土壤微生物在果园生态系统中的作用不可忽视，决定和推动着果园生态系统的物质循环和能量流动^{[1, 2]}。渭北黄土高塬果区是我国重要的优质苹果种植区，自20世纪80年代开始苹果种植以来，果园种植面积逐年扩大，果园已成为本区主要的农用地类型。果园种植方式具有结构相对单一、长期定向施肥、频繁管理干预和“双高”(高投入和高收获)生产等特点，致使不同龄果园间土壤肥力和质量存在差异，形成了不同的土壤微生物生境条件，从而导致不同龄果园间土壤微生物种类组成、数量水平和空间分布状况的差异。土壤微生物差异又对果园土壤理化性状及土壤肥力的维持与改善产生反馈作用^[3]，影响果园产量和果实品质。

土壤微生物与果园连作障碍的关系也是退化果园改造需要重点关注的问题。以苹果为寄主的微生物经过多年繁衍和积累，如细菌、真菌、线虫和昆虫等会残留于土壤或植物残体中^[4]。Slykhuis^[5]从51个苹果园土壤中分离出77种真菌和26种细菌，发现其中部分微生物会抑制苹果树的生长。苹果连作时根系线虫会增加，而线虫会破坏果树根系，如杨兴洪等^[6]发现草地腐线虫对苹果忌地起着重要作用。

因此，从维系果业的可持续发展、防止土壤质量退化以及退化果园改造等目标出发，需要掌握在长期果园种植条件下土壤微生物变化动态和趋势。本研究通过对渭北旱塬王东沟流域不同龄果园土壤微生物特征的调查，探索不同龄果园间土壤微生物的数量水平和空间分布及其变化特征，以期为该地区的果园土壤质量诊断提供参考，为果园土壤生态修复和果业可持续发展提供依据。

研究区位于渭北旱塬王东沟试区(107°40′30″—107°42′30″ E,35°12′16″—35°16′00″ N)，总面积8.3 km²，主要地形单元为塬面和沟壑。年均降水量为584 mm，年均温9. 1 ℃，无霜期171 d，≥10 ℃积温3029 ℃，属暖温带半湿润大陆性气候，地带性土壤类型为粘黑垆土，母质为深厚的中壤质马兰黄土。区内水土流失严重，全流域仅塬面尚保存有较完整的黑垆土剖面，梁顶和梁坡等梁状地类的粘化层侵蚀殆尽，已无明显剖面发育，称为黄墡土。自20世纪80年代初部分农田改建苹果园后，果园面积不断扩大，果业的规模效益也逐步显现，更促进了果园面积的继续扩张，流域现已形成了以果业为主的农、果二元型种植结构。

塬面分别选取品种(富士)相同、种植密度(3 m×4 m)一致、管理措施相近的5、10、15、20龄果园各3块为样地，对应于果园的幼龄期、初果期、盛果期和衰老期。除20龄果园分布较远外(与邻近样地果园相距约2 km)，其余果园集中在塬面5 km²范围内。本区果园农家肥施用量较少，而化肥以根冠外围沟施为主。测量各样地内全部果树胸径，取最接近胸径四分位数的3个分割点位置(也即第25、50、75百分位数)的果树为样树。以样树为中心，沿树干半径方向1.0、1.5、2.0 m处设置取土点^[7]，采用Ф=9 cm土钻按10 cm分层取土，取样深度30 cm。农田对照(Control Check，CK)选取塬面冬小麦地，对角线设置采样点，3重复。采样时间为2013年5月下旬(苹果花期)。

用手选法拣去土样中肉眼可辩的根茬、石砾、植物根系和碎屑，再分成两份，其中一份过2 mm筛，装入无菌自封袋中，冰盒中保存及时送回实验室用于微生物培养，另一份土壤样品经风干、研磨、过筛处理备土壤养分测定。

土壤微生物数量用稀释平板计数法，称取土样10.0 g，置于盛有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，振荡30 min，静置数分钟，取1 mL土壤悬液于装有9 mL无菌水的试管中，充分混匀，再取1 mL土壤悬液于装有9 mL无菌水的试管中，充分混匀，反复稀释5次。然后吸取不同稀释度的菌悬液各0.1 mL至培养基已凝固的培养皿中，用刮产涂布均匀。将接种后的培养皿倒置放入温箱中培养，细菌放入37 ℃温箱中培养2—3 d，放线菌放入28 ℃温箱中培养3—5 d，真菌则放入25 ℃温箱中培养3—5 d，测定时设3个重复。细菌用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，放线菌用改良高氏1号培养基，真菌用马丁氏孟加拉红琼脂培养基^{[8, 9]}。本研究中土壤微生物量仅为真菌、细菌和放线菌3种可培养微生物类群的总量。

