蜘蛛是农林生态系统中的优势类群，在控制害虫危害和发展无公害农业中起重要作用。化学防治为作物带来增产的同时，也给蜘蛛等害虫天敌造成严重的危害。近年来，不少研究报道了低剂量农药在杀伤害虫的同时，还能对天敌的捕食作用起到一定的促进作用。因此揭示低剂量杀虫剂对天敌的作用机理，对提高天敌的捕食能力，发掘天敌的控虫潜能，协调生防和化防具有重要意义。关于低剂量杀虫剂对天敌的影响，国内外学者从天敌的捕食功能、捕食行为和天敌神经系统兴奋性方面进行了深入的研究。毒物兴奋效应最早在20世纪40年代，Southam和Ehrlich在研究红雪松提取物对真菌的作用时观察到一种双相的剂量-效应曲线，正式命名为毒物兴奋效应。1967年，Gabliks等把这种现象延伸到农药，如乐果、马拉硫磷和内吸磷等^[1]。Lund研究了低剂量杀虫剂对昆虫神经系统的影响，揭示了低剂量杀虫剂能激活昆虫细胞膜上潜在的离子通道 蛋白的活性^[2]。Soderlund和Oppenoorth等研究揭示了低剂量杀虫剂能加强昆虫神经系统的兴奋性^{[3, 4]}。国内关于毒物兴奋效应的研究较多，但关于天敌生物方面研究较少。张怡等研究了吡虫啉直接处理十三星瓢虫幼虫不同时间后，十三星瓢虫幼虫在高剂量作用下的捕食量小于低剂量作用下的捕食量，且日捕食量随时间延长而减少^[5]。胡聪等研究了低剂量吡虫啉作用下，多异瓢虫捕食蚜虫量增加但其繁殖力有一定降低^[6]。王智等研究了低剂量农药对稻田蜘蛛相对活力、拟环纹豹蛛对褐飞虱的功能反应、搜寻行为以及对稻田蜘蛛空间生态位影响^{[7, 8]}。从捕食行为和生理代谢酶活性变化角度来研究低剂量杀虫剂促进蜘蛛对害虫的捕食作用的机理，目前国内外尚未见报道。本研究采用药膜法，研究低剂量吡虫啉对星豹蛛捕食甘蓝蚜的捕食行为和体内代谢酶(解毒酶、保护酶和消化酶)活性的影响，从而探讨低剂量杀虫剂促进蜘蛛捕食效应的机理。

于2012年5—10月，在山西农业大学农业昆虫与害虫防治省级重点实验室进行。

供试蜘蛛为星豹蛛(Pardosa astrigera L. Koch)和个体大小一致的甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae Linn.)均采自山西农业大学试验田，带回室内饲养。饲养条件为：温度(25±1)℃，光照16h/d，相对湿度70%—80%。

供试农药为94.76%吡虫啉原药，青岛凯源祥化工有限公司提供。

供试试剂：乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶试剂盒，南京建成生物工程研究所生产；其他试剂均为国产分析纯。

星豹蛛的敏感性测定采用药膜法，根据厂商推荐浓度预试验找出药剂的作用范围，后进行测定。以杀死星豹蛛近50%个体浓度为标准，上下各配2—3个浓度。将供试药液倒入内径1.5cm，长8cm试管，转动管壁形成药膜，后到掉余液让其自然凉干成药膜。引入虫体大小一致的星豹蛛，放入棉球保湿，用纱布包扎试管口，每管放置1头蜘蛛。分别于处理后12、24h后观察死亡情况；以蛛体不动作为死亡的判别标准，以丙酮处理作为对照。每处理重复30次。

根据敏感性测定结果，用分析纯丙酮将吡虫啉原药配制成1、3、5、7、10 mg/L 5个梯度浓度的药液备用(防治蔬菜蚜虫厂商推荐用量为10 mg/L)。采用药膜法(方法同2.2.1 )，在5个浓度的吡虫啉供试药液处理过的试管中放入1头大小相近已饥饿24ｈ的星豹蛛成蛛，24 h后接入甘蓝蚜。对每个浓度共设5个密度处理，即在每个试管中分别放入10、20、30、40、50头甘蓝蚜成虫。每个密度处理重复10次，清水作对照。24h后检查各处理被食甘蓝蚜数，统计捕食量，并进行功能反应拟合。

