2024, Vol. 44文章信息
- 多立安, 杨超杰, 马美晨, 宋狄亚, 赵树兰
- DUO Li'an, YANG Chaojie, MA Meichen, SONG Diya, ZHAO Shulan
- 氧化石墨烯对黑麦草种子内生真菌群落结构和多样性的影响
- Effects of graphene oxide on the structure and diversity of endophytic fungal community in the seeds of Lolium perenne L.
- 生态学报. 2024, 44(8): 3550-3559
- Acta Ecologica Sinica. 2024, 44(8): 3550-3559
- http://dx.doi.org/10.20103/j.stxb.202302050183
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文章历史
- 收稿日期: 2023-02-05
- 网络出版日期: 2024-01-30
作为一种重要的石墨烯衍生物, 氧化石墨烯(GO)是很多石墨烯基纳米材料(GBNs)合成的前体；独特的理化性质使其在很多领域有着广泛的应用[1—2]。因此, 在加工、运输和使用过程中, GO会不可避免地释放到环境中, 其潜在的环境风险随着生产和使用量的增加而增加, 其毒性研究受到普遍关注[3—4]。
目前, 关于GO对微生物毒性的研究主要集中在对土壤微生物毒性和群落结构研究上。研究表明, GO对大多数细菌具有抗菌活性[5—6], 其毒性机制普遍认为是GO对细胞膜的物理损伤和GO诱导的氧化损伤[7]。GO对细菌造成物理损伤的途径主要包括粘附在细胞表面、包裹细胞阻止细胞繁殖、穿透细胞等等[8—9], 导致细胞形态和结构发生变化、溶质渗出及细胞膜功能受损[10]。GO与微生物相互作用时, 会攻击蛋白质、核酸和细胞膜等, 破坏细胞的抗氧化和氧化平衡, 导致细胞内酶和其他物质分泌异常, 最终引起细胞损伤, 甚至细胞死亡[11]。在一项调查GO接触4种细菌(大肠杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌和粪大肠杆菌)的杀菌潜力研究中, 发现GO显著降低了细菌的活力, 其抗菌性呈浓度依赖性, 在高的GO浓度(300和500 μg/mL)下观察到最高的杀菌活性[5]。Evariste等[12]研究发现, 1 mg/L GO对细菌生长有较强的抑制作用, 影响了与硅藻相关的细菌群落组成。Hao等[13]研究表明, 土壤中的微生物数量随着GO浓度的增加而减少。Du等[14]研究发现, GO显著改变了土壤细菌群落的组成和结构, 导致一些固氮菌和铁还原菌的增加。Forstner等[15]研究表明, 所有剂量的GO均显著影响了土壤细菌和真菌群落的组成。
植物内生真菌是指其生活史的一定阶段或全部阶段定殖于健康植物的组织内而对寄主植物无明显致病性的一类真菌, 存在于种子、根、茎、叶等器官组织内部和细胞间隙[16]。内生真菌与宿主植物在长期的协同进化过程中, 形成了互利共生的关系[17]。宿主植物为内生真菌提供生存空间和营养物质, 内生菌可产生一些代谢物, 如生长激素等可以促进植物的生长, 有些活性代谢产物可以增强宿主植物对各种胁迫的抗逆性, 提高植物的抗病虫害能力[18—20]。如印度梨形孢(Piriformospora indica)是一种多功能内生真菌, 其定殖在根系能促进宿主植物生长和光合作用, 并通过增加茉莉酸的积累和防御基因的表达提高甘薯对食草性昆虫采食的能力[21]。AI Husnain等[22]研究发现, 海榄雌(Avicennia marina)中存在的内生真菌对大多数番茄病原菌具有抑制作用, 能控制它们所引起的病害。
植物内生菌通常由种子传播并为其宿主植物提供有益作用[23]。种子内生菌对种子的生长发育至关重要, 可以提高种子萌发率, 影响子代植株中菌群的定殖等[24]；还可进行固氮和磷增溶来促进植物的生长。迄今为止, 碳纳米材料对植物内生菌群落影响的研究很少。Hao等[25]研究表明, 即使在10 mg/L浓度下, 水稻内生真菌对碳纳米材料暴露都很敏感, 250 mg/L多壁碳纳米管和C60显著改变了内生真菌的群落组成。Du等[26]的研究发现, GO暴露降低了水稻根系内生细菌群落的多样性、均匀度和丰富度, 有益细菌种群的相对丰度也降低。但无论如何, 还未见GO对植物种子内生菌群落影响的相关报道。
多年生黑麦草(Lolium perenne L.), 禾本科黑麦草属, 是全球重要的牧草和草坪植物, 具有很高的经济价值。禾本科牧草和草坪草种子普遍被内生真菌所感染, 早在19世纪末, 就在多年生黑麦草上发现了内生真菌[27]。而关于黑麦草内生真菌的研究多集中在促生、抗逆和抗病等方面[28—29]。鉴于内生真菌通过种子传播, 将有益微生物代代相传, 并且为宿主植物提供诸多益处, 本文以黑麦草种子为实验材料, 采用高通量测序技术, 研究GO暴露下黑麦草种子内生真菌群落组成和多样性的变化, 以期了解碳纳米材料暴露对共生物种的潜在影响。
