杭白菊Chrysanthemum morifolium cultivar ‘Hangbaiju′是浙江省著名传统中药“浙八味”之一, 生性寒、滋味稍甘又略带微苦, 具有清热、护肝、明目、祛毒和消炎的药理功效。其作为茶用菊, 花瓣洁白如玉, 幽香淡雅, 回味甘甜, 花型美丽。历史上曾与西湖龙井茶相媲美, 已批准为国家地理标志农产品, 原产地是浙江省桐乡市。然而, 杭白菊病虫害还是比较严重的, 已记载60多种^[1—9]。近些年来发现花期的杭白菊植株招引大量菊蚜。菊蚜嗜好菊花花朵, 它们在花上觅食或匿于花朵内, 部分蚜虫随着菊花的采摘进入加工环节, 残留于菊花产品中。每当开水冲泡菊花茶时, 蚜尸或残肢就浮现于菊花茶汤中, 导致饮者“倒胃口”, 而影响杭白菊产品品质和市场售价。有些菊农们就在花期高剂量施药治蚜, 常常会导致杭白菊农残超标。菊蚜因而成了杭白菊产业的重要限制因子之一。菊蚜包括菊小长管蚜Macrosiphoniella sanborni Gillette, 棉蚜Aphis gossypii Glover和桃蚜Myzus persicae Sulzer^{[1—3, 6—8]}。菊小长管蚜是菊属Chrysanthemum植物专化性害虫^{[1, 6—9]}, 春、夏、秋生长季节在菊株上为害, 冬季在菊株上越冬。尤其是杭白菊花期该蚜对于菊花花朵的嗜好和滞留给杭白菊产业带来消极影响, 目前仍缺乏有效防控手段。

现阶段, 化学防治仍是防治蚜虫类害虫的主要手段^[8—11]。事实上, 对于饮料作物病虫而言, 施药防治滞留于菊花花朵上的菊蚜、取食幼嫩茶梢的茶蚜易于造成菊花茶、茶产品农残超标, 影响健康饮用。业界认为菊花花朵、茶梢分别是加工菊花茶、茶产品的原料, 菊园、茶园使用的农药品种约70%是水溶性的, 开水沏泡菊花茶、茶产品过程中, 约70%的农残进入菊花茶汤、茶产品汤中。可以施用虫生真菌制剂治蚜^[12], 利用食蚜蝇等天敌昆虫治蚜^[13], 但在菊园中甚少报道。小范围施用蚜虫性诱剂、植物源引诱剂诱杀蚜虫有报道^[14—16], 黄板诱蚜^[17]一直在探讨。因此, 菊花、茶树等饮料作物上的蚜虫难以防治。本组发明了茶蚜Toxoptera aurantii Boyer的一种植物源引诱剂^[18], 对于生长季节的有翅蚜和深秋的性蚜都有良好防控效果。寄主茶树的挥发物与茶树嫩梢色彩的组合也显著地吸引茶蚜^[17]。杭白菊花期一般从10月下旬—12月初, 也是性蚜分化时节, 成批的雌蚜也会分泌性信息素诱来雄蚜。化学信息物质等嗅觉因子、以及色彩、形状、尺寸和其它可视因子是昆虫搜寻寄主的关键线索^[19—22], 而嗅觉因子与视觉因子的恰当组合对于昆虫更具有引诱力^[22]。本研究旨在探明在杭白菊花期, 菊花植株招引菊小长管蚜的嗅觉和视觉机制, 基于该机制研发环境友好的绿色防控手段用于菊小长管蚜的治理。

1 材料与方法 1.1 花期杭白菊植株挥发性化合物的收集鉴定

参照文献^[23]收集挥发物的试验程序并稍做修改。在2020年10月30日, 剪取15 cm长、质量约20 g、着生8朵菊花的1支菊株, 切口用浸了蒸馏水的棉球保湿, 立即置于顶空动态采气系统。该系统主要部件是直径10 cm、体积10 L的玻璃筒, 玻璃筒从中央分为2个部分, 以玻璃磨口密接或拆开。每半个玻璃筒部分连着1个玻璃管, 长5 cm、内径7 mm, 作为进气口或出气口。滤过的清洁空气以100 mL/min的流量从进气口导入, 出气口依次联接含Porapak Q 150 mg的吸附柱、流量计和真空泵。进气口内气体流速略高于出气口内气体流速, 以阻止周围环境中未过滤的空气进入玻璃筒(图 1)。

