植物化感作用是指植物或微生物产生并由枝、茎、叶、根等经挥发、淋溶、分泌、分解等途径向环境释放某些化学物质,从而影响周围植物及本身生长和发育的化学生态现象^[1]。化感作用是植物中普遍存在的一种化学生态机制,是其提高自身生存竞争力的化学手段,在自然生态系统和农业生态系统中起着重要作用^[2]。近年来,化感作用在农林复合生产实践,特别是混交林营造、人工林培育和林农间作中越来越受到重视^{[3, 4]}。

核桃(Juglans regia)又名胡桃,属胡桃科(Juglandaceae)核桃属(Juglans)植物,在我国栽培历史悠久,分布广泛,资源丰富^[5]。据报导核桃是典型的化感植物,其枝叶、青皮和根分泌的胡桃醌(5-羟基苯醌)对周围植物生长和发育有毒害作用^{[6, 7]}。核桃化感作用的研究一直是生态学研究的热点,国内外许多学者对核桃的化感成分进行了鉴定^{[8, 9]},并对核桃叶、青皮等水浸提液^{[10, 11, 12]}、有机溶剂浸提液^[13]的化感效应进行了研究。但是,不同生境条件下核桃凋落物次生代谢物状况,其化感作用是否有差异,目前尚未见报道。

我国秦巴山区大巴山南坡气候温和、四季分明,适宜于核桃生长,其伴生植物较多；而川西高山峡谷区自然条件相对恶劣,旱季、低温持续时间长,环境胁迫频繁,核桃多为该生态系统的优势树种。李国和等^[14]分析了生态因子与核桃脂肪性状和脂肪酸组成的典型相关性,陈良华等^[15]和Xu等^[16]等通过分子标记,对秦巴山区大巴山南坡和川西高山峡谷区核桃遗传多样性的差异进行了研究,表明两地不同的生境条件对核桃营养物质和遗传多样性产生了不同的影响,核桃器官尤其是以叶片为主的凋落物中的次生代谢物的组成和含量可能也由此产生差异,其对邻体植物产生的化感作用可能也存在差异。本研究拟采用接近自然状态的方法,通过盆栽试验,在分别在混有秦巴山区大巴山南坡和川西高山峡谷区两地核桃凋落叶的土壤中种植小白菜,探讨核桃凋落叶在土壤中分解过程中对受体植物的作用及其机理,以及不同生境条件对核桃凋落叶次生代谢物质和化感效应的可能产生的影响,为核桃与农作物复合种植以及核桃凋落叶的管理提供理论依据和参考。

选择川西高山峡谷区和秦巴山区大巴山南坡20年生核桃凋落叶作为供体。川西高山峡谷区干旱河谷海拔2600 m以下,年平均气温＜10 ℃,年降水量500—800 mm,旱雨季分明,旱季长达7个月以上,年日照2000—2600 h。秦巴山区大巴山南坡属亚热带季风气候,年平均气温为14.9 ℃—18.4 ℃,日照为1400—1600 h,无霜期223—290 d,年降水量为1000—1200 mm,气候温和,四季分明。2012年9月底在核桃林下搜集近期自然凋落到地面上干净的、未分解的核桃叶,取回后风干剪成1 cm²左右的小块,充分混匀,贮存备用。

选择四川各地广泛栽植的园地植物四季小白菜(Brassica chinensis),该作物常种植于核桃、板栗(Castanea mollissima)和柑橘(Citrus reticulata)等经济林树种邻近或树下。播种前,选择饱满、大小均一的种粒,晒种1 d,0.1% HgCl₂消毒,待用。

采用统一规格的聚乙烯塑料盆(口径29 cm、盆高25 cm)。土壤选择农耕土(沙壤,pH值7.85,有机质24.382 g/kg,全氮0.662 g/kg,全磷0.665 g/kg,全钾5.571 g/kg,速效磷14.726 mg/kg,速效钾16.146 mg/kg),用1 cm筛除去大块石砾和草根。

