微藻是一种遍布全球水体的低等浮游植物，是水体中原初生产力的主要组成部分，由于富含蛋白质、人体必需氨基酸、高不饱和脂肪酸、色素及多种生物活性物质，而成为现代社会食品、医药、饲料和燃料等的重要来源。目前，世界上商业化生产的微藻主要有螺旋藻(Spirulina)、小球藻(Chlorella)、红球藻(Haematococcus)和杜氏藻(Dunaliella)等^{[1, 2, 3, 4]}。螺旋藻具有增强人体免疫力、抗疲劳、改善消化系统功能等作用，因而作为保健食品和药品被大规模生产^[5]。小球藻含有高达50%的粗蛋白和人体必需氨基酸，既是一种优良的保健品，也被用做珍贵动物的饵料添加剂^[6]。成熟的红球藻孢子中虾青素(Astaxanthin)含量可高达1%—3%，虾青素是一种类胡萝卜素，具有超强的抗氧化活性，可作为保健品和高档化妆品的有效成分，也是三文鱼等珍贵水产品养殖必不可少的饲料添加剂^[7]。杜氏藻含有大量的β-胡萝卜素和甘油，前者是维生素A的前体物质，也是一种天然抗氧化剂，后者是重要的有机化工原料^[8]。

在微藻的培养过程中，无论是室内的研究还是室外的大规模养殖，都需要不断地检测其生长状况，掌握细胞密度和生物质的变化。细胞密度可以通过细胞计数的方法测定^[9]，生物质可以通过称重法测定^{[10, 11]}。由于细胞计数法和称重法操作都比较繁琐、耗时耗力，目前无论在微藻研究的实验室还是生产工厂，都普遍采用一种便捷、省时的方法—利用分光光度计测定藻液光密度(OD)来间接反映细胞密度和生物质干重^{[12, 13]}。光密度法也广泛应用于微生物生长的测定^{[14, 15]}。测定光密度采用的波长依微藻种类的不同而异，主要有500、540、560、680、730 nm和750 nm，甚至对于同一种微藻也使用几种不同的测定波长。不少文献描述微藻的干重或细胞密度与光密度成直线关系：Hsieh和Fan等报道了小球藻的干重与藻液OD值呈直线关系^{[16, 17]}。沈萍萍研究了15种微藻，结果显示在680 nm处细胞密度与藻液OD值呈直线关系^[18]。黄美玲的报道显示，在OD₆₈₀＜0.5时，小球藻的干重与藻液OD值呈直线关系，细胞密度与OD也呈直线关系^[13]。Liu等报道了小球藻在500 nm处的OD与细胞密度呈直线关系^[9]。但是，也有不同的报道：刘学铭等研究了分批异养培养过程中小球藻在540 nm处的光密度值与干重的关系，结果表明干重与OD的比值受培养条件和培养过程的影响很大，DW/OD先升后降，变化范围0.53—0.28^[19]。

研究发现，在多数微藻培养后期，藻液OD值达到基本稳定时，生物质(干重)持续增长，同时细胞密度却在下降或基本不变。在此情况下，如果利用OD值的变化表示细胞密度或生物质变化就会产生很大误差。微藻培养过程中，藻液OD变化与细胞密度、生物质变化是什么关系，这种关系是否受测定波长的影响？利用分光光度计测定藻液OD值变化间接反映细胞密度和生物质干重变化的方法是否适用？其适用性是否受微藻种类和培养模式(分批培养、连续培养和半连续培养)的影响？为了寻找以上问题的答案，本文选用大小、形态不同的4种微藻，通过梯度稀释法测定不同浓度藻液的OD值与细胞密度及生物质干重，在分批培养过程中测定4种微藻藻液的可见光吸收光谱，同时测定细胞密度和生物质干重，研究光密度与细胞密度、生物质的关系。研究结果为正确使用分光光度法监测微藻生长提供依据。

本实验采用4种微藻：小球藻(Chlorella sp. XQ-20044)、栅藻(Scenedesmus sp. SS-200716)、绿球藻(Chlorococcum sp.)和螺旋藻(Spirulina sp. CH-164)，均由中国科学院武汉植物园经济微藻藻种库提供，四种微藻的形态分类特征见表 1。螺旋藻是多细胞丝状蓝藻，藻体最大；栅藻是多细胞绿藻(藻体通常由4个细胞组成)；绿球藻和小球藻都是单细胞绿藻，小球藻藻体最小。4种藻代表大小、形状不同的多细胞和单细胞微藻。

