环1, 李晓晨2     
1. 山西师范大学生命科学学院, 临汾 041004;
2. 陕西师范大学生命科学学院, 西安 710062
收稿日期:2013-11-26; 修订日期：2014-07-29;
基金项目：山西省青年科技研究基金项目(2012021026-1).
*通讯作者Corresponding author.E-mail: xiaochen@snnu.edu.cn
摘要：淡足青步甲Chlaenius pallipes是一类重要的天敌昆虫。为了揭示秦岭地区淡足青步甲的种群遗传分化和种群历史动态,对13个地理种群151个个体的线粒体Cox1-tRNALeu-Cox2片段DNA序列进行了分析。序列比对后的全长为1 602 bp,共检测到57个多态性位点,定义65个单倍型,其中48个为居群内特有单倍型,17个为居群间共享单倍型。单倍型多样性指数Hd 为0.972,核苷酸多样性指数Pi为 0.0025。该种群遗传分化明显,但AMOVA分析结果表明变异主要来源于种群内,占变异总量的92.10%。SAMOVA和PERMUT分析结果均表明秦岭地区的淡足青步甲种群不存在明显的谱系地理结构。结合中性检验、错配分布和BSP分析结果表明该物种发生过种群扩张,且扩张时间大致在0.100-0.025 Ma之间。
关键词： 淡足青步甲    线粒体DNA    种群结构    数量扩张    秦岭    
Population genetic structure of the ground beetle Chlaenius pallipes from the Tsinling Mountains based on mitochondrial DNA analysis
YIN Huan1, LI Xiaochen2     
1. College of Life Sciences, Shanxi Normal University, Linfen 041004, China;
2. College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi'an 710062, China
Abstract:The ground beetle, Chlaenius pallipes, belonging to the genus Chlaeniu (Coleoptera: Carabidae), is widely distributed in East Asia and overwinters as adults. It is highly abundant in northern China and plays an important role in agriculture and forest pest control. To understand the population genetic differentiation and demographic history of C. pallipes from the Tsinling Mountains, a 1,602 bp fragment of mitochondrial DNA (Cox1-tRNALeu-Cox2) was sequenced for 151 individuals from 13 geographical populations from Gansu, Shaanxi, and Henan provinces. Fifty-seven polymorphic sites were identified, of which 45 are parsimony informative, 11 singleton variable sites, and a 1 bp insertion. These polymorphic sites defined 65 haplotypes, among which 17 were common and 48 were private with relatively lower frequencies. The haplotype diversity (Hd= 0.972) was hight but the nucleotide diversity was low (Pi= 0.0025). The topologies of the phylogenetic trees obtained based on maximum likelihood (ML) and Bayesian inference were similar. Both ML tree and Bayesian inference tree revealed two clades (a and b) from node d on the trees. In the haplotype network, a five median vector was employed and several loops were constructed and"star phylogeny"patterns were present. Analysis of molecular variance (AMOVA) suggested that most of the variation was due to within-population differences (92.10%), while differences among populations only contributed 7.90% of the total. The among-population FST value was 0.07897 (P <0.01). Consequently, we conclude that there is obvious genetic differentiation in the C. pallipes populations we investigated. For the spatial analysis of molecular variance (SAMOVA), increasing K values from 2 to 12 were selected; the FCT values were fairly low and fluctuated. Thus, the SAMOVA tests failed to reveal any meaningful phylogeographic structure. Furthermore, the results of the PERMUT analysis did not suggest any phylogeographic structure of the populations sampled based on the mtDNA haplotype data, as total NST(0.114) was not significantly higher than GST(0.101; P > 0.05). The results of the neutrality tests on the total indicated that both the Tajima's D and Fu's FS were negative values, and the tests for the values are highly significant (P <0.01), suggesting demographic expansion. Mismatch distribution analysis revealed a unimodal frequency distribution of pairwise difference in the total population and in each haplogroup. Both the neutrality tests and mismatch distribution analysis suggested that this species has undergone a demographic expansion. Furthermore,we used the Bayesian Skyline Plot (BSP) approach to estimated the demographic history of C. pallipes under BEAST 1.4.7. The demographic expansion time was identified as being between 0.100 Ma to 0.025 Ma. We found evidence of constant population size before the end of the Last Glacial Maximum (LGM, between 0.020 and 0.018 Ma) developed in the Tsinling Mountains. Consequently, we suggest that LGM had little effect on the demographic dynamics of C. pallipes.
Key words: Chlaenius pallipes    mitochondrial DNA    Population genetic structure    demography expansion    Tsinling Mountains    