1 材料与方法 1.1 供试材料多年生黑麦草种子购自百绿(天津)国际草业有限公司, 品种为顶峰。GO购自苏州恒球石墨烯科技有限公司, 为褐黄色粉末, 纯度大于95%, 片层直径10—50 μm, 平均厚度3.4—8.0 nm, 比表面积100—300 m2/g。
1.2 研究方法分别将0.24 g、0.48 g和0.72 g GO粉末, 溶于60 mL的超纯水中配成浓度为0.4%(GO1)、0.8%(GO2)和1.2%GO(GO3)的GO悬浮液, 超声30 min使GO纳米片分散均匀。
在直径10 cm的培养皿中加入两层无菌滤纸, 然后分别加入6 mL不同浓度的GO悬浮液, 用无菌水作为对照(CK)。每个容器均匀放置1 g黑麦草种子, 室温状态下培养, 每个处理4次重复。每天向培养皿中补充相应浓度的GO溶液, 连续胁迫4 d。
经GO处理的种子用流水冲洗10 min, 随后通过无菌操作对样本表面进行杀菌消毒处理。在75%酒精中浸泡40 s, 无菌水漂洗30 s, 2%次氯酸钠溶液浸泡5 min, 再用无菌水冲洗6次。取200 μL最终漂洗过种子的无菌水, 涂布在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上培养, 检测消毒效果[34]。用无菌滤纸吸干种子表面水分, 置于无菌离心管中, -80 ℃冷冻保存。
1.3 DNA提取、PCR扩增和高通量测序黑麦草种子DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[30], 之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度, 取适量的样本DNA于离心管中, 使用无菌水稀释样本至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板, 使用Barcode的特异引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)及Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs)高效高保真酶进行真菌内转录间隔区(ITS)的PCR扩增。PCR反应体系(30 μL)：Phusion Master Mix(2×)15 μL, 引物(2 μM)各3 μL, gDNA(1 ng/μL)10 μL, ddH2O 2 μL。PCR反应条件：98 ℃预变性1 min；98 ℃ 10 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30个循环；72 ℃ 5 min。
PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测, 对检测合格的PCR产物进行纯化, 构建文库, 经过Qubit定量和文库检测合格后, 利用NovaSeq 6000平台(北京诺禾致源生物信息技术有限公司)进行高通量测序。将测序得到的数据进行质控和过滤, 具体步骤如下：根据Barcode序列拆分各样品数据, 使用FLASH(v1.2.7)对每个样本的测序片段(reads)进行拼接, 得到原始标签数据。然后用Trimmomatic (v0.33)软件, 对Raw tags进行过滤, 得到高质量的Tags数据；利用QIIME(v1.9.1)鉴定并去除嵌合体序列, 得到最终的有效数据。用UPARSE(v7.0.1001)对全部有效序列进行聚类, 在97%序列相似度水平上计算操作分类单元(OTU)的数量进行物种注释分析, 获得分类学信息, 并在各个分类水平上统计各样本的群落组成。
1.4 数据分析在数据序列OTU聚类分析的基础上, 利用QIIME软件计算Alpha多样性指数, 包括Shannon指数和Simpson指数反映真菌群落的多样性、Chao1指数和ACE指数反映群落丰富度。采用主坐标分析(PCoA), 基于未加权(unweighted) UniFrac距离利用R语言Vegan包(V2.5.3)分析不同处理之间内生真菌群落结构的相似性。利用线性判别分析法(LEfSe)设定显著差异的LDA值为4. 0, 寻找各分类水平上组间丰度差异显著物种。
利用SPSS 22.0软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比较, 来确定真菌群落丰度在不同处理间的差异显著性(P＜0.05)。
2 结果与分析 2.1 不同GO处理对黑麦草种子内生真菌Alpha多样性的影响测序所得样品数据经质控后, 共获得770357条有效序列, 以≥97%的相似性聚类得到844个OTUs, 其中1.2%GO处理黑麦草种子内生真菌OTU数量最多, 为701。由韦恩图(图 1)可知, 对照组、0.4%、0.8%、1.2%四个处理共有的OTU数有114个, 特有的OTU数分别为40、28、22和415个, 可见1.2%GO处理与其他处理相比, 内生真菌群落多样性显著增加。