3种绿藻均采用改良的BG-11培养基^[20]，螺旋藻采用Zarrouk培养基，其中NaNO₃浓度改为0.1 g/L。本实验采用通气培养装置进行培养，该装置主要由长方体水槽、300 mL玻璃培养管、侧面平行排列的10只40W日光灯管、控温系统、水循环系统、充气系统和CO₂供给系统等组成^[21]。

取旺盛生长的微藻，3500 r/min离心8 min收集藻细胞，用新鲜培养基清洗后，再次离心收集藻细胞，接种于新鲜培养基中，进行通气培养。每种微藻接种3个培养管，每管装200 mL藻液。培养开始后的前24 h光照强度为100 μmol m^-2 s^-1，之后光照强度提高为200 μmol m^-2 s^-1。培养温度保持为(30±0.5)℃，光暗周期为14/10 h。4种微藻均在培养的第0、2、4、6、7、8天取样，每次取样后在培养管外壁准确标出藻液液面位置，下次取样之前先补加灭菌水至标记处，以补充培养过程中蒸发掉的水分。每隔24 h向藻液中充入CO₂，将螺旋藻藻液的pH降至9.5左右，其它3种绿藻的pH值降至7.0左右。实验重复两次。

取藻液3 mL，用紫外可见分光光度计(UV 5800，上海元析)1 cm光径比色杯，进行OD-波长扫描。波长范围350—800 nm，波长间隔为5 nm，获得不同波长下的OD值。

细胞计数：向3种绿藻藻液(每个样品2 mL)中分别加入Logul固定液0.05 mL，在显微镜下用血球细胞计数板对每个样品重复计数3次，计算出细胞密度平均值。当藻液密度过大无法计数时，可将藻液精确稀释后进行计数，乘以稀释倍数即得到原藻液细胞密度。小球藻和绿球藻是单细胞微藻，直接计算个体数；栅藻虽然是多细胞个体，但是在通气培养条件下分散成单细胞，细胞数目以单个细胞数计算。正在分裂的细胞若子细胞清晰可见则均需计数，螺旋藻不计数。

准确量取藻液体积，用事先干燥并已称重的孔径为0.45 μm的玻璃纤维膜过滤收获藻细胞，用蒸馏水洗两次后，放入真空干燥器中干燥至恒重。根据干藻重量和藻液体积计算出1 L藻液中的生物质干重(g/L)。为了减少实验误差，培养开始时至少取20 mL藻液，第2、4天取10 mL藻液，第6、7、8天取5 mL藻液。

分别取对数生长期的4种微藻，先用3500 r/min离心8 min浓缩获得高浓度的藻液(OD₆₈₀≈2.5)，测定生物质干重及细胞数目。然后再准确地将浓缩藻液进行稀释，使得到的藻液浓度分别为浓缩藻液浓度的1/2、1/4、1/6、1/8、1/10、1/20，对各个不同浓度的藻液进行OD-波长扫描。根据浓缩藻液的干重、细胞密度和稀释倍数，计算稀释藻液的干重和细胞密度，分析藻液OD值与细胞密度、干重的关系。

对4种微藻进行分批培养，于培养的第0、2、4、6、7、8天取样，进行OD-波长扫描、细胞计数和测定干重，分析藻液OD值与细胞密度、干重的关系。

以OD值为横坐标，对应的生物质干重为纵坐标作图(图 1)。各种波长下，4种微藻的干重与OD值都不是直线关系。当波长在435 nm时，可以用直线方程近似描述(R²＞0.98)，具有较高的线性拟合度。4种微藻在435 nm处生物质干重(y，g/L)与OD值(x)的直线方程如下：

小球藻     y=0.1656 x     (R²=0.9832)

栅藻    y=0.1799 x     (R²=0.9848)

绿球藻     y=0.3686 x    (R²=0.9989)

螺旋藻     y=0.3239 x    (R²=0.9986)

除了435 nm，其它波长下OD值与干重的关系都远远偏离直线关系。但是，无论哪种波长下，这种关系都可以很好地用二项式方程描述(R²＞0.99)。

三种绿藻细胞密度-OD值曲线图与干重-OD值曲线图相同(图未显示)。波长435 nm时，细胞密度与OD值的关系接近直线，可以用直线方程近似描述。3种绿藻细胞密度(y，10⁷个/mL)与OD值(x)的直线方程如下：