秦岭位于我国中部，在动物地理区划上地处东洋界和古北界的分界[1]，动物区系组成特殊，同时兼具两大区系的物种组成[1, 2]，具有较高的动、植物多样性[3, 4]。秦岭地区经历过第四纪冰期-间冰期的反复[5, 6]，这一气候事件往往在物种遗传变异的分布上留下痕迹[7, 8, 9, 10, 11]。目前利用谱系地理学方法来研究物种遗传多样性的空间分布模式，探讨景观特征对物种的空间分布的影响变得更为广泛[7]。通常，在一个地形多样的小区域内广泛采样，并选用进化速率适当的基因作为分子标记，研究结果可以揭示整个景观内地形对遗传多样性和遗传连续性的影响[12]。在秦岭地区开展动、植物遗传多样性状况研究，对于揭示历史环境变化对动、植物分布格局的影响，对未来开展物种资源保护具有指导意义。

淡足青步甲(Chlaenius pallipes Gebler,1823)隶属步甲科Carabidae，青步甲属Chlaenius，以成虫越冬，在我国北方常大量发生。成虫可迁飞，广泛分布于东亚地区[13]，是一类值得保护利用的天敌昆虫。目前对于该种的相关研究主要集中于区系[14]和生物学特性方面[15, 16]，尚无有关遗传学方面的报道。本研究为揭示淡足青步甲种群遗传分化和种群数量动态历史，选用进化速率适中，且被广泛应用于步甲种内遗传分化和系统发育研究中的线粒体Cox1-tRNALeu-Cox2基因片段[17, 18, 19, 20]作为分子标记，对采自于秦岭地区13个地理种群的151个体进行了测序分析。

1 材料与方法 1.1 样品来源

本研究所用样品取自2009—2011年采集于秦岭地区13个地理种群的151头淡足青步甲成虫标本，标本相关采集地信息、所采数量详见图 1和表 1。所有标本浸泡于无水乙醇中于-20 ℃保存备用。

图 1 采样点分布图 Fig.1 Locations of sampled populations
图选项
表 1 淡足青步甲采集地信息、样本量和单倍型分布 Table 1 Sampling locations,sample size,and haplotypes of C. pallipes
采样点 Sampling location代号 Code样本量 Sample number纬度/(°) Latitude(N)经度/(°) Longitude(E)单倍型(个体数) Haplotypes (number of individuals)PiHd
表中出现的采样点代号与图 1对应；Pi，核苷酸多样性；Hd，单倍型多样性；加粗体为居群独有单倍型
甘肃临夏县LX635.49102.99T4(1)、T13(2)、T23(1)、T38(1)、T55(1)0.00220.942
甘肃漳县ZJ2534.81104.15T1(2)、T7(1)、T14(1)、T20(2)、T22(1)、T24(4)、T25(1)、T39(1)、T40(1)、T41(1)、T43(1)、T45(1)、T48(3)、T55(1)、T62(2)、T63(1)、T64(1)0.00280.960
甘肃西和县XH133.87105.16T46(1)N.A.N.A.
甘肃岷县NH334.46104.23T45(1)、T54(2)0.00040.667
甘肃迭部县DB2034.06103.32T5(1)、T8(2)、T11(1)、T25(1)、T26(1)、T28(8)、T29(2)、T30(1)、T58(2)、T59(1)0.00220.837
甘肃舟曲县ZQ333.69104.49T21(2)、T27(1)0.00040.667
甘肃两当县LDY533.93106.42T5(1)、T8(1)、T25(1)、T47(1)、T64(1)0.00301.0
陕西略阳县LYX533.52105.91T6(2)、T8(1)、T56(1)、T57(1)0.00330.900
陕西宁陕县NSX433.55108.55T9(1)、T11(1)、T21(1)、T53(1)0.00211.0
陕西西安CA1634.15108.90T1(1)、T10(1)、T12(1)、T37(1)、T47(2)、T49(3)、T52(4)、T55(1)、T60(2)0.00220.908
陕西洛南LN1934.08110.48T1(4)、T3(1)、T19(1)、T31(2)、T32(1)、T34(1)、T42(2)、T45(2)、T49(2)、T50(1)、T51(1)、T60(1)0.00220.942
河南卢氏县LS3134.25111.01T1(8)、T2(2)、T3(1)、T17(1)、T31(1)、T33(3)、T34(3)、T36(1)、T42(1)、T44(1)、T45(4)、T60(1)、T61(1)、T64(2)、T65(1)0.00200.910
河南栾川县LC1333.82111.46T1(3)、T15(1)、T16(1)、T18(1)、T21(2)、T35(2)、T49(3)0.00260.897
总计15165haplotypes in total0.00250.972
表选项
1.2 DNA提取、PCR扩增和测序