称取经预处理的干土样0.5 g，加H₂O₂和浓硫酸，消化炉消解，定容至100 mL，取上清液用连续流动分析仪(Flowsys Ⅲ)的总氮(TN)、总磷(TP)模块分别测定。土壤有机碳(SOC)用LiquiTOCⅡ(Elementar Analysensysteme GmbH，德国)测定^[7]。

经Excel整理后，采用SPSS17.0统计软件包进行统计分析，用Origin7.5软件绘图。

塬面5、10、15和20龄果园土壤真菌数量分别为13×10⁴、22×10⁴、30×10⁴、35×10⁴ cfu/g，表现出随着树龄增加而增多，各龄果园间差异显著(P＜0.05)，15龄果园与对照麦地的真菌数量水平接近(图1)；与对照麦地相比，果园土壤放线菌数量均偏低，特别是幼龄期果园(5龄)和衰老期果园(20龄)最低，分别为7.1×10⁴、7.4×10⁴ cfu/g，而初果期(10龄)和盛果期(15龄)果园相对偏高，分别为8.6×10⁴、8.9×10⁴ cfu/g，但仍然低于对照塬面冬小麦地的9.5×10⁴ cfu/g，5龄和15龄间差异显著(图1)；与放线菌类似，塬面幼龄期果园(5龄)和衰老期果园(20龄)的土壤细菌数量最低，分别为167×10⁴、151×10⁴ cfu/g，而初果期(10龄)和盛果期(20龄)果园相对偏高，分别为269×10⁴、265×10⁴ cfu/g，与塬面冬小麦地对照203×10⁴ cfu/g相比，10龄和15龄果园偏高，而5龄和20龄偏低，且均达到显著水平(图1)。果园土壤三大类微生物数量组成以细菌类为主，其次是真菌，放线菌最少，不同龄果园三大类微生物总量变化趋势取决细菌类变化，这与田稼等^[10]的研究结果一致。

图 1 不同龄果园土壤真菌、细菌和放线菌数量 Fig.1 Population of bacteria, actinomycete, fungi and total microorganisms in soil of different age orchards 注：不同字母表示差异达到5%显著水平，下同。

图选项

在试验研究深度0—30 cm土层范围内，塬面各龄果园(5、10、15、20龄)的土壤真菌、细菌和放线菌的数量均表现为随深度增加而减小的趋势，与对照麦地的土壤真菌、细菌和放线菌数量的垂直分布趋势一致(图2)。土壤真菌在相同土层深度上一般有随果园年限的增加而增大的趋势，在0—10 cm土层中，5、10、15龄果园分别为18×10⁴、24×10⁴、33×10⁴ cfu/g及对照麦地40×10⁴ cfu/g间差异显著，而20龄果园39×10⁴ cfu/g与15龄和对照麦地间差异未达显著水平；在10—20 cm土层中幼龄期果园(5龄)、初果期果园(10龄)分别为12×10⁴、21×10⁴ cfu/g和大龄果园(15龄和20龄分别为30×10⁴、34×10⁴ cfu/g)间差异显著，15龄和20龄果园间及其与对照麦地(30×10⁴ cfu/g)间均无显著差异；20—30 cm土层中，5龄果园为8×10⁴ cfu/g，显著低于其他各龄果园，20龄果园为31×10⁴ cfu/g则显著高于其他各龄果园，10龄和15龄果园分别为22×10⁴、26×10⁴ cfu/g，与对照麦地19×10⁴ cfu/g接近(图2)。与真菌的垂直分布不同，土壤细菌在相同土层深度上不同龄果园间并未随果园年限的同向递变，而是有单峰型变化的趋势，以10龄和15龄果园较高水平，5龄和20龄果园较低水平，对照麦地介于两水平之间(图2)。在0—10 cm土层中，幼龄期果园(5龄)土壤放线菌为9.4×10⁴ cfu/g，与其它龄果园及对照麦地存在显著差异，在10—20 cm和20—30 cm土层上龄间差异不明显，土壤放线菌整体表现出龄间差异随深度增加而趋于减小(图2)。3种主要土壤微生物总量变化趋势因细菌数量组成优势而表现出与其较类似的垂直分布特征(图2)。

图 2 不同龄果园土壤真菌、细菌和放线菌垂直分布 Fig.2 Vertical distribution characterics of bacterias, actinomycetes, fungus and total microorganisms in soil of different age orchards