小球藻    y=1.747x    (R²=0.9832)

栅藻    y=0.8369x    (R²=0.9848)

绿球藻     y=1.5204x    (R²=0.9989)

与干重-OD关系一样，无论哪种波长下，细胞密度与OD值的关系都可以很好地用二项式方程描述(R²＞0.99)。

图 1 不同波长下干重与OD值的关系 Fig. 1 The relationships between biomass dry weight and optical density at different wavelength

图选项

4种微藻分批培养过程中不同培养时间的藻液吸收光谱如图 2所示。观察对数生长期(培养第2—4天)藻液的吸收光谱，发现4种微藻光密度的两个最大吸收峰都在435—440 nm和670—680 nm处，是微藻细胞内所含色素(主要是叶绿素)的两处最大吸收波长。这两处的光密度值在培养末期相对降低，不再是最大值，这与生长后期细胞内的色素变化有关。在培养后期小球藻的OD值稍有上升，栅藻和螺旋藻基本保持不变或略有下降，绿球藻OD明显下降。

图 2 4种微藻不同培养时间藻液的吸收光谱 (曲线左端数字表示培养时间(d)) Fig. 2 Optical spectrum of the four microalgae at different culture time (The numbers on the left of curves indicate culture time (d))

图选项

利用OD-波长扫描获得的数据及对应的细胞密度和干重，对4种微藻分批培养过程中不同波长下OD值与干重、细胞密度的关系进行作图分析(图未显示)。结果表明分批培养模式下无论哪种波长，OD值与细胞密度、干重都不呈直线关系，也不存在其它有规律的数量关系。因此，仅以惯用波长(绿藻为540 nm，螺旋藻560 nm)为例，对4种微藻光自养分批培养过程中藻液OD值、细胞密度和生物质干重的变化进行分析(表 2)。

小球藻的OD值随着培养时间不断增大，第6天进入稳定期，第8天达到最大为2.067。栅藻的OD值在培养的前7d不断增大，第7天达到最大为1.481，第8天基本保持不变。绿球藻和螺旋藻第7天OD值达到最大，分别为1.944和1.995，第8天稍有下降。

小球藻在接种48h后细胞密度约增加了4.4倍，之后增加较缓慢。到培养结束时，增加到接种时的5.6倍。栅藻在接种48h后细胞密度增加了1.8倍，第6天达到最大值，为接种时的3.3倍，第8天细胞密度下降14%。绿球藻在接种后第4天细胞密度进入稳定期，比接种时增加了1.4倍，之后增加缓慢，第8天细胞密度下降6%。

小球藻在前4d干重急剧增加，接种48h后干重增加了2.5倍，从第6天开始增加较缓慢，到培养结束时生物量增加了8.7倍。栅藻在培养的第2天干重增加1.8倍，之后持续增加到接种时的4.6倍。绿球藻在前6d生物质增加较快，之后减慢，到第8天生物量增加了5倍。螺旋藻在接种2d后生物质增加3.5倍，从第6天开始基本不再增加，到培养结束时生物量增加了5.6倍。

以第0、2、4、6、7、8天测得的OD值为横坐标，作OD与细胞密度、干重的关系曲线(图 3)。在分批培养的前期和中期，3种绿藻的OD值、细胞密度和干 重以及螺旋藻的OD值与干重都呈现一种增长的趋势，但是在培养后期，OD值、细胞密度和干重的变化趋势不一致。干重都保持增长，而栅藻和绿球藻的细胞密度均有不同程度的下降，OD值则有各种变化：维持不变，稍有增长或稍有下降。3种绿藻在培养过程中DW/OD比值均逐渐上升，小球藻DW/OD比值范围为0.19—0.44 g/L，栅藻为0.36—0.53 g/L，绿球藻为0.48—0.75 g/L。可见，对于同一种微藻，随着培养时间DW/OD不断增大；对于不同种微藻，细胞越大，DW/OD比值越大。螺旋藻在分批培养过程中，DW/OD为0.46—0.74 g/L。

图 3 4种微藻干重、细胞密度与光密度的关系 Fig. 3 The relationships between biomass dry weight,cell density and optical density of microalga OD540：在波长为540 nm下藻液的光密度值；OD560：在波长为560 nm下藻液的光密度值

