毛乌素沙地固碳功能菌群落随生物结皮发育阶段的演变特征

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李凯凯, 张丙昌, 赵康, 张雅丽, 刘燕晋

LI Kaikai, ZHANG Bingchang, ZHAO Kang, ZHANG Yali, LIU Yanjin

Succession of carbon-fixing microbial community in different stages of biological soil crusts in the Mu Us Sandy Land

生态学报. 2024, 44(3): 1177-1190

Acta Ecologica Sinica. 2024, 44(3): 1177-1190

http://dx.doi.org/10.20103/j.stxb.202304090716

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收稿日期: 2023-04-09

网络出版日期: 2023-11-08

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李凯凯, 张丙昌, 赵康, 张雅丽, 刘燕晋. 毛乌素沙地固碳功能菌群落随生物结皮发育阶段的演变特征. 生态学报, 2024, 44(3): 1177-1190.

Li K K, Zhang B C, Zhao K, Zhang Y L, Liu Y J. Succession of carbon-fixing microbial community in different stages of biological soil crusts in the Mu Us Sandy Land. Acta Ecologica Sinica, 2024, 44(3): 1177-1190.

毛乌素沙地固碳功能菌群落随生物结皮发育阶段的演变特征

李凯凯^1,3 , 张丙昌^1,3 , 赵康^2,3 , 张雅丽^1,3 , 刘燕晋^1,3

1. 山西师范大学地理科学学院, 太原 030031;
2. 山西师范大学生命科学学院, 太原 030031;
3. 山西师范大学黄河中游生态环境研究中心, 太原 030031

收稿日期: 2023-04-09; 网络出版日期: 2023-11-08

基金项目: 国家自然科学基金(42271067, U2003214)

^*通讯作者Corresponding author. 张丙昌, E-mail: 20170031@sxnu.edu.cn.

摘要: 生物结皮是干旱区生态系统光合固碳的重要贡献者, 固碳功能菌是生物结皮碳固定过程中的关键功能群, 而毛乌素沙地生物结皮有关固碳功能菌群落多样性的研究未见详细报道。通过qPCR和高通量测序, 研究了毛乌素沙地固碳功能菌基因丰度、群落多样性在生物结皮发育过程中的演变规律及其关键环境因子。结果表明, form IAB、IC和ID的基因丰度均随生物结皮发育呈升高趋势, 在地衣结皮最高, 在藓结皮又明显降低; form IAB的Chao1和form IC的Shannon指数随生物结皮演替呈显著上升趋势, 而form IC和ID的Chao1则在藻结皮达到峰值。物种组成上, IAB型固碳功能菌以蓝藻门的颤藻目占优势, 其相对丰度在藻结皮最高, 随生物结皮演替逐渐降低; IC型固碳功能菌在裸沙中以土壤红杆菌目为主, 而在三种生物结皮中以生丝微菌目、亚硝化单胞菌目和红螺菌目占优势; ID型固碳菌则以硅藻门的舟形藻目占优势, 其丰度在裸沙中最高。IAB和IC型固碳功能菌群落结构在藻结皮和地衣结皮类似, 而与裸沙和藓结皮差异显著, 裸沙与藓结皮亦具显著差异。生物结皮演替过程中生物类群和土壤理化特征的改变为固碳功能菌提供了不同的生态位, 土壤总有机碳、全氮、铵态氮、全磷、速效磷和pH对固碳功能菌群落进行综合调控, 通过对固碳功能菌的筛选作用, 最终改变固碳功能菌群落组成和结构。为深入理解荒漠生态系统生物结皮的光合固碳功能的微生物学机制提供了理论支撑。

关键词: 生物结皮固碳功能菌群落多样性环境因素毛乌素沙地

Succession of carbon-fixing microbial community in different stages of biological soil crusts in the Mu Us Sandy Land

LI Kaikai^1,3 , ZHANG Bingchang^1,3 , ZHAO Kang^2,3 , ZHANG Yali^1,3 , LIU Yanjin^1,3

1. School of Geographical Science, Shanxi Normal University, Taiyuan 030031, China;
2. School of Biological Science, Shanxi Normal University, Taiyuan 030031, China;
3. Research Center of Ecological Environment in the Middle Reaches of the Yellow River, Shanxi Normal University, Taiyuan 030031, China