图选项

在以树干为中心的径向水平方向上，就种植年限较长的10、15和20龄果园而言，真菌数量在1.5 m采样点处较多，分别为26×10⁴、33×10⁴、37×10⁴ cfu/g，2.0 m处均有所下降，分布为18×10⁴、27×10⁴、35×10⁴ cfu/g，但不同年限果园的降幅有一定差异，其中以10龄果园降幅最大，达31%，15龄和20龄果园降幅逐步减小，分别为18%和5%。处于幼龄期的5龄果园土壤真菌数量在径向水平方向上变化较小；总体看，在水平方向上各龄果园的对应取样点(1.0、1.5、2.0 m)处真菌数量随着种植年限的增大均相应增多(图3)。各龄果园的土壤细菌数量在径向水平方向上1.0 m处采样点均最低，在1.5、2.0 m处相对一致且均高于1.0 m处；总体看，处于盛果期(10龄和15龄)果园水平方向上对应取样点(1.0、1.5、2.0 m)处细菌数量高于幼龄期5龄果园和衰老期20龄果园(图3)。在径向水平方向上幼龄期5龄果园和衰老期20龄果园的放线菌变化较小，而盛果期(10龄和15龄)果园在近树干1.0 m处放线菌数量高于1.5 m和2.0 m处；总体看，不同龄果园放线菌数量的水平分布与土壤细菌变化类似，盛果期果园的放线菌数量多于幼龄期和衰老期果园(图3)。由于果园土壤中3种微生物数量以细菌的绝对量最大，因此土壤生物总量主要取决于细菌数量，其径向水平变化特征也与细菌的水平变化特征相似(图3)。

图 3 不同龄果园土壤真菌、细菌和放线菌水平分布 Fig.3 Horizontal distribution characterics of bacteria, actinomycete, fungi and total microorganisms in soil of different age orchards

图选项

土壤微生物类群划分有多种分类标准，其中较为常用是根据微生物的形态将其分为细菌、放线菌和真菌三大类群。渭北塬区果园土壤三大微生物类群的数量组成(表1)总体上表现为以细菌为主，超过75%，其次为真菌，放线菌最少，这与该区麦地土壤微生物类群数量组成基本接近。随着种植年限的增加，三大微生物类群在数量组成呈现出不同的变化趋势，如真菌数量组成逐步增大，细菌则从5龄到10龄增加，其后下降，而放线菌在5龄和20龄相对较较高(表1)。三大微生物类群数量组成在土层中也有着不同的分布变化特点，放线菌基本表现出随土层加深相对数量减小，除5龄果园外真菌在调查深度内则随土层加深而增加，细菌数量变化与土层关系不明显，但20龄果园在总体降低的同时，还随土层加深而减少(表1)。一般而言，潮湿的环境有利于细菌的生长繁殖，而干旱的土壤环境更有利于真菌的生长发育，干旱环境也适宜放线菌的生长繁殖，但生长相对较慢且(与其他微生物)竞争力不强。在渭北塬区长期种植的果园，土壤均有旱化趋势，这为真菌的生长繁殖提供的较为有利外部环境，而不利于细菌的生长繁殖。因此，在水资源不足的渭北旱塬区，果树耗水量大，土壤水分长期处于负平衡，随着果园种植年限的增加，势必导致真菌相对数量增加和细菌相对数量的减少。

李智卫等^[11]对位于山东半岛不同种植年限苹果园三大类微生物数量研究结果显示随着种植年限的延长，细菌和放线菌的含量降低，真菌的百分含量增高，而常显波等^[12]在该地区研究结果显示不同种植年限苹果园土壤随种植年限的增加真菌增多和放线菌减少。上述山东半岛的试验结果表明土壤细菌的变化与种植年限的关系存在不确定性，而真菌则均随种植年限的增加而增大，这与渭北塬区的试验结果基本一致。两地区土壤放线菌随种植年限的变化不一致，在渭北塬区5龄幼龄期果园和20龄衰老期果园相对较较高，而山东半岛则随年限增加放线菌的含量降低，具有一定程度的区域差异。

研究认为土壤中治病真菌类微生物种类和数量随着连作年限的增加而增加，引起微生物区系的变化，是连作障碍的原因之一。作物连作会使得植物病原真菌富集，加剧植物根部病害的发生，影响作物正常的生长发育^{[13, 14]}。在渭北果区，随着果园面积的逐年扩张，适合果园种植的农用地基本被果园替代，而早期果园正处退化阶段，本区果业的发展面临着老果园的合理改造问题。因此，如何消除土壤真菌增加引起的再植障碍将对本区果业的持续发展至关重要。