分别将两地凋落叶干样粉碎,以酒精为浸提剂,用超声波清洗仪提取后浓缩得到样品,采用气相色谱-质谱法(GC-MS),通过Agilent Chemstation化学工作站检索Nist标准质谱图库确认化学成分,对匹配指数(Qual)90以上的化合物进行鉴定,并用峰面积计算各组分相对百分含量。

本试验中川西高山峡谷区核桃(以下简称川西核桃)与秦巴山区大巴山南坡核桃(以下简称秦巴核桃)凋落叶处理盆栽试验同步进行,处理方式相同。试验于2012年10月至2013年1月在雅安市四川农业大学教学科研园区进行,采用单因素随机试验设计。根据野外调查,成熟的核桃叶年凋落量约8500 kg/hm²,折算到试验所用盆钵盆口面积上约60 g,故采用60 g/盆作为基本施入量(F2)。由于自然及人为干扰因素,不同地块上核桃凋落叶积累量存在差异,因此另设F1(30 g/盆)、F3(120 g/盆)和F4(180 g/盆)3个凋落叶处理水平,对照不施加凋落叶(F0,0 g/盆)。每处理重复6次。10月18日,分别将各处理凋落叶与8 kg土壤均匀混合装入盆中,适量浇水浸湿表土,每盆均匀点播小白菜种子50粒,覆土1 cm,浇透水。之后,每2 d采用HH2便携式土壤水分测定仪(ML2x,GBR)监测土壤含水量,将土壤体积含水量(SWC)控制在18%左右。待各处理种子全部出芽后间苗1次,首次取样(含匀苗)后保留20株,第2次取样后保留12株,第3次取样后保留8株,最终每盆保留5株。

2012年11月7日、12月2日和2013年1月1日(对应为出苗后20、45 d和 75 d),分别随机抽取各处理小白菜每盆5株,去除根系后称重,测定其地上部分鲜重生物量。同时,于2012年12月2日,采用Li-6400便携式光合测定仪(Li-Cor Inc.,USA),人工控制CO₂浓度400μmol/mol、温度25℃、光照强度1500μmol m^-2 s^-1,测定净光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)、气孔导度(G_s)和胞间CO₂浓度(C_i),重复3次。将测定了光合作用的叶片带回实验室,采用丙酮-乙醇混合液提取法^[17]测定叶片光合色素含量。

采用Williamson和Richardson^[18]的方法计算化感作用敏感指数RI：RI=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T<C)(C为对照值；T为处理值。当RI>0时,表示促进作用；当RI<0时,表示抑制作用。RI 绝对值的大小代表化感作用强度)。

采用 SPSS16.0统计分析软件(SPSS Inc.,USA)进行单因素方差分析(One-way ANOVA),并用Duncan氏新复极差法(SSR法)进行多重比较。

GC-MS检测显示,秦巴核桃凋落叶中主要的有机小分子物质(相对含量﹥1%)有12种,相对含量总和为51.46%,其中萜类物质4种,相对含量23.35%,酚类物质2种,相对含量5.58%,甾族化合物2种,相对含量9.4%；川西核桃凋落叶中主要的有机小分子物质(相对含量﹥1%)有15种,相对含量总和为56.03%,其中萜类物质5种,相对含量14.42%,酚类物质1种,相对含量3.88%,甾族化合物2种,相对含量11.93%,酮类化合物1种,相对含量1.11%。表明川西核桃体内次生代谢物质的种类和相对含量总和均高于秦巴核桃,化感潜力可能更大(表 1)。