取步甲的翅下肌肉少许置入1.5 mL的EP管中，在管中加入适量SDS裂解液之后，进行充分研磨匀浆，然后加入蛋白酶K (与SDS体积比为49 ∶ 1)，50 ℃水浴过夜，采用标准的苯酚-氯仿抽提法进行抽提之后，用4 ℃异丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤，然后倒置于无菌超净工作台干燥，最后溶解于20—30 μL无菌ddH2O中，-20 ℃保存备用。DNA检测采用1%琼脂糖凝胶电泳检测法。

参考Emerson等[18]上游引物序列为：C1-J-2092 5′AGTTTTAGCAGGAGCAATTACTAT3′；下游引物为：TK-N-3782 5′GAGACCATTACTTGCTTTCAGTCATCT3′(上海生工生物公司合成)。每一样品的扩增体系为25 μL，反应体系为10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP2.0 μL，10 mol/μL引物各1.0 μL，约50 ng/μL模板DNA 1.0 μL，TaqDNA聚合酶1.25 U，去离子水补充至25 μL。扩增条件为：94 ℃预变性2 min后，按以下参数进行40个循环: 94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，最后一个循环之后在72 ℃再延伸10 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后送往上海生工生物公司进行纯化、回收和正反链双向测序。测序试剂为BigDye Terminator v3.1，测序仪器为ABI-PRISM3730全自动DNA测序仪。

图中采样点代号对应的种群地理信息见表 1

1.3 DNA序列分析

利用ClustalX1.83[21]进行序列比对，并用BioEdit5.0.6 (http://iubio.bio.indiana.edu/molbio/seqpup/) 软件进行手工矫正和剪切。利用DnaSP4.10[22]软件统计单倍型多样性和核苷酸多样性的分布特征。单倍型系统发育分析采用PAUP×4.0[23]构建最大似然法(ML)树，并利用MrBayes3.0[24]软件构建贝叶斯(Bayesian)树。选用采自于秦岭地区的脊青步甲(C.costiger)的两个个体(登录号：JN644139-JN644140)作为外群。运行ModelTest[25]软件选择最优替换模型，最终选择了GTR+I+G模型。ML树各节点的支持率根据各单倍型bootstrap 1 000次重复抽样后获得；对 MCMC 变量运行4 条马尔科夫链，以随机树为起始树，共运行125万代，每100代进行1次抽样，似然值用Tracer v.1.5[26]观察，去掉似然值不稳定的树作为burn-in值，最终去掉3125棵树。根据剩余的样本构建一致树，将所得结果进行统计，获得系统树的支系结构以及各支系的后验概率。同时，利用Network4.5.0.2[27]软件通过Median-Joining模型[28]构建了所有单倍型的网状支系图。其中，空位处理为第五形状，对于多个碱基的插入、缺失或突变都被认为是通过一步突变形成。

应用Arlequin3.11[29]软件进行分子变异分析(AMOVA)、中性检验和错配分布分析。错配分布分析模型假设为快速扩张模型，模型的有效性采用离差平方和(SSD)和Harpending′s raggedness index(R)进行评估，以上所有参数通过1000次重复抽样获得。采用SAMOVA1.0[30]进行单倍型空间遗传结构分析。并根据不同的组数(K值)计算相应的FCT值。在本次研究中K值分别为2到12的整数，且运算进行1 000次置换检验，同时，采用PERMUT[31, 32]软件估测步甲种群是否具有谱系地理结构并统计种群总的遗传多样性指数(HT)和居群内平均遗传多样性指数(HS)。

利用BEAST 1.4.7[33]进行了Bayesian Skyline Plot (BSP)分析[34]，选用了GTR+I+G模型，Number of Gamma Categories设置为4，采用逻辑松散分子钟(Uncorrelated Lognormal)，组数为15(group=15)，马尔科夫链(MCMC)的长度为250 000 000，抽样频率为1 000。突变率采用Andújar等[35]在GTR+I+G模型下得到的步甲线粒体DNA碱基对平均替换率2.68%/Ma。