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| 图 1 不同GO处理下黑麦草种子内生真菌群落OTUs韦恩图 Fig. 1 Venn diagram of endophytic fungal OTUs in L. perenne seeds under different GO treatments GO：氧化石墨烯；OTUs：操作分类单元；CK：对照；GO1：0.4%GO；GO2：0.8%GO；GO3：1.2%GO |
根据黑麦草种子内生真菌群落Alpha多样性指数(表 1)可知, 4个处理的覆盖度均大于99.9%, 表明测序数据基本覆盖了4个处理所有内生真菌的生物信息。Shannon指数体现每个处理种子内生真菌群落多样性, ACE和Chao1指数反映物种的丰富度, 指数越大, 丰富度越高。0.4%和0.8%处理对内生真菌Alpha多样性指数没有显著影响, 但高浓度GO(1.2%)处理下, 各指数显著增加, 由此可知, 1.2%GO处理下内生真菌有着较高的丰富度和多样性。
| 处理 Treatments |
ACE | Chao1 | Shannon | Simpson | 覆盖度 Coverage |
| CK | 186.6±12.3b | 182.0±13.4b | 1.83±0.64b | 0.43±0.18b | 1.000 |
| GO1 | 153.1±45.0b | 148.6±40.8b | 1.63±0.33b | 0.41±0.08b | 1.000 |
| GO2 | 194.0±29.1b | 187.0±27.3b | 2.21±0.33b | 0.55±0.08ab | 1.000 |
| GO3 | 417.1±211.9a | 413.8±211.2a | 3.98±1.45a | 0.76±0.16a | 0.999 |
| GO：氧化石墨烯; CK：对照；GO1：0.4%GO；GO2：0.8%GO；GO3：1.2%GO；不同字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05) | |||||
通过对测序结果的物种注释, 从4个处理的黑麦草种子中共获得10门、39纲、84目、160科、240属和303种内生真菌。如图 2所示, 在门水平上, 各处理的优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota), 各处理子囊菌门的相对丰度以对照组为最高(90.07%), 其次为0.4%处理(84.61%), 1.2% 处理为最低(70.06%)；担子菌门丰度以0.8%处理为最高(22.37%), 对照组最低(1.05%)。随着GO浓度的升高, 子囊菌门的丰度呈下降趋势, 0.8%和1.2%GO处理显著低于对照, 降低了20%左右(P＜0.05)；而各浓度GO处理担子菌门的丰度则显著高于对照(P＜0.05)。
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| 图 2 不同GO处理下门、目和属水平黑麦草种子内生真菌群落组成 Fig. 2 The composition of endophytic fungi communities at phylum, order and genus levels in L. perenne seeds under different GO treatments Ascomycota：子囊菌门；Basidiomycota：担子菌门；Mortierellomycota：被孢霉门；Glomeromycota：球囊菌门；Rozellomycota：罗兹菌门；Chytridiomycota：壶菌门；Blastocladiomycota：芽枝菌门；Olpidiomycota：油壶菌门；Kickxellomycota：梳霉门；Mucoromycota：毛霉门；Pleosporales：格孢腔菌目；Hypocreales：肉座菌目；Sporidiobolales：锁掷酵母目；Filobasidiales：线黑粉菌目；Archaeorhizomycetales：古根菌目；Melanosporales：黑孢壳目；Capnodiales：煤炱目；Sordariales：粪壳菌目；Mortierellales：被孢霉目；Glomerales：球囊菌目；Alternaria：链格孢属；Claviceps：麦角菌属；Epicoccum：附球菌属；Sporobolomyces：掷孢酵母属；Filobasidium：线黑粉酵母属；Fusarium：镰刀菌属；Archaeorhizomyces：古根菌属；Harzia：哈氏菌属；Cladosporium：枝孢菌属 |