播种后20和45 d,各添加量核桃凋落叶处理下,小白菜地上部分鲜重均显著低于对照(P＜0.05),但两地核桃凋落叶对小白菜生长的影响程度存在差异(图 1)。秦巴核桃凋落叶4种剂量处理在20 d时的RI值分别为-0.669、-0.852、-0.836和-0.901,45 d时的RI值分别为-0.225、-0.694、-0.583和-0.681；川西核桃凋落叶4种剂量处理在20 d时的RI值分别为-0.520、-0.877、-0.917和-0.914,45 d时的RI值分别为-0.394、-0.788、-0.823和-0.878。75 d时,秦巴核桃凋落叶的抑制作用已经相对不明显,其RI值分别为-0.086、-0.089、-0.208和-0.032；而川西核桃凋落叶在F1处理下鲜重相对CK有所增加(RI＞0),其余各处理则表现为抑制作用,RI分别为0.024、-0.532、-0.659、-0.553。表明川西核桃凋落叶对小白菜生物量的抑制作用大于秦巴核桃的影响(图 1)。

图1 不同添加量的两地核桃凋落叶分解对小白菜地上部分鲜重的影响 Fig.1 The aboveground fresh weight of pakchoi as affected by different doses of decomposing walnut leaf litter from QMA and HGWS

图选项

由表 2 可见,秦巴核桃凋落叶分解对小白菜叶片光合色素含量有明显抑制作用,在低量处理(F1)下,其叶绿素总量 (Chl (a+b))、叶绿素a (Chl a)、叶绿素b (Chl b) 和类胡萝卜素 (Car)含量已显著低于CK(P＜0.05),到F2处理后抑制作用更加明显,与CK相比,F2处理的叶片Chl (a+b)、Chla、Chlb和Car分别降低了26.8%、26.4%、28.6%和25.2%,但F2、F3和F4处理彼此差异不显著(P＞0.05)；川西核桃凋落叶各处理水平小白菜叶片的Chl (a+b)、Chl a、Chl b和Car则表现为F1处理与CK差异不显著(P＞0.05),其余剂量处理显著低于CK(P＜0.05),表现出明显抑制作用。F1处理的叶片Chl (a+b)、Chla、Chlb和Car分别相对于CK升高了2.5%、2.5%、2.7%和2.4%,而F4处理的叶片分别相对于CK降低了25.2%、24.8%、26.9%和23.7%。总体来看,两地核桃凋落叶处理均表现为对Chl b 的抑制作用强于对Chl a的抑制作用,总体上在F1、F2和F3处理下,秦巴核桃叶对小白菜光合色素含量的抑制作用强于川西核桃叶,而在F4处理下,秦巴核桃叶对小白菜光合色素含量的抑制作用弱于川西核桃叶。

由表 3可以看出,随着川西核桃凋落叶施入量的增加,各处理小白菜叶片净光合速率P_n、气孔导度G_s和蒸腾速率T_r呈现下降趋势且均表现为抑制作用(RI＜0),其中F4处理抑制作用最强,其P_n、G_s和T_r分别比CK减少了30.4%、30.8%和28.1%,而胞间CO₂浓度C_i则差异不显著(P＞0.05)；秦巴核桃凋落叶在F1处理下对小白菜的P_n、G_s、T_r和C_i均表现为促进作用(RI＞0),在F2、F3和F4处理下对小白菜的C_i仍表现出促进作用,但对其P_n、G_s和T_r表现为抑制作用且与CK差异显著(P＜0.05),F4处理的抑制作用最强,此时小白菜的P_n、G_s和T_r分别比CK减少了18.1%、18.5%和15.6%。相比之下,川西核桃凋落叶分解对小白菜净光合速率和气体交换参数的影响更为明显。