(1)功能反应

用HollingⅡ型圆盘方程拟合^{[9, 10]}：

N_a=aTN_t／(1+aT_hN_t)

式中,N_a为捕食量，a为瞬时攻击率，T为捕食者用于寻找猎物的时间，T_h为捕食者处理猎物的时间，N_t为猎物密度。

将HollingⅡ方程线性回归后用最小二乘法求解a和T_h的值^[11]，拟合效果用F和x²检验。

2)寻找效应估计^[12]

S=a／(1＋aT_hN_t)

式中，S为寻找效应，a为瞬时攻击率，T_h为天敌处理猎物的时间，N_t为猎物密度。

(1)酶液制备 采用药膜法(方法同2.2.1 )，在1、3、5、7、10 mg/L 5个浓度梯度吡虫啉药液处理过的试管中放入饥饿48h的星豹蛛成蛛，共设6、12、24、36、48、60、72头7个处理时间，每个处理时间分别取3头星豹蛛。按每头加入1mL提取液冰浴匀浆，于高速冷冻离心机以10000 r/min，4℃下离心15min，取上清液作为酶源。每个处理时间重复3次，清水作对照。

(2)乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定^[13]乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱可以与巯基显色剂(DTNB)反应生成TNB黄色化合物，反应条件为37℃水浴中反应15 min，0.1mmol/L的毒扁豆碱终止反应，用酶标仪测定412nm处OD值。

(3)谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性测定^[14] 以谷胱甘肽作底物，经GSTs作用，与还原型谷胱甘肽(GSH)反应可生成黄色硫醇尿酸衍生物，其活性以催化GSH氧化的反应速度及单位时间内GSH减少的量来表示，37℃水浴中反应10min，用酶标仪测定340nm处OD值。

(4)超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 以氯化硝基四氮唑蓝为底物，反应在25℃、4000lx光照条件下15min，用酶标仪测定560nm处OD值。以每毫克蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD 活性单位(U)。

(5)过氧化氢酶(CAT)活性测定 过氧化氢酶分解H₂O₂的反应可通过加入钼酸铵迅速中止，剩余的H₂O₂与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，以每毫克蛋白每秒分解1μmol H₂O₂的量为一个活性单位(U)，计算CAT的活性。

具体操作步骤：按南京建成生物工程研究所生产的AChE、GSHs、SOD和CAT试剂盒说明书进行。

(1)中肠酶液制备 取10头饥饿48ｈ的星豹蛛成蛛，在体视显微镜下于冰块上解剖，取其中肠，加2mL的 1mmol/L的磷酸缓冲液(pH=8.0)冰浴研磨，匀浆在4℃下4000 r/min离心15min，取上清液作为酶源。

(2)中肠蛋白消化酶活性测定 取待测酶液0.2、0.5mL底物(酪蛋白，0.5%)及0.015μL的1、3、5、7、10 mg/L 5个浓度梯度吡虫啉药液混匀，37℃水浴反应15 min，加入1.3mL 20%三氯乙酸(TCA)终止反应，静置2 min后于4℃，4000 r/min离心10 min，取上清液0.8mL加1.6mL Na₂CO₃和0.2mL Follin-酚混匀，在37℃水浴中显色15min。用酶标仪测定680nm处OD值，重复3次。在做好的标准曲线上查出对应的酪氨酸含量，确定酶活性大小。

参照Bradford法^[15]，采用考马斯亮蓝G₂₅₀测定各酶液中可溶性蛋白含量。以牛血清蛋白制作标准曲线y=0.0056x+0.0412 (r=0.9889，P< 0.01)，式中x为蛋白含量(μg)，y为OD值^[15]。

采用相关系数r和X²检验测定吡虫啉不同处理浓度与星豹蛛捕食量间相关性；采用双因素方差分析(two-way ANOVA) 比较农药不同处理浓度和处理时间对星豹蛛酶活力的影响，数据分析用DPS9.50统计软件进行。

吡虫啉对星豹蛛和甘蓝蚜敏感性测定结果见表1，星豹蛛对吡虫啉的敏感性，LC₅₀为 10.0142mg/L。

低剂量吡虫啉农药作用下星豹蛛对甘蓝蚜的捕食功能反应见图1。

图 1 低剂量浓度吡虫啉作用下星豹蛛的捕食功能反应 Fig. 1 Functional responses of Pardosa astrigera predation under low concentrations of imidacloprid