对目水平分析后发现, GO改变了黑麦草种子内生真菌目的种类和丰度。格孢腔菌目(Pleosporales)为优势菌目, 对照组丰度最高(84.68%), 随着GO浓度的升高, 其丰度出现下降, 1.2%处理显著低于对照44.48%(P＜0.05)。除了格孢腔菌目外, 对照组优势菌有古根菌目(Archaeorhizomycetales, 4.07%)；而GO处理优势菌包括锁掷酵母目(Sporidiobolales)和线黑粉菌目(Filobasidiales), 以0.8%处理为最高, 相对丰度为11.67%和8.40%；在1.2%处理中优势菌肉座菌目(Hypocreales), 其相对丰度高达23.66%。
在属水平上, 4个处理黑麦草种子内生真菌主要由链格孢属(Alternaria)组成, 对照、0.4%、0.8%和1.2%GO处理其丰度占比分别为：73.85%、76.12%、65.20%和36.49%；1.2%处理显著降低了链格孢属的丰度, 较对照降低了37.36%(P＜0.05)。除链格孢属外, 对照组优势属还包括附球菌属(Epicoccum, 9.02%)和古根菌属(Archaeorhizomyces, 4.07%)；而掷孢酵母属(Sporobolomyces)和线黑粉酵母属(Filobasidium)是3个GO处理的共有优势属, 处理间差异并不显著；枝孢菌属(Cladosporium)和Parastagonospora是0.8%和1.2%处理的共有优势属, 处理间差异不显著；麦角菌属(Claviceps)和镰刀菌属(Fusarium)是1.2%处理的特有优势属, 丰度占比分别为14.25%和6.63%。可见, GO处理可以改变黑麦草种子内生真菌的丰富度和多样性, 从而改变其群落结构。
物种丰度聚类热图可以反映不同处理间物种的组成和差异。由图 3分析可知, 在属水平上, 黑麦草种子内生真菌的群落结构表现为：对照组和0.4%处理组可聚为一类, 表现出相似的群落结构, 而1.2%处理组则相对独立, 真菌群落结构和其他3个处理差异较明显。
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| 图 3 不同GO处理下属水平上黑麦草种子内生真菌物种丰度聚类热图 Fig. 3 Heat map of species abundance clustering of endophytic fungi at the genus level in L. perenne seeds under different GO treatments unidentified：未分类的；Archaeorhizomyces：古根菌属；Epicoccum：附球菌属；Alternaria：链格孢属；Harzia：哈氏菌属；Sporobolomyces：掷孢酵母属；Filobasidium：线黑粉酵母属；Tilletiopsis：腥掷孢菌属；Cladosporium：枝孢菌属；unidentified_Tremellomycetes_sp：未分类的银耳纲；unidentified_Rozellomycota_sp：未分类的罗兹菌门；Neoascochyta：异壳二孢属；Claviceps：麦角菌属；Funneliformis：管柄囊霉属；Chaetomium：毛壳菌属；Gibberella：赤霉菌属；unidentified_Mortierellales_sp：未分类的被孢霉目；Fusarium：镰刀菌属；unidentified_Ascomycota_sp：未分类的子囊菌门 |
主坐标(PCoA)分析可以比较不同处理间物种多样性的相似程度。由图 4可知, 两个主坐标共解释了51.43%的差异, 其中, PC1和PC2分别解释了31.06%和20.37%的差异。0.4%和0.8%GO处理黑麦草种子内生真菌菌群多样性较为相似；而1.2%GO处理内生真菌菌群多样性与其他处理差异较大。
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| 图 4 不同GO处理下黑麦草种子内生真菌群落PCoA分析 Fig. 4 Principal coordinate analysis of endophytic fungi community in L. perenne seeds under different GO treatments PCoA分析：主坐标分析Principal co-ordinates analysis |