Abstract: Biological soil crusts (BSCs) are key contributor of carbon sequestration of arid land ecosystem. Carbon-fixing microbes are the critical functional groups in the carbon sequestration in biological soil crusts. However, the detailed research on carbon-fixing microbial diversity of BSCs in Mu Us Sandy Land was not reported. To explore the variation of the abundance and community diversity of autotrophs in the succession of biological soil crusts, qPCR and Micseq sequencing were performed for the samples from Mu Us Sandy Land. The key environmental factors driving carbon-fixing microbial community were also explored. The results indicated that the abundance of form IAB, IC and ID gene increased with the development of BSCs and reached the highest in lichen crusts, then decreased clearly in moss crusts. Chao1 of form IAB and Shannon index of form IC showed the increasing trends with the succession of BSCs, whereas Chao1 of form IC and ID reached the highest in algal crusts. In terms of species composition, IAB-type autotrophic microbes were dominated by Oscillatoriales of Cyanobacteria, their relative abundance reached the highest in algal crusts and gradually decreased with the succession of BSCs. In the bare sand, IC type autotrophic microbes were dominated by Solirubrobacterales, Hyphomicrobiales, Nitrosomonadales and Rhodospirillales were dominated in BSCs. Naviculales of Bacillariophyta dominated the ID type microbes, and their abundance reached the highest in bare sand. The community structure of IAB and IC type autotrophic microbes were similar in algal crusts and lichen crusts, but significantly different from that in bare sand and moss crusts, which also had significant differences. The variations of biological groups and soil physicochemical properties provided different microhabitats (niches) for autotrophs. The total organic carbon, total nitrogen, ammonium nitrogen, total phosphorus, available phosphorus, and pH regulated autotrophic microbial communities comprehensively. Through the screening of carbon-fixing microbes, the community composition and structure were finally changed. The study provides new evidences in understanding microbial mechanisms of carbon sequestration of BSCs in desert ecosystems.

Key Words: biological soil crusts carbon-fixing microbes community diversity environmental factors Mu Us Sandy Land

生物土壤结皮(简称生物结皮)是荒漠生态系统的重要景观, 它们是由隐花植物如蓝藻、细菌、真核藻类、真菌、地衣、苔藓等通过菌丝体、假根和分泌物与土壤表层颗粒胶结而成的一种有机复合体^[1—2]。生物结皮大约覆盖了地球陆地生态系统表面积的12%, 在干旱区的覆盖度更是高达70%以上^[3—4]。生物结皮在防风固沙、提高土壤养分、保持土壤水分、促进植被演替等方面发挥着重要生态功能^[5—6]。裸沙是生物结皮形成之前的早期阶段, 随着微生物、藻类、地衣和苔藓植物的殖入, 逐渐形成生物结皮, 根据主要物种组成可将生物结皮分为藻结皮、地衣结皮和藓结皮三个演替阶段^[7]。研究表明, 随着生物结皮的演替, 其固碳能力急剧增加, 演替后期的藻类-地衣混生结皮的年固碳量比以具鞘微鞘藻为优势的藻结皮高20—30多倍^[8]；Xu等^[9]发现生物结皮显著提高土壤有机碳含量, 其固碳量分别是沙漠和草地的2.2倍和1.3倍。固碳功能菌是生物结皮光合固碳的关键功能群, 它们促进了生物结皮碳、氮、磷等养分的转化, 并且调控了微生物的群落组成与代谢过程。

固碳功能菌主要通过卡尔文循环固定CO₂, 1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)是卡尔文循环的第一步限速酶。Form Ⅰ为自然界中RuBisCO酶最主要的存在形式, 而编码form I RuBisCO 酶大亚基的cbbL基因是研究Calvin循环的关键指示基因, 它被广泛用作分子标记物来研究环境中固碳功能菌群落多样性及其遗传进化特征^[10—12]。根据cbbL基因序列差异, formI cbbL基因又可分为form IAB(蓝细菌), form IC(变形菌、绿弯菌)及form ID(真核藻类)^[13]。研究表明, 青藏高原草地土壤固碳功能菌具有较高的多样性和固碳潜力, 主要类群是变形菌和放线菌^[14—16]；在农田土壤的研究中发现固碳功能菌数量丰富, 其多样性因土地利用方式、耕作方式的不同表现出明显的差异^[17—18]。近些年来干旱半干旱地区生物结皮中的固碳功能菌受到关注, 有研究表明生物结皮的不同演替阶段均含有丰富的固碳功能菌, 藻结皮中主要是IAB型固碳功能菌, 如丝状蓝藻和绿藻的种类^[19—20], 而地衣结皮中的固碳功能菌主要由变形菌门、放线菌门、蓝细菌门和酸杆菌门组成^[21—22]。Zhao等也发现古尔班通古特沙漠生物结皮中form IAB基因主要存在于微鞘藻属, 而含有form IC基因的固碳功能菌主要由放线菌和根瘤菌占主导^[23]。