土壤微生物一方面对土壤有机质起分解作用，参与碳、氮、磷等元素转化，使有机物质转化成有效养分，是土壤有机质和土壤养分转化与循环的动力，另一方面土壤微生物自身含有一定数量的C、N、P和S，可作为土壤中植物有效养分的储备库，对土壤中的无机营养元素起固持和保蓄作用^[15]。土壤微生物与土壤养分之间存在机理上的相关性，然而土壤微生物数量还受到土壤的理化性质、土壤植被状况以及人类活动等多种因素的综合影响。大量研究也表明不同龄果园间土壤环境存在较大差异^{[16, 17, 18]}。从试验结果来看(表2)，5龄果园土壤总氮在水平方向和垂直方向的变动较大，有沿树干向外，沿表层向下逐步降低的趋势，10龄果园与其它龄果园相比水平方向和垂直方向以偏低为主，而15龄有一定程度的恢复，20龄果园则有所下降，产生上述现象原因可能与当地果园在幼龄期套中豆科作物和三叶草，增加了表层土壤氮，以及果园的环沟施肥有关。果园从5龄经10龄到15龄，其“高氮点”则逐步向外、向下移动，这种现象与果园的环沟施肥有一定关系。总体上(表2)土壤总磷表现为随着种植年限的增加呈现下降的趋势，层间差异则以下层高，表层低为主要特征，这与大部分研究中土壤磷的变化规律相符。果园土壤有机碳的龄间变化主要为10龄和15龄较高，而5龄和20龄偏低，层间差异在表现为表层高于下层(表2)。

土壤C∶N是土壤质量的敏感指标^[19]，低C∶N可以加快微生物分解和氮的矿化速率,而高C∶N对土壤微生物的活动能力有一定的限制作用^[20]。我国苹果园一般土壤氮偏高，而有机碳含量不足，以及管理措施不合理，造成了土壤C∶N失调^{[21, 22]}。关于土壤C∶N比的适宜范围，Aber^[23]和Wardle^[24]认为土壤微生物利用高 C∶N 比的碳源时，其生长受氮素限制，C∶N < 30时微生物生长受碳素的限制，葛顺峰等认为土壤C∶N 比处于21—23之间有利于植株生长和氮素的利用率^[22]。渭北塬区果园土壤C∶N比(表2)相对于上述标准均偏低，这可能与本地偏施氮肥，致土壤氮含量偏高有关，另外果园修剪、清园摘果等果园农艺措施减小园地的枯枝落叶回落，土壤腐殖质含量降低，形成了果园土壤碳量较低的状况。因此，从提高土壤C∶N比要求看，适度减少施氮量，增加土壤有机肥施用量，或者采用秸秆覆盖、幼龄果园作物套种、大龄果园生草等果园农艺管理措施，将有利于本区果园土壤养分环境的改善。

总体来看土壤三大类微生物与总氮的相关性较为密切，不同龄果园中5、15、20龄相关系数均达到显著水平以上，而10龄果园土壤微生物数量与总氮相关性不强(表3)。微生物与土壤有机碳和土壤总磷的相关性较低。幼龄期5龄果园和衰老期20龄果园微生物数量与土壤C∶N相关系数均达在显著水平，而初果期10龄果园和盛果期15龄果园的相关性不强(表3)。不同类群的土壤微生物与土壤C、N、P的相关性具有差异，真菌更易受土壤C、N、P的影响，其次为放线菌(表3)，这也与这两类微生物在数量组成较大，类群稳定性更易受到环境变化的影响所致。总之，土壤微生物三大类群与土壤C、N、P的相关性较为复杂，在总体表现出一定的关联性的同时，也反映出不同果园阶段的差异性，从而表明土壤微生物的数量多少并不仅取决于土壤养分元素，而是果园各个阶段的多种因素综合作用的结果。

(1)塬面果园随着树龄增加，土壤真菌数量也随之增加，各龄果园间差异显著，15龄果园与对照麦地的真菌数量水平接近；果园土壤放线菌数量均偏低；土壤细菌10龄和15龄果园偏高，5龄和20龄偏低。

(2)塬面各龄果园土壤真菌、细菌和放线菌的数量均表现为随深度增加而减小的趋势。土壤真菌在相同土层深度上一般有随果园年限的增加而增大的趋势；土壤细菌在相同土层深度以10龄和15龄果园较高，5龄和20龄果园较低。土壤放线菌整体表现出龄间差异随深度增加而趋于减小。

(3)在水平方向上各龄果园真菌数量随着种植年限的增大均相应增多；在径向水平方向上盛果期果园土壤细菌和放线菌高于幼龄期5龄果园和衰老期20龄果园。

(4)5龄果园土壤总氮有沿树干向外，沿表层向下逐步降低的趋势，果园从5龄经10龄到15龄，其“高氮点”则逐步向外、向下移动。渭北塬区果园土壤C∶N比偏低。