2 结果与分析 2.1 mtDNA遗传多样性和系统发育

共获得了13个居群151个成虫个体标记序列，该序列长1 602 bp，其中包括882 bp 的mtCoI基因、658 bp的mtCoII基因和62 bp的tRNALeu间隔区。检测到57个多态性位点，包括45个简约信息位点、11个单变异位点和发生在tRNALeu序列上的一个碱基插入位点。共定义65个单倍型，分别编号为T1、T2、…、T65。所涉及的单倍型已上交GenBank数据库保存，序列号为JN644074-JN644138。所有单倍型中有48个(73.85%)是出现频率较低的居群内特有单倍型，17个(26.15%)是居群间共享单倍型(表 1)。种群单倍型多样性指数(Hd)较高为0.972，而核苷酸多样性指数(Pi)为0.0025。PERMUTE统计得到种群总的遗传多样性指数(HT= 0.985)和居群内平均遗传多样性指数(HS= 0.885)都很高。

构建的ML树与Bayesian树具有极为相似的分支(图 2和图 3)，结果显示单倍型在节点d处明显分化出两支(a支和b支)，其它单倍型位于进化树的根部，被认为是分化较早的单倍型。通过自动引用5个中间载体(mv1-5)，Network软件构建了单倍型网状支系图(图 4)。网状支系图基本呈星状分布。

图 2 基于淡足青步甲mtDNA 65个单倍型构建的ML树 Fig.2 Maximum likelihood tree of 65 mtDNA haplotypes of C. pallipes
图选项
图 3 基于淡足青步甲mtDNA 65个单倍型构建的Bayesian树 Fig.3 Bayesian inference tree of 65 mtDNA haplotypes of C. pallipes
图选项
图 4 淡足青步甲mtDNA 65个单倍型的网状支系图 Fig.4 Network of 65 mtDNA haplotypes of C. pallipes 图中每一个圆代表一个单倍型，圆大小与单倍型频率呈正比
图选项
2.2 遗传结构和谱系地理学分析

AMOVA结果显示种群变异主要来源于种群内，占到总变异量的92.10%，种群间的变异量仅为7.90%(表 2)。统计得到的遗传分化指数FST在种群间为0.07897，经置换检验达到极显著水平(P ＜0.01)，认为淡足青步甲种群遗传分化明显。SAMOVA检验结果显示估算的FCT值在K=2到K=12的设定中呈平稳波动状态，没有明显的增大。因此通过SAMOVA检验没有对淡足青步甲种群找到合适的分组方法，表明该种群不存在明显的谱系地理结构。同时，PERMUT分析得到的种群遗传分化指数NST和GST的值分别为0.114和0.101，NST值没有显著地大于GST值(P > 0.05)，参考Pons 和 Petit[32] 认为PERMUT分析结果与SAMOVA检验结果一致。

表 2 淡足青步甲的AMOVA 结果 Table 2 Results of analysis of molecular variance of C. pallipes
变异来源 Source of variationdf方差平方和 Sum of squares变异组成 Variance componentes变异百分比 Percentage of variation/%FST
** P < 0.01
种群间Among population1243.380.16Va7.900.07897**
种群内Within population138256.901.86Vb92.10
总Total150300.282.02
表选项
2.3 种群数量动态历史

中性检验结果表明，步甲总种群Fu′s FS 指数值和Tajima′s D指数值分别为-25.7459和-1.8572，均达到极显著性负值(P＜0.01)。经检验，离差平方和(SSD)和Harpending′s raggedness index(R)指数均没有达到显著性水平(P>0.05)，表明该物种经历过种群快速扩张。错配分布分析结果在总种群显示出单峰分布(图 5)，同样表明该物种经历过种群扩张。BSP分析结果表明秦岭地区淡足青步甲种群扩张时间大致发生在0.1— 0.025 Ma，之后种群数量基本保持平稳，但在0.002 Ma开始出现种群数量明显下降的趋势。

图 5 淡足青步甲种群的错配分布图 Fig.5 Mismatch distribution analysis for C. pallipes population
图选项
图 6 淡足青步甲种群的BSP分布图 Fig.6 Bayesian skyline plot of C. pallipes population
图选项
3 讨论