抽气1 h, 取下Porapak Q吸附柱, 用600 μL色谱纯二氯甲烷淋洗, 洗脱液接入1.5 mL棕色小瓶中, 加20 μL 10^-4g/mL癸酸乙酯作为内标, 混匀。用高纯氮气流缓缓吹扫至20 μL左右, 吸取1 μL注入气-质联用仪进行分析。

气—质联用仪为气相色谱GC6890A联质谱仪MSD6975, 美国安捷伦公司生产。色谱柱是HP-5MS石英毛细管柱, 长30.0 m, 内径250 μm, 壁内膜厚0.25 μm。99.99%高纯氦气作为载气, 流速1.0 mL/min。进样方式为无分流进样。溶剂延迟3 min。进样口温度250℃, GC与MS接口温度280℃。采用程序升温, 先在50℃保温1 min, 以3.5℃/min升至120℃, 再以2.0℃/min升至140℃, 以3.5℃/min升至190℃, 在190℃保持1 min。该GC-MS使用电子撞击离子源, 离子能70 eV。使用全扫描, 扫描频率2 Hz。

定性分析：①样品组分的保留时间与可信标准品的保留时间的比较；②样品组分的质谱图与GC-MS工作站的NIST 11.L.中标准化合物的质谱图的比较；③杭白菊和其它植物植株挥发物文献^[23—26]。定量分析：样品每个组分的色谱图峰面积与内标峰面积之比值。

1.2 花期杭白菊植株挥发物对菊小长管蚜引诱效应的室内行为测定

味源：据“1.1”定性定量分析结果, 挑选其中相对含量大的17种主要组分作为味源, 即α-蒎烯、反-2-己烯醛、(+)-4-蒈烯、顺-3-己烯乙酯、顺式-β-罗勒烯、γ-萜品烯、1-辛烯-3-乙酯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、反式-β-罗勒烯、a-蒈烯、4-甲基-苯甲醇、(±)-2-樟脑、α-水芹烯、4-甲基-苯丙醇和α-雪松烯。自Sigma-Aldrich公司购得这17种组分的化学合成品, 纯度≥99.00%, 分别溶于正己烷, 配成10^-4 g/mL溶液。2种蚜虫性信息素荆芥醇和荆芥内酯购自J & K Scientific公司(北京, 中国), 纯度≥ 97.00%, 皆配成10^-6 g/mL正己烷溶液。

供试昆虫：2020年春季种植杭白菊幼苗于中国计量大学菊园, 源自桐乡市菊园的菊小长管蚜被引入菊株上培养。秋季花期, 取1日龄成蚜(不考虑性别)作为供试昆虫, 实验前饥饿0.5 h。

Y-管嗅觉仪及生物测定程序：依据Wu等^[27]略作改进, 玻璃质地Y-管嗅觉仪两臂和基部长度都是10 cm, 内径1.5 cm, 两臂之间夹角120°。每个臂分别联接味源瓶或CK瓶、加湿瓶、活性炭过滤器、流量计。基部开口联接真空泵, 用Teflon管联接各部件。吸取1 mL味源液(或正己烷)至开口的安碚瓶中, 开口安碚瓶置于味源瓶(或CK瓶)。从Y-管基部开口抽气, 保持每臂气体流速是120 mL/min。测试前2 min开始抽气, 以保证Y-管系统流动着来自两臂的稳定的气流。测试时, 用指形管将1头成蚜从Y-管基部开口引入。进入之后, 蚜虫逆气流螺旋形运动, 或向前直行。它摆动触角辨识味源, 在两臂交叉处选择进入味源臂或者CK臂。在味源臂或者CK臂行动5 cm的蚜虫个数被记录。如果>2 min的时间不运动或者在两臂之间做频繁转换, 这样的蚜虫记为无明确选择的个数。1头蚜虫只用1次(图 2)。

每个味源剂量处理重复4次, 每次使用20头蚜虫, 每测10头之后就用纯乙醇擦洗Y-管内外壁, 烘干, 调换味源臂和CK臂的联接以消除可能的位置偏向。1种味源测试完成后, Y-管、味源瓶、CK瓶和其它玻璃部件用重铬酸钾洗液清洗, 120℃烘干再用。活性炭在烘箱里100℃鼓风活化4 h, 冷却后密封于玻璃瓶中备用。

生物测定于09:00—15:00在实验室内执行, 室温22—28℃, 相对湿度65%—75%, 光照3200—3600 lux。

使用The DPS^Ⓡ DATA PROCESSING SYSTEM^[28]数据处理系统。如果味源既不吸引又不排斥蚜虫, 蚜虫选择味源臂或CK臂的概率都是50%, 则有假设测验H₀=50:50。χ²测验用于检测选择味源臂蚜数与CK臂蚜数之间的差异, P < 0.05和P < 0.01即两者之间差异达显著和极显著水平。