图选项

由图1可得，不同浓度梯度的低剂量吡虫啉作用下星豹蛛的捕食功能反应符合Holling Ⅱ反应模型。因此，可用圆盘方程N_a=aN/(1＋aT_hN)来描述，功能反应模型参数见表2。

由表2可知，对照组和处理组间1/N与1/N_a之间的相关系数r分别为0.971、0.973、0.970、0.969、0.965、0.971，当d_f=5时r_0.05=0.898，r> r_0.05，表明猎物密度与捕食量呈显著相关。随着农药浓度梯度的增加，处理组对猎物的处理时间T_h为对照组的0.673、0.800、0.873、1.109、1.532倍；瞬时攻击率 a为对照组的1.454、1.385、1.304、1.186和0.044倍；最大捕食量为对照组的1.467、1.259、1.133、0.897和1.532倍。为检验模型的精度，将N=10、20、30、40、50及圆盘方程各参数代入N_a=aN /(1＋aT_h N)得理论捕食量，进行X²检验，对照组和处理组X²值分别为1.090、3.783、4.916、3.852、4.809、3.445，当d_f=5时X²_0.05=11.07，X²< X²_0.05，模型的理论值与实测值显著吻合。

低剂量吡虫啉处理星豹蛛对甘蓝蚜的寻找效应结果见图2。

图 2 低剂量吡虫啉作用下星豹蛛寻找效应与猎物密度的关系 Fig. 2 Relationship between the searching rate and prey density of Pardosa astrigera treated with low concentrations of imidacloprid

图选项

由图2可知，低剂量吡虫啉作用下，星豹蛛对甘蓝蚜的寻找效应随着猎物密度的增大而逐渐降低。在1、3、5、7mg/L 4个浓度梯度的吡虫啉药液处理后，星豹蛛对猎物的寻找效应明显高于对照；而在10 mg/L较高吡虫啉浓度作用下，星豹蛛对猎物的寻找效应略低于对照。

不同浓度低剂量吡虫啉处理星豹蛛成蛛后，代谢解毒酶乙酰胆碱酯酶(AChE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性的变化结果见图3、图4。

图 3 低剂量吡虫啉对星豹蛛乙酰胆碱酯酶活力的影响 Fig. 3 Effects of low-dose of imidacloprid on activities of AChE of Pardosa astrigera

图选项

图 4 低剂量吡虫啉对星豹蛛成蛛体内谷胱甘肽S-转移酶活力的影响 Fig. 4 Effects of low-dose of imidacloprid on activities of GSTs of Pardosa astrigera

图选项

由图3、图4可得，低剂量吡虫啉处理星豹蛛后体内的AChE和GSTs的活性在一定的处理时间和处理浓度范围内明显受到抑制，与对照组相比存在显著差异(P<0.05)。处理组AChE酶活性最高点出现在7mg/L浓度作用下36h，其活性为(3.330±0.31)U/mg蛋白，为对照组的0.770倍；最低点出现在1mg/L浓度作用下24h，其活性为(0.375±0.04) U/mg蛋白，仅为对照组的0.173倍。

GSTs酶活性最高点出现在7mg/L浓度作用下72h，其活性为(90.424±5.32) U/mg蛋白，为对照组的1.716倍；最低点出现在7mg/L浓度作用下36h，其活性为(1.465±0.00) U/mg蛋白，仅为对照组的0.095倍。在处理时间内，处理组谷胱甘肽-S-转移酶活性变化趋势与对照组大致吻合，为逐渐升高的变化趋势。6—48h酶活力变化较小，48—72h都有不同程度的上升；在处理时间内酶活性处理组较对照组差异不显著，只有在吡虫啉浓度为3、5和7mg/L作用下72h和10mg/L浓度下36h高于对照组外，其他浓度和时间内酶活性均低于对照组。

不同低剂量浓度的吡虫啉处理星豹蛛，超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性变化结果见图5、图6。

图 5 低剂量吡虫啉对星豹蛛超氧化物歧化酶活力的影响 Fig. 5 Effects of low-dose of imidacloprid on activities of SOD of Pardosa astrigera

图选项

图 6 低剂量吡虫啉对星豹蛛过氧化氢酶活力的影响 Fig. 6 Effects of low-dose of imidacloprid on activities of CAT of Pardosa astrigera