与同域分布的耶屁步甲Pheropsophus jessoensis[36]和赤胸梳爪步甲Dolichus halensis(Schaller)[37]比较，淡足青步甲种群具有比较高的HT、Hs和Hd值，但核苷酸多样性指数(Pi)值相对较低(P. jessoensis：HT = 0.960，Hs = 0.880，Hd=0.963，Pi = 0.0037；D. halensis：HT=0705，Hs=0.612，Hd=0.769，Pi= 0.0033；淡足青步甲：HT= 0.985，Hs=0.885，Hd=0.972，Pi=0.0025)。特有单倍型比例高达73.85%，造成淡足青步甲具有高的Hd值，但这些单倍型往往出现频率低，且分布范围狭窄。高的Hd值伴随着低的Pi值，说明该种群可能经历过“瓶颈效应”，之后伴随着快速种群增长的历史事件，但扩张历史较短，核苷酸变异积累不充分[7]。Avise[7]和Hewitt[10]则认为遗传分化较高的类群，种内往往有多个特有单倍型存在，这一结果可能是由于气候导致的居群反复收缩与扩张所致。ML和Bayesian系统发育树树形成的a枝和b枝所包含的单倍型极为相似，但两支均没有与地理分布建立关联性。一个“星状系统发育(star phylogeny)”往往代表着一个经历“种群瓶颈”之后扩张的种群[38]。构建的网状支系图基本呈星状分布说明该种群经历过种群扩张。

Avise认为共域分布的近缘物种往往具有共同的谱系地理模式[7]。AMOVA分析结果表明淡足青步甲遗传分化明显，但绝大多数的遗传变异来自于居群内，占总变异量比例高达92.10%，而居群间遗传变异所占的比例小。此外，SAMOVA分析和PERMUTE分析结果一致表明秦岭地区的淡足青步甲种群不存在明显的谱系地理结构，在该地区分布的P. jessoensis种群和D. halensis种群同样具有这一遗传结构特征[36, 37]。P. jessoensis成虫不善飞翔，而D. halensis和淡足青步甲个体小，不善于进行远距离迁飞，理论上讲，这三种步甲不但受限于自身的扩散能力，而且受到山脉形成的天然屏障的阻隔，种群间的基因交流不频繁，从而会导致种群间产生遗传分化。但研究发现这三种步甲种群的遗传分化主要体现于种群内，种群间并没有形成明显的谱系地理结构。自然因素(比如风力)和人为因素都可能促进种群间的基因交流，降低遗传分化程度。同时，秦岭地区在第四纪经历了不止一次冰期[5]，冰期后，继“奠基者效应”之后的往往是种群扩张。冰期—间冰期反复出现，往往会导致物种不止一次的扩张，增加了基因交流的可能性。秦岭地区山体宽大，沟壑相通，山脉并没有为步甲的扩散提供有效屏障。

Brower[39]提出的昆虫线粒体DNA的平均碱基对替换率为2.3%/Ma曾被广泛采用(包括步甲在内)[19, 20]。随后从采用地质事件作为分子钟估算物种支系分歧时间的相关报道中发现，分子标记的替换饱和常因采用不同的替换模型拟合结果存在差异[35, 40]。Andújar等[35]在联合多个线粒体基因片段(包括Cox1在内)作为DNA分子标记，选用GTR+I+G模型，得出步甲平均碱基对替换率为2.68%/Ma。本文运行ModelTest软件选择的最优替换模型是GTR+I+G模型，因此参考Andújar等人的研究结果，以平均碱基对替换率为2.68%/Ma作为 BSP分析的分子钟校正时间标准，结果显示秦岭地区分布的淡足青步甲在0.100—0.025 Ma之间发生过种群扩张，之后种群数量基本保持平稳，但在0.002 Ma开始出现种群数量明显下降的趋势。秦岭在第四纪经历了四次冰期，晚更新世的玉皇冰期是第四纪古气候变化最剧烈的一次。冰川规模有大变小，分布位置越来越高，尤其是发生于0.07—0.01 Ma之间的末次冰期仅作用于太白山顶部[5, 41]。BSP研究结果表明在末次冰期，包括发生于0.021—0.018 Ma的末次盛冰期(LGM)期间，淡足青步甲种群大小没有呈现出下降的趋势。因此，认为LGM对秦岭地区的淡足青步甲种群影响不大，从0.002 Ma开始出现的种群数量下降现象很可能是人为因素所致。

4 结论

通过mtDNA Cox1-tRNALeu-Cox2基因片段的测定与分析，研究结果表明：淡足青步甲种群遗传多样性高，遗传分化明显，但没有形成明显的谱系地理结构。该种群经历过扩张，时间发生在0.100—0.025 Ma之间，认为第四纪冰期的反复、秦岭特殊复杂的地貌和人为因素是造成该物种目前分布格局的主要因素。

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