1.3 菊园中挥发物+色彩引诱菊小长管蚜的行为测定 1.3.1 蚜虫引诱剂和有色粘板的加工

“1.2”行为测定结果表明, α-蒎烯、E-2-己烯醛、(+)-4-蒈烯、cis-3-己烯乙酯、cis-β-罗勒烯、γ-萜品烯和1-辛烯-3-乙酯7种化合物显著吸引菊小长管蚜成蚜。“1.1”检测结果表明这7种成分的相对含量比例近似60∶10∶10∶2∶2∶20∶2, 分别配成10^-2 g/mL正己烷溶液。将蚜虫性信息素荆芥内酯作为第8个成分, 配成10^-4 g/mL正己烷溶液。依上述次序, 将这8种正己烷溶液按60∶10∶10∶2∶2∶20∶2∶1体积比配成复合型蚜虫引诱剂。

再依据本组发明专利^[18], 配制蚜虫引诱剂, 组成成分为：反-2-己烯醛、顺-3-己烯-1-醇和顺-3-己烯乙酸酯, 剂量皆为10^-2 g/mL, 按照1∶1∶1体积比混配。

试验使用了芽绿粘板(长40 cm ×宽20 cm)与菊花黄粘板(长40 cm ×宽20 cm)^[29—31], 由杭州茶菊科技有限公司生产。

1.3.2 芽绿粘板和菊花黄粘板引诱菊小长管蚜效应的比较

田间试验1∶2020年10月30日在桐乡市农业技术推广中心试验基地选一块面积667 m²的菊园, 随机放置10块芽绿粘板和10块菊花黄粘板。每块板挂于竹签上, 竹签插入菊行。粘板下底边高于菊花顶5 cm。粘虫板之间相互间距7—8 m。每隔24 h计数1次每块板上诱捕的蚜虫数, 连续计数72 h。每天芽绿粘板捕获的蚜数与菊花黄粘板捕获的蚜数之间的差异用Student′ t-test予以检测。

1.田间试验2: 2021年10月29—31日, 在桐乡市农业技术推广中心试验基地执行与“田间试验1”一致的试验。

1.3.3 菊园中载有蚜虫引诱剂的菊花黄粘板诱蚜试验

(1) 田间试验3：

① 4种试验处理的准备：1 mL的蚜虫复合型引诱剂、蚜虫引诱剂、或者正己烷溶液(见1.3.1), 加入1 mg抗氧化剂2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene, 常用缩写BHT), 载于1条羊毛毡(4 cm长× 2 cm宽× 0.5 cm厚)上, 接着用聚氯乙烯塑料膜封闭羊毛毡, 制成1个诱芯, 塑料膜厚100 μm, 诱芯贮于-20℃备用。

1块菊花黄粘板附1个蚜虫复合型引诱剂诱芯, 组成1个诱捕器。按照“田间试验1”的菊花黄粘板在菊园中放置方法, 放置诱捕器诱杀菊小长管蚜。类似地, 载有蚜虫引诱剂诱芯的菊花黄粘板、以及载有正己烷诱芯的菊花黄粘板也用于诱杀菊小长管蚜。第4个处理则是均匀喷施10%可湿性吡虫啉粉剂(郑州农化有限公司生产), 剂量10 g/亩。

② 试验程序：2021年杭白菊采花时间10月25日—11月25日。10月14日从桐乡市选一大片菊园, 分为16个小区, 每个小区面积1亩, 相近小区间隔10 m。16个小区随机分为4组处理, 亦即蚜虫复合型引诱剂处理、蚜虫引诱剂处理、正己烷处理、吡虫啉处理。

为评估每个小区菊小长管蚜种群密度, 在每个小区接近菊花顶部随机扫网100次, 计数网捕的蚜虫个数。捕虫网由60目白细布制成, 直径30 cm, 网深70 cm。同时, 用“五点取样法”调查5个样方的菊花植株上蚜数, 样方大小是1 m²菊株。为维持诱杀试验前各个小区虫口的均匀性, 接着对于这一大片菊园全面均匀喷施10%可湿性吡虫啉(郑州农化有限公司生产)溶液。

2021年10月15日, 在每个小区再次使用同样的网捕法和“五点取样法”调查菊小长管蚜个数。

2021年10月30日, 使用同样的网捕法和“五点取样法”调查每个小区蚜数。随后, 在蚜虫复合型引诱剂处理的4个小区、蚜虫引诱剂处理的4个小区、正己烷处理的4个小区分别放置诱捕器, 诱捕器之间间距7 m × 8 m。至于吡虫啉处理的4个小区, 每个小区均匀喷施10 g 10%吡虫啉粉剂。