为了比较各分类水平下组间物种差异, 在LDA阈值=4时, 进行了LEfSe分析。由图 5可知, 对照组黑麦草种子内生真菌有5个显著差异类群, 分别为古根菌纲(Archaeorhizomycetes)、古根菌目(Archaeorhizomycetales)、古根菌科(Archaeorhizomycetaceae)、古根菌属(Archaeorhizomyces)和Archaeorhizomyces_sp；0.8%GO处理显著富集的生物标记物(biomarkers)是担子菌门(Basidiomycota)、银耳纲(Tremellomycetes)、线黑粉菌目(Filobasidiales)、线黑粉菌科(Filobasidiaceae)、线黑粉酵母属(Filobasidium)和Filobasidium_stepposum；1.2%GO处理显著差异的biomarkers是粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、麦角菌属(Claviceps)和麦角菌(Claviceps_purpurea)；0.4%GO处理无差异显著的物种。
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| 图 5 不同GO处理黑麦草种子内生真菌群落LEfSe分析 Fig. 5 LEfSe analysis of endophytic fungi communities in L. perenne seeds under different GO treatments (LDA≥4. 0) Archaeorhizomycetaceae：古根菌科；Archaeorhizomyces：古根菌属；Archaeorhizomycetales：古根菌目；Archaeorhizomycetes：古根菌纲；Filobasidiales：线黑粉菌目；Filobasidiaceae：线黑粉菌科；Filobasidium：线黑粉酵母属；Tremellomycetes：银耳纲；Basidiomycota：担子菌门；Claviceps_purpurea：麦角菌；Clavicipitaceae：麦角菌科；Claviceps：麦角菌属；Hypocreales：肉座菌目；Sordariomycetes：粪壳菌纲 |
种子能将微生物从母本植物传播到下一代, 种子内生真菌在调节植物生长中至关重要, 对环境条件很敏感。本研究首次采用高通量测序技术对GO胁迫下黑麦草种子内生真菌群落结构和多样性进行分析。研究发现, GO可以改变黑麦草种子内生真菌的种类和丰度, 从而改变其群落结构。与本研究结果相一致, 子囊菌门和担子菌门被发现是植物种子的优势菌门[23]；许多子囊菌能和植物形成稳定的共生关系。也有研究发现, 子囊菌门是高羊茅体内丰富度最高的内生真菌, 担子菌门是种子中的优势真菌[31]。随着GO浓度的升高, 子囊菌门的丰度呈现下降趋势, 担子菌门的丰度则显著上升, 说明作为最主要类群的子囊菌门对纳米材料的响应很敏感, 而GO处理碳含量提高, 为担子菌门中菌群的发展提供了更好的营养和生长发育条件[32]。Chen等[33]发现在500 mg/kg多壁碳纳米管处理下, 根际土壤中子囊菌门的相对丰度最低, 与之相反, 担子菌门的相对丰度增加。穆耀辉等[34]的研究表明, 喷施纳米硅使烟叶的子囊菌门比例有所下降, 而担子菌门的有所升高。从属水平群落结构看, GO改变了黑麦草种子内生真菌的种类和丰度, 作为最丰富的链格孢属在1.2%GO处理丰度显著下降, 说明链格孢属对碳纳米材料很敏感；链格孢属是一种重要的植物病原菌, 能引起多种植物病害, 其丰度的降低对植物本身是有益的；同样, 对照组优势菌群附球菌属和古根菌属也较敏感, 在GO暴露后则消失了。而掷孢酵母属和线黑粉酵母属成为所有GO处理的优势菌群, 麦角菌属、枝孢菌属和镰刀菌属成为1.2%GO处理的优势属, 说明这些菌属对GO具有较强的适应力, 更容易在GO存在下生长。GO具有较强的化学活性[35], 其暴露会引发黑麦草种子内部微生态环境的变化, 从而改变内生真菌的群落结构[26]。
在氧化石墨烯的暴露下, 黑麦草种子内生真菌的多样性有所改变。本研究中, 0.4%和0.8%GO处理对ACE和Chao1指数没有显著影响, 但1.2%GO处理ACE和Chao1指数显著增加, 这可能是由于Chao1指数对稀有物种很敏感, 推测1.2%GO胁迫下一些稀有菌种, 如麦角菌属、镰刀菌属和掷孢酵母属大量繁殖所导致[36]。Shannon和Simpson指数反映菌群的多样性, Shannon指数对物种丰富度和稀有种更敏感, Simpson指数对物种均匀度和富集种更敏感[37]。可以推测本研究中1.2%GO处理Shannon指数的增加是由于某些稀有真菌急剧增长成为优势菌属所致。众所周知, 环境条件的改变会引起植物内生真菌群落的变化[38]。Xu等[39]研究发现, 页面喷施ZnO纳米材料后, 南瓜根系的内生真菌多样性增加, 一些有益菌显著富集。另外, PCoA的分析结果进一步证实了GO对黑麦草种子内生真菌群落的影响与浓度相关, 高浓度下影响较大。
综上所述, 暴露于不同浓度的氧化石墨烯会引起黑麦草种子内生真菌群落组成和多样性的变化。高浓度(1.2%)的GO作用下, 优势菌的种类和丰度发生明显改变, 内生真菌的丰富度和多样性增加, 从而改变了内生真菌的群落结构。
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