图选项

由图5、图6可得，低剂量吡虫啉处理星豹蛛后SOD和CAT酶活性显著增强，与对照组相比存在显著或极显著差异(P<0.05)。SOD酶活性在24、48h出现两个高峰，最高值出现在1、5mg/L浓度下48h，其活性分别为(557.760±5.78)、(537.300±2.79)U/mg蛋白，为对照组的1.909和1.839倍；最低点出现在7mg/L浓度作用下72h，其活性为(32.738±0.52) U/mg蛋白，仅为对照组的0.599倍。

CAT酶活性在36h活性最大，0h到6h，各处理组体内CAT活性均低于对照组，分别为对照组的0.515、0.375、0.473、0.514和0.147倍，说明农药处理后0h到6h CAT活性被抑制。12h到24h，各处理组的CAT活性都明显上升，到36h时，处理组的CAT活性达到最高，分别为对照组的2.901、2.297、1.322、1.282和1.561倍。48h后随着农药作用时间的延长，虫体受伤加重，处理组的CAT活性又开始下降，到72h下降到最低。

不同低剂量浓度的吡虫啉处理星豹蛛，中肠蛋白消化酶活性变化结果见图7。

图 7 低剂量吡虫啉对星豹蛛中肠蛋白消化酶活性的影响 Fig. 7 Effects of low-dose of imidacloprid on activities of midgut proteinase of Pardosa astrigera

图选项

由图7可得，清水对照组星豹蛛的中肠蛋白消化酶酶活性变化不大，6h时酶活性最高，24h时最低。以吡虫啉处理后，酶活性最高点出现在1mg/L浓度作用下6h，其活性为(1.142±0.04) U/mg蛋白质；最低点出现在7mg/L浓度作用下72h，其活性为(0.046±0.05) U/mg蛋白质。在吡虫啉浓度梯度为1、3、5、7和10mg/L作用下，6h时其中肠蛋白消化酶活性分别为对照组的1.897、1.714、1.544、1.466和0.925倍。说明6h内是中肠蛋白消化酶活性最高时期，也是中肠消化解毒的关键时期。48h后，中肠蛋白消化酶活性呈显著下降趋势，中肠蛋白消化酶活性在农药作用后期明显降低，可能是因为吡虫啉被消化后引起肠道pH发生变化影响蛋白酶的流行性，使蛋白酶活性下降。

田间重复大量施药造成害虫抗药性增加，害虫再猖獗，农药残留的同时，还影响到天敌的行为和捕食，减少天敌的繁殖率，抑制天敌生长发育，杀伤猎物减少其捕食源，影响天敌的种群结构^{[16, 17, 18]}。因此，田间施药种类、施药方式、药剂浓度，如何协调化学防治和生物防治两者间的矛盾，使之在害虫控制中发挥各自优势，已成为害虫综合治理的关键^{[19, 20, 21]}。李锐等研究了应用微核试验和单细胞凝胶电泳技术检测四种杀虫剂对蜘蛛血细胞DNA的损伤程度，结果表明低剂下DNA损伤程度大于较高浓度是由于低浓度造成细胞DNA断裂，较高浓度下细胞DNA发生交联，部分受损细胞得到修复^{[22, 23]}。本研究进一步验证了Southam和Ehrlich的“毒物兴奋效应”，并发展了Hueppe和Smyth的“毒物低剂量效应学说”的观点，即在本项研究中，吡虫啉对星豹蛛敏感性测定结果LC₅₀为 10.0142mg/L和在吡虫啉防治甘蓝蚜厂商推荐剂量为10mg/L前提下，当浓度为1、3、5mg/L的低剂量浓度是可以提高星豹蛛控虫力的有效浓度范围。

捕食功能结果表明，低剂量吡虫啉处理后星豹蛛的捕食功能可以用HollingⅡ圆盘方程进行模拟，但模型参数均有改变；在不同浓度梯度作用下，随着吡虫啉浓度的增加，星豹蛛对甘蓝蚜的处理时间Th逐渐变短，同时对甘蓝蚜的瞬间攻击率a均有所增加。星豹蛛对甘蓝蚜的寻找效应随着猎物密度的增大而下降，随着农药梯度的增大而逐渐下降，最后接近对照组。说明低剂量农药处理星豹蛛后缩短了其对猎物的处理时间，提高了其瞬间攻击率，从而增加了其日捕食数量，提高了其对猎物的控制作用。由此可得，适当的低剂量吡虫啉处理和一定的处理时间可促进星豹蛛对甘蓝蚜的控制作用。而关于低剂量作用下蜘蛛的长期的控害能力、体内本酶系活性长期的动态监测有待于作进一步深入研究。