2021年11月14日, 以网捕法和“五点取样法”查得每个小区菊小长管蚜的个数。

2021年11月29日, 使用网捕法和“五点取样法”查得每小区菊小长管蚜的个数。每个小区的诱芯分别被更换。吡虫啉处理的每个小区再次喷施10 g 10%吡虫啉粉剂。

此外, 在2021年11月4日、9日、14日、19日、24日和29日, 每个小区的所有粘板诱捕的蚜虫被计数, 更换粘虫板。

2021年12月6日下雪。2021年12月14日、2022年3月15日, 用网捕法和“五点取样法”调查每个小区蚜数。

(2) 田间试验4：

试验程序和内容同“田间试验3”, 试验时间不同。

2022年10月15日、10月16日、10月31日, 2022年11月15日、11月30日, 2022年12月15日, 在每个小区以网捕法和“五点取样法”调查菊小长管蚜个数。2022年11月30日, 先用网捕法和“五点取样法”查得每小区蚜数；再将每个小区的诱芯更换, 吡虫啉处理的每个小区喷施10 g 10%吡虫啉粉剂。

2022年11月5日、10日、15日、20日、25日和30日, 所用粘板被检测诱蚜个数并被更换。

1.3.4 统计分析

对于4种处理的蚜数差异, 先用一尾方差分析测验显著性, 再用最小显著极差法(LSD)比较各处理之间差异, 显著性α=0.05^[28]。

2 结果和分析 2.1 花期杭白菊植株挥发性化合物的定性定量分析

花期杭白菊植株挥发物中36个成分被鉴定(图 3)。烯类是优势成分, 占总挥发物含量45%, 诸如α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯。其次是酮类, 占总挥发物含量23%。再次是绿叶化合物(表 1)。

2.2 花期杭白菊植株主要挥发物对菊小长管蚜的引诱效应

在室内, 使用Y-管嗅觉仪测定了花期杭白菊植株的17种主要挥发物、蚜虫2种性信息素对于菊小长管蚜的引诱效应。结果表明, 10^-4 g/mL的α-蒎烯、反-2-己烯醛、(+)-4-蒈烯、顺-3-己烯乙酯、顺式-β-罗勒烯、γ-萜品烯、和1-辛烯-3-乙酯, 以及10^-6 g/mL的荆芥醇和荆芥内酯引诱的蚜数显著多于正己烷(CK)引诱的蚜数。其它测试成分没有显示出显著的效果(图 4)。

2.3 菊花黄对于菊小长管蚜的诱效稍强于芽绿

田间试验1结果表明：2020年10月30日—11月1日在菊园菊花黄粘板诱得的蚜数稍多于芽绿粘板诱捕的蚜数, 但是差异未达显著水平(表 2)。2021年10月29日—31日在菊园进行了同样的菊小长管蚜行为检测试验, 并得到了类似结果(表 3)。

2.4 载有蚜虫复合型引诱剂的菊花黄粘板大量诱杀菊小长管蚜成虫 2.4.1 田间试验3的诱杀效果

2021年杭白菊采摘时间10月25日—11月25日, 10月14日预备了16个试验小区, 每个小区面积0.067hm²。全面喷施了吡虫啉之后, 翌日蚜虫种群密度降到最低(图 5)。然而, 在CK区从10月15日—11月14日, 蚜虫数量骤增, 之后又很快下降。

10月30日开始诱杀或喷药, 半个月之后即11月14日, 蚜虫引诱剂处理区蚜虫种群密度降低, 蚜虫复合型引诱剂处理区蚜虫种群密度较低, 吡虫啉处理区蚜虫种群密度最低, 但是, 3者差异未达显著水平。11月14日之后, 蚜虫复合型引诱剂区、蚜虫引诱剂区蚜数持续降低；由于农药药效下降, 吡虫啉处理区蚜数逐渐上升, 接近CK区蚜虫密度。

11月29日, 每小区蚜数又被扫网法和“五点取样法”调查, 蚜虫复合型性诱剂处理区域、蚜虫引诱剂处理区、吡虫啉处理区和CK区蚜数平均值±标准差分别是182±6, 202±9, 326±15和312±7。差异达到了显著水平, P < 0.05, 一尾ANOVA分析, F_{(3, 12)}=222.4。LSD测验表明, 蚜虫复合型性诱剂区、蚜虫引诱剂区的蚜数显著低于喷药区蚜数或CK区蚜数。