本试验表明,两地核桃凋落叶在分解到20 d和45 d时,各处理剂量下,小白菜的地上部分鲜重均显著低于CK,表现出凋落叶施入量越大抑制作用越强的规律,到 75 d时,可能由于凋落叶分解释放的化感物质减少且不断释放养分,秦巴核桃叶片各处理与CK间差异已经不显著,而川西核桃叶片除F1处理外,其余各处理仍然处于明显的受抑制状态,但相比于20 d和45 d,抑制作用也有一定的减缓。这说明核桃凋落叶分解释放化感物质和产生化感作用具有时间效应和浓度效应。这与核桃根系提取物对白菜(Brassica rapa)^[19],以及巨桉凋落叶分解的化感作用研究结果一致^{[20, 21, 22]}。在本研究中,没有观察到受体生物量在低剂量处理下受到促进,即所谓的低促高抑的现象,与前人利用核桃青皮的水提液^{[10, 11, 12]}、有机溶剂浸提液^[13]以及核桃醌^{[23, 24]}的研究结果不同。造成这种差异的原因可能有两个方面：一是在水浸提过程中,已有大量营养物质从凋落物中浸出,因而在浸提液水培初期,受体幼苗能吸收到较丰富的养料,营养成份对受体生长的促进作用大于化感物质的抑制作用；二是供体器官不同,其所含化感物质的种类和量有差异,可能对不同的受体植物作用时间也不同。

本研究表明,两地核桃凋落叶在分解过程中均抑制了小白菜叶片气孔的开放和蒸腾作用(表 3),特别在F2、F3和F4处理下的G_s较低,气孔限制值较高,因而不利于水分和气体扩散,致使T_r下降,最终导致P_n的降低,这与郁继华等^[25]和吴秀华等^[21]的研究结果一致。Farquhar和Sharkey^[26]的观点则是只有当P_n和G_s、C_i的变化方向相同,同时降低,才能认为主要是气孔因素引起的。本试验中,P_n和G_s受抑制降低,而C_i并未降低,部分处理下甚至表现为有所升高,表明核桃凋落叶在分解中并不主要通过气孔因素来影响小白菜光合作用,可能也通过非气孔因素影响受体的光合反应和光合酶活性^{[27, 28]}。本试验也的确发现,除较低剂量下川西核桃凋落叶处理(F1)以外,其余各水平凋落叶处理的小白菜光合色素含量均受到了抑制。

川西核桃凋落叶分解对小白菜P_n的抑制程度大于秦巴核桃凋落叶,其对小白菜叶片G_s和T_r的抑制作用更是在各处理剂量下均大于秦巴核桃。这表明,小白菜在整个生长过程中受到川西核桃凋落叶分解的化感抑制作用更强,这与其形态指标上的观察结果相吻合。至于川西核桃凋落叶对叶绿素的抑制作用低于秦巴核桃,但对光合的抑制作用又强于秦巴核桃,可能叶绿素含量并不是决定植物光合能力的唯一因素,鲁美娟等^[29]就发现,酸雨并不是通过叶绿素而是通过内在生理生化过程及光的利用来影响刨花楠(Machilus pauhoi)的光合作用,许大全^[30]也指出只有在弱光下,叶绿素含量与光合速率间才具有良好的线性关系,而在饱和光下,光合速率的高低往往与叶绿素含量无关。因此在本试验中,川西核桃凋落叶可能在除叶绿素以外的其他非气孔因素上的作用强于秦巴核桃凋落叶。

本试验从秦巴核桃和川西核桃凋落叶中,共检测出8类21种相对含量＞1%的次生代谢物质,其中,萜类物质7种,脂肪酸4种,甾族化合物3种,酚类2种、酯类2种,醇类1种、酮类1种、烯烃1种。根据Rice^[31]对化感物质的分类,本研究检测出的8类相对含量＞1%的次生代谢物质都具有化感潜力,其中,川西核桃7类,相对含量56.03%；秦巴核桃5类,相对含量51.46%。川西核桃酮类、脂肪酸、烯烃、醇类和甾族化合物的相对含量均高于秦巴核桃,而酚类、萜类、酯类则低于秦巴核桃。