毛乌素沙地作为我国典型半干旱区, 生物结皮广泛发育。目前该区域生物结皮微生物方面的研究主要涉及生物结皮细菌、真菌多样性^[24—25], 但有关生物结皮固碳功能菌群落的研究未见详细报道。根据生物结皮演替对土壤理化特性的改善以及对土壤微生物群落的影响, 本文提出以下科学问题：1)在生物结皮演替过程中, 固碳功能菌的丰度和群落多样性如何变化？2)影响固碳功能菌的关键环境因子是什么？为此, 本研究通过qPCR与高通量测序探讨毛乌素沙地固碳功能菌群落在生物结皮演替过程中的变化规律, 并进一步解读影响生物结皮固碳功能菌的关键环境因子, 为深入理解毛乌素沙地生物结皮光合固碳的微生物学机制提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 研究区概况

毛乌素沙地位于内蒙古、宁夏、陕西三省交界处(37°31'—39°20'N、107°25'—111°22'E), 总面积约为4.22×10⁴km²。毛乌素沙地为中温带半干旱大陆性季风气候, 年均气温为7.6℃；年均降水量从西北到东南逐渐增加, 约为250—400mm, 降水主要集中在夏季和秋季；全年蒸发量约为1800—2500mm。研究区土壤以风沙土和灰钙土为主, 植被从半湿润的森林到干旱的草原和荒漠, 优势种为沙蒿(Artemisia desertorum)、红砂(Reaumuria songarica)、沙柳(Salix cheilophila)、柠条(Caragana korshinskii) 等。该地区生物结皮发育良好, 主要有藻结皮、地衣结皮和藓结皮。藻结皮多出现在灌丛间, 优势种为具鞘微鞘藻(Microcoleus vaginatus)、念珠藻(Nostoc commune)^[26]；地衣结皮的优势种是坚韧胶衣(Collema tenax)^[27], 藓结皮多分布在灌丛下, 以真藓属(Bryum argenteum)为主 ^[26]。

1.2 样品采集与处理

2021年7月在毛乌素沙地腹地选取生物结皮类型齐全的区域作为研究样地(38°42'N、110°4'E), 在样地中设置3个20m×20m的大样方(样方之间距离50m), 在每个大样方中随机选取裸沙和不同生物结皮类型(藻结皮、地衣结皮、藓结皮), 每种类型选取2个1m×1m的小样方, 用采样铲采集裸沙(0—2cm)和能够自然剥离的生物结皮层样品(不同结皮类型其厚度亦不同, 藻结皮约2—5mm, 地衣结皮10mm左右, 藓结皮约10—20mm), 3个大样方每种生物结皮或裸沙共收集6个重复样品, 最终得到24份样品。为避免样品之间的交叉污染, 取样前, 用酒精擦拭采样铲。样品取出后分别装入不同的无菌封口袋中, 并尽快运回实验室。每份样品平均分为2个分样, 一份自然风干, 用来测定土壤理化特性；一份置于-80℃冰箱内保存, 用来进行分子分析。

1.3 土壤理化因子测定

土壤pH用pH计测定；总有机碳(Total organic carbon, TOC)采用重铬酸钾—外加热法；全氮(Total nitrogen, TN)采用凯氏定氮法；铵态氮(Ammonium nitrogen, NH₄⁺-N)和硝态氮(Nitrate nitrogen, NO₃^-)采用2MKCl浸提法(5 ∶ 1)浸提, 提取液用流动分析仪测定；用磷钼蓝比色法测定全磷(Total phosphorous, TP)；用钼锑抗比色法测定有效磷(Available phosphorous, AP)。

1.4 土壤DNA提取、qPCR与高通量测序

所有DNA样品均采用SPINeasy DNA提取试剂盒(MP Biomedicals LLC, USA)提取, 结皮样品称取1g, 裸沙样品称取2g, 操作过程完全按照说明书进行。提取的DNA样品采用Nanodrop 2000测定浓度和纯度后储存在-80℃冰箱。经检测, 24份样品中, DNA质量合格的样品有19份(裸沙4份, 三种结皮类型各5份)。

采用实时荧光定量PCR方法检测样品中的固碳功能菌(IAB、IC、ID)基因丰度, qPCR扩增条件及引物序列详见表 1, 引物由上海生工有限公司合成。定量PCR 10μL反应体系包括：SsoFast Eva Green^® Supermix 5μL, 前后引物各0.5μL, 1μL浓度稀释到10ng/μL的DNA模板, ddH₂O 3μL。

表 1 引物序列及qPCR反应程序 Table 1 Primers and qPCR reaction procedures

CbbL 基因 CbbL gene	引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence	qPCR扩增程序 qPCR cycling conditions
IAB	IAB-F IAB-R	TCIGCITGRAACTAYGGTCG^[28] GGCATRTGCCAIACRTGRAT^[28]	95℃5min, 35循环(95℃30s, 54℃45s, 72℃30s), 72℃7 min
IC	IC-F IC-R	GAACATCAAYTCKCAGCCCTT^[29] TGGTGCATCTGVCCGGCRTG^[29]	95℃5min, 35循环(95℃30s, 63℃30s, 72℃30s), 72℃7 min
ID	ID-F ID-R	GATGATGARAAYATTAACTC^[30] ATTTGDCCACAGTGDATACCA^[30]	95℃5min, 35循环(95℃30s, 50℃40s, 72℃30s), 72℃7 min