由于12月6日及其后几日遭遇雨雪天气, 在12月14日查得所有小区蚜虫密度降到最低(图 5)。

与此同时, 从2021年11月4日—29日, 每5天1次调查粘板上诱杀的蚜虫个数, 结果表明, 携带蚜虫复合型性诱剂或蚜虫引诱剂的菊花黄粘板拥有强大的诱杀效果(表 4)。

2021年冬季之后, 至2022年3月15日, 每个小区蚜数开始增长。蚜虫复合型性诱剂区或蚜虫引诱剂区的蚜数显著低于CK区蚜数、吡虫啉喷药区蚜数(F_{(3, 12)}=133.0, P < 0.05)。

2.4.2 田间试验4的诱杀效果

2022年10月—12月田间试验4结果也证实, 携带蚜虫引诱剂1的菊花黄粘板对于菊小长管蚜具有强大的诱杀潜能(图 6、表 5)。

3 讨论

多年的田间实践发现菊小长管蚜嗜好菊花花朵, 寻觅于花朵上刺吸菊花汁液和藏匿于花朵中, 易于随着菊花的收获而被送往加工厂, 残留于菊花产品中。开水冲饮过程中, 蚜尸和肢体就会浮于菊花茶汤中, 致饮者“倒胃口”, 影响饮用和售价。若在花期喷药治蚜, 常常造成菊花产品的农残超标, 曾一度影响了杭白菊业形象。该蚜已成为近20年来杭白菊最严重的病虫之一, 亟需适宜的绿色防控手段。

花期该蚜群聚于菊花花朵上, 推测花朵散发的香味、展示的色彩和形状等线索引诱了该蚜。本研究就以花期杭白菊植株为试验材料, 分离鉴定了36种挥发物, 挑选其中含量大的17种主要成分为味源, 经室内行为测定筛选出7种显著引诱该蚜的成分。与之同时, 杭白菊花期正值深秋时节, 分化出一批批性蚜, 在花朵上觅食的雌成蚜会释放性信息素引诱雄成蚜。寄主植物挥发性化合物在自然状态下的组成成分及其比例构成的化学指纹图对于植食性昆虫具有最佳诱效, 遂将这7种成分按照在菊株挥发物中测出的比例、再加入微量蚜虫性信息素荆芥内酯, 配成蚜虫复合型性诱剂。本课题组曾研制了显著诱杀茶蚜Toxoptera aurantii Boyer的茶蚜引诱剂^[18], 主要成分源自茶树挥发物, 在本研究中称之为蚜虫引诱剂, 作为参比引诱剂。之所以在菊园的一系列试验证实, 其对于菊小长管蚜的诱效明显弱于本研究的蚜虫复合型性诱剂, 是因为引诱剂组成不同, 蚜虫种类也不同、菊园环境有别于茶园。

芽绿表现出对于蚜虫、粉虱、蓟马和其它小型昆虫显著诱效^{[15—16, 29—33]}。本研究发现菊花黄对于菊小长管蚜的引诱力与芽绿色相当或者稍强。携带蚜虫复合型性诱剂的菊黄色粘板诱捕的蚜数明显多于携带蚜虫引诱剂的菊黄色粘板诱捕的蚜数。而且, 携带复合型蚜虫性诱剂的菊黄色粘板对于菊小长管蚜的防效优于吡虫啉。可见花期菊花植株嗅觉线索(挥发物+蚜虫性信息素)与菊花视觉线索(花蕊和花瓣的黄色)叠加引诱菊小长管蚜。

在喷药区, 10月30日之后, 蚜虫种群密度很快下降, 之后由于药效的快速下降而缓慢上升。同时, 由于诱虫板的更新和引诱剂的缓释, 携带蚜虫复合型性诱剂或蚜虫引诱剂的菊黄色诱虫板一直在诱杀蚜虫, 消耗蚜虫数量。因此, 1个月之后, 在11月29日, 信息素诱捕区蚜虫数已经显著低于喷药区。

过了寒冷的冬季之后, 直至2022年3月15日, 在每个处理区内有翅蚜和无翅蚜数已经开始增长。然而, 在蚜虫复合型性诱剂处理区、蚜虫引诱剂处理区的蚜虫数量显著低于正己烷处理区和喷药区, 亦将一定程度上抑制诱杀区域春季菊小长管蚜种群增长趋势。菊蚜综合防治已取得长足进展^{[2—3, 34—35]}, 包括天敌昆虫应用^[36—37]、虫生真菌制剂施用^[38]、植物源农药喷施^[39—41]、以及植物源驱避剂的应用^[42]。本研究证实载有复合型性诱剂的菊花黄粘板从秋季开花至翌年春季的持续更新使用是另一种环境友好、经济合算的控制菊小长管蚜的措施。