在杀虫剂中毒和解毒过程中，无疑解毒酶、保护酶和消化酶起着极为重要的作用，已经在不少昆虫种类中发现，生物体对外源有毒物质发展了解毒、避毒和贮毒等适应方式，从而影响到生物体内解毒酶系在质或量上发生变化，从而改变其解毒能力，提高了对机体保护能力，对药剂的敏感性也发生变化^{[24, 25]}。本研究结果表明通过吡虫啉处理星豹蛛后，体内解毒酶和消化酶活性都发生了变化，引发蜘蛛体内一系列生理生化反应，从而提高机体对逆境的适应性。

消化酶主要是消化系统内分泌的营消化作用的酶类，在消化酶中，又依消化对象的不同而大致可划分为蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和几丁质酶等多种。蛋白消化酶是一种存在于蜘蛛中肠细胞内，对底物蛋白质专一性很强的消化水解酶，其活性的强弱直接决定蜘蛛对害虫的捕食作用大小^[26]。因此，深入研究低剂量的化学农药对蜘蛛中肠蛋白消化酶活性，为杀虫剂的合理使用、充分发掘蜘蛛等天敌的控虫潜能及天敌兴奋剂的开发研制提供理论依据。低剂量的吡虫啉处理星豹蛛中肠后，蛋白消化酶活性发生了变化。在6h和36h出现两个酶活性高峰期为星豹蛛消化解毒的关键时期。对合适的低剂量吡虫啉能激活星豹蛛中肠蛋白消化酶活性，从而增强蜘蛛捕食能力，提高对害虫的控制作用。其结果与王智等研究了甲胺磷对拟环纹豹蛛中肠蛋白消化酶活性影响的结果相一致。

低剂量农药增强星豹蛛的捕食能力的原因可能是：(1)在捕食行为上，增强了瞬间攻击率，缩短了其对猎物的处理时间，从而增加了其日捕食数量。(2)在代谢酶生理活性上，解毒酶受到一定程度的抑制，低剂量吡虫啉导致AChE敏感性降低，对神经递质乙酰胆碱的分解作用下降，使蜘蛛的兴奋性增加；同时低剂量农药导致蜘蛛的主要保护酶活性增加，例如GSTs、SOD、CAT、多功能氧化酶系(MFOs)和酯酶等，使蜘蛛的新陈代谢加速，从而刺激捕食。(3)在消化酶生理活性上，低剂量杀虫剂在药后6h激活了中肠蛋白消化酶的活性，提高了对猎物的消化吸收功能。总之，在低剂量杀虫剂作用下，蜘蛛通过外在的捕食行为和内部一系列酶系生理生化反应的综合作用，增加了捕食量，提高了对猎物的捕食能力。

本研究结果在室内进行，与自然环境条件如：温度、湿度、光照、猎物密度、猎物分布、天敌密度以及天敌之间的相互作用等存在一定差异，但结论对合理使用杀虫剂，协调生防与化防的关系具有重要意义。而有关杀虫剂促进蜘蛛捕食的分子调控机理有待于进一步深入研究。

本研究进一步验证了Southam和Ehrlich的“毒物兴奋效应”，并发展了Hueppe和Smyth的“毒物低剂量效应学说”的观点。吡虫啉对星豹蛛的LC₅₀为10.1042 mg/L与防治菜蚜厂商推荐剂量为10mg/L浓度相当，当浓度为1、3、5mg/L的吡虫啉溶液是提高其控虫力的有效浓度范围。

低剂量农药处理蜘蛛后缩短了其对猎物的处理时间，提高了其瞬间攻击率，从而增加了其日平均捕食量和最大捕食量，从捕食行为上提高了对猎物的控制作用。

在一定低剂量农药浓度作用下和一定处理时间内，蜘蛛体内的代谢解毒酶活性受到一定程度的抑制，激活了代谢保护酶和中肠蛋白消化酶活性，使蜘蛛的新陈代谢加速，从而刺激捕食。

由此可得，在一定处理时间内，适当的低剂量农药可促进蜘蛛对害虫的控制作用。