在川西核桃相对含量低于秦巴核桃的次生代谢物质中,最为明显的是角鲨烯(川西核桃相对含量为4.05%,秦巴核桃相对含量为16.30%),但川西核桃凋落叶对受体植物却表现出上述更强的化感效应。可能的原因是：(1)根据Guil-Guerrero^[32]和Kim^[33]的研究,角鲨烯对植物不但没有毒性反而具有一定的益处,如抗氧化和保护细胞的作用,因此,角鲨烯可能并不是核桃凋落叶的主要化感物质；(2)角鲨烯可进一步衍生为谷甾醇^{[32, 33, 34, 35]},而谷甾醇被氧化可变成化感活性较高的谷甾酮^[36]。因此,川西核桃可能由于环境胁迫,叶片中部分角鲨烯衍生为谷甾醇及其他化合物,导致其体内角鲨烯相对含量降低,谷甾醇相对含量增大(川西核桃10.42%＞秦巴核桃7.91%),同时,谷甾醇进一步被氧化为谷甾酮(最终在川西核桃叶中检测出相对含量1.51%的豆甾-4-烯-3-酮(C₂₉H₄₈O))。酚类主要是delta-tocopherol(δ-生育酚),是高等植物的必须营养素之一,具有抗氧化的功能^[37],尚未见其化感作用相关的研究报道；酯类主要是henicosyl formate和Loliolide(黑麦草内酯),具有一定的化感效应^{[38, 39]}。

在两地区核桃凋落叶中,川西核桃相对含量高于秦巴核桃的5类物质中,白菖油萜^[40]、茅苍术醇、β-桉叶醇^[41]、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮^[42]、亚麻油酸^[43]、硬脂酸^[44]、十八醇^[45]、γ-谷甾醇^[46]和豆甾-4-烯-3-酮^[47]经研究都具有一定的化感效应,这些物质可能正是川西核桃凋落叶化感作用强于秦巴核桃凋落叶的物质基础。

环境因子(气候、光、温、水、营养、土壤结构和理化条件等)不同,核桃的生理生化响应可能不同而导致其次生代谢过程和产物的变化^[48],从而影响到核桃的化感作用强弱。川西高山峡谷区气温较低,降水量小,土壤瘠薄,但日照却比秦巴山区大巴山南坡多出1000—1400 h,这些因素可能导致川西核桃叶片积累更多具有较强化感作用的次生物质。在环境胁迫条件下,植物通过物理手段与其它植物竞争有限资源的能力大为降低,其自身的化学的方法就上升为竞争的重要手段^[2]。有研究表明,植物生境对化感作用的表达有显著的影响,植物在干旱、缺肥等环境胁迫条件下生长缓慢、体内次生代谢物质多；一方面,植物可通过释放化感物质的方式抑制周围其它植物的生长,从而提高其对养分、水分等的相对竞争能力；另一方面,有些化感物质(如酚类、酸类物质)有助于植物吸收N、P以及金属离子等营养元素,提高植物的抗逆性^{[49, 50]},从而增加了植物在逆境条件下的相对竞争能力。而在较好的自然条件下,植物生长较快且次生代谢物质较少^{[51, 52]}。另外,控制化感物质的DNA序列和蛋白质表达在两地核桃间可能存在差异。两地核桃经过环境的长期作用,分别适应了当地的自然环境,最终表现出遗传上的差异。李国和等^[14]研究表明,秦巴核桃和川西核桃的脂肪含量差异显著(P<0.05),饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸也存在不同程度的差异；Xu等^[16]运用RAPD、AFLP分子标记,证实了秦巴核桃和川西核桃遗传多样性的差异,川西核桃平均遗传距离GD=0.266,秦巴核桃平均遗传距离GD=0.206,这种遗传性状的差异可能也表现在其体内次生代谢物质上的不同,最终导致其对小白菜的化感效应不同。

综上所述,秦巴山区大巴山南坡和川西高山峡谷区核桃凋落叶在分解过程中抑制了小白菜的光合作用和形态生长。但是,由于生境条件的差异,川西核桃凋落叶次生代谢物质种类和相对含量均高于秦巴核桃,导致川西核桃凋落叶化感效应比秦巴核桃凋落叶更强,持续时间也更长。在开展农林复合种植的生产实践中,应尽量避免较多的核桃凋落叶翻耕进入土壤,同时辅之以合理的水肥管理。同时本研究表明,在凋落叶较少的核桃林下间作小白菜是可行的。