表选项

本研究的测序由上海凌恩生物科技有限公司进行, 首先对IAB、IC、ID三种固碳基因进行PCR扩增, 引物序列和扩增条件同上, 扩增体系为：5×FastPfu Buffer 4μL, 2.5 mM dNTPs 2μL, 前后引物各0.8μL, FastPfu Polymerase 0.4μL, 补ddH₂O至20μL。然后构建PacBio测序文库, 并在PacBio Sequel Ⅱ平台上对浓度稀释到10ng/μL的DNA样品进行测序, 测序长度分别为IAB, 625bp；IC, 552bp；ID, 554bp。在测序中, 其中一份裸沙样品的form IAB和ID基因、两份藓结皮样品的form ID基因均无测序数据, 未统计在内。

1.5 生物信息学分析

PacBio数据下机后, 利用仪器自带的SMRTLINK(v9), 获得一致性CCS序列(circular consensus sequencing), CCS序列的准确性达到QV20(99%准确率)水平。原始reads通过SMRT Portal处理, 以筛选序列的长度和质量。通过去除barcode、引物序列、嵌合体和包含10个连续的相同碱基的序列, 获取符合要求的序列。使用UPARSE将OTU按照98.65%的相似性阈值聚类, 并使用UCHIME鉴定并去除嵌合序列。将各样品序列抽平到同一深度, 分别得到每个样品form IAB 11844条序列, form IC 13242条序列, form ID 10663条序列；利用RDP Classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)和Silva(SSU132)数据库分析每个IAB、IC和ID基因序列的系统发育关系(置信度阈值为70%), 并进行物种注释。采用单因子方差分析和多重比较(LSD)检验土壤理化特性、form IAB、IC、ID基因丰度、固碳功能菌α-多样性和物种组成在生物结皮不同演替阶段间的差异显著性, 并采用Origin2019b软件作图。Phylum(门)、Order(目)和Genus(属)分类水平上各样品的固碳功能菌群落组成用R4.2.2软件Microeco包分析。通过冗余分析比较固碳功能菌群落结构差异, 采用PERMANOVA检验群落组间差异显著性, 并通过Mantel test检验固碳功能菌群落与环境因子相关性的显著性。

2 结果与分析 2.1 土壤理化特征

裸沙阶段的土壤养分含量很低, 土壤TOC、总N和总P含量仅为(0.761±0.094)g/kg、(0.064±0.015)g/kg和(0.077±0.009)g/kg；随着生物结皮的演替, 土壤全碳(TOC)、全氮(TN)和有效磷(AP)呈现显著的上升趋势(P < 0.05), 在藓结皮达到峰值；全磷(TP)、铵态氮(NH₄⁺-N)和pH则在地衣结皮达到峰值, 在藓结皮阶段又呈下降趋势(表 2)。

表 2 土壤理化特性 Table 2 Physical and chemical properties of soil

环境因子 Environmental factor	裸沙 Bare sand	藻结皮 Algal crusts	地衣结皮 Lichen crusts	藓结皮 Moss crusts
有效磷AP Available phosphorous	1.428±0.110d	2.347±0.102c	2.870±0.129b	3.977±0.167a
全磷TP Total phosphorous	0.077±0.009d	0.427±0.042c	0.638±0.016a	0.512±0.014b
全氮TN Total nitrogen	0.064±0.015d	0.257±0.030c	0.430±0.016b	0.522±0.031a
硝态氮NO₃^--N Nitrate nitrogen	0.006±0.001b	0.011±0.001a	0.007±0.001b	0.013±0.001a
铵态氮NH₄⁺-N Ammonium nitrogen	0.003±0.002b	0.018±0.002a	0.019±0.002a	0.012±0.002a
总有机碳TOC Total organic carbon	0.761±0.094c	6.645±0.847b	10.916±0.546b	25.344±3.070a
pH	6.273±0.135b	6.778±0.071a	6.678±0.022a	6.432±0.042b
不同小写字母表示同一土壤理化性质指标在生物结皮演替各阶段的差异显著(P < 0.05)

表选项

2.2 功能基因丰度和α-多样性

毛乌素沙地生物结皮固碳功能菌中, form IC基因丰度最高, form IAB丰度次之, form ID丰度最低(图 1)。Form IAB基因丰度随结皮演替先上升后下降, 从裸沙到藻结皮有所升高, 在地衣结皮达到峰值(1.26×10⁸拷贝数/g), 显著高于其它演替阶段(P < 0.05), 而在藓结皮中又显著降低。Form IC cbbL基因丰度在10⁶