图选项

分光光度计的工作原理是朗伯-比尔定律，即物质在一定波长处的光密度与物质的浓度和光程呈正比。微藻藻液是由培养基和悬浮于其中的藻细胞组成，是一种悬浊液，不仅对入射光有吸收，还有反射、折射和散射^[22]，不符合朗伯-比尔定律成立的条件。因此，利用分光光度计测定藻液的光密度，无论哪种波长，藻液OD值与细胞密度，OD值与生物质干重都不是严格地按比例变化。

光密度法用于细胞浓度的测定最初应用于细菌的生长中，在一定浓度范围内，细菌浓度与光密度成正比，此时可以用光密度来表征生长量。早在1949年Monod就提出用光密度法测定细菌的生物量，该法较其它方法简便易行且有效^[23]。后来，此方法除了用于细菌及单细胞微生物外，在微藻的培养中也得到广泛应用。但是，细胞悬浊液对光的吸收除了直接与生物量或细胞密度有关，还与细胞的大小、形状及折射率有关。当细胞形态及组成发生改变时，对光的吸收特性也会随之改变。由于在最大吸收峰处的信号最灵敏，因而此处的波长被广泛用来测定光密度。但是对于含有细胞色素的微藻而言，色素本身还具有吸光性，当细胞内色素含量发生变化时，就会干扰结果的测定，使测量值与实际值产生较大误差^{[24, 25]}。在分批培养条件下，微藻细胞色素含量占细胞干重的比例变化范围为0.5%—5.5%，利用标准曲线得到的生物量干重与实际测得值在680 nm处误差为9%—18%，在750 nm处为5%—13%。因此Griffiths指出，当细胞内色素含量发生改变时光密度法是不准确的^[24]。

图 1显示，梯度稀释实验中在波长435 nm处干重与OD值的关系最接近直线(OD值范围0.1—2.7)。对于其它波长，只有在藻液浓度很小的范围内，干重与OD值才接近直线关系。这与已有的一些报道相似，如郝聚敏报道蛋白核小球藻在680 nm处OD在0.07—0.12时，细胞浓度与OD呈直线关系，OD在0.04—0.4时，单位干重与OD呈直线关系；钝顶螺旋藻在560 nm处OD在0.1—0.3时，干重与OD呈直线关系^[26]。王英娟报道蛋白核小球藻在517 nm处OD在0.05—0.54之间，干重与OD呈直线关系^[12]。这些报道中藻液的OD值都很低，其适用性受到很大的限制。

梯度稀释实验使用的是对数生长期的藻液，其特征是细胞处于旺盛的分裂生长状态，细胞状态和形态基本一致。只有在这种情况下，干重、细胞密度与在435 nm处测得的OD的关系可以用直线方程描述。连续或半连续模式下培养微藻，藻细胞快速分裂增殖，细胞的状态和形态也基本一致，可以在435 nm处测定光密度，利用比例关系简便、快捷地反映细胞密度和生物质变化。如果使用其它测定波长，就必须先建立干重-OD值和细胞密度-OD值的回归方程(非直线方程)。需要指出，对于非直线回归方程，当藻液经过稀释后，必须先根据稀释后测得的OD值计算稀释藻液的细胞密度或干重，然后乘以稀释倍数计算原藻液的细胞密度或干重，而不能根据稀释后藻液的OD值和稀释倍数计算原藻液的OD值，然后再利用回归方程计算原藻液的细胞密度或干重。

分批培养过程中，细胞经历了旺盛增殖期和衰老期，细胞形态、大小处于不断变化中。无论哪种测定波长，4种微藻DW/OD的比值均随着培养时间不断变化(表 2)。藻液OD值与细胞密度、生物质干重之间不存在有规律的数量关系，不能用回归方程描述。所以，在分批培养模式下，测定藻液OD值反映细胞密度和生物质的方法不适用，只有直接测定的细胞密度和生物质才是准确的。用OD值绘制生长曲线，在稳定期以前，可以反映细胞密度或生物质变化的趋势，进入稳定期后，生长曲线不能反映细胞密度或生物质的变化。刘学铭等研究了分批异养培养过程中小球藻光密度与干重的关系，结果表明DW/OD的比值先升后降，变化范围0.53—0.28^[19]。可见，测定藻液OD值反映细胞密度和生物质的方法不仅不适用于光合自养分批培养，也不适用于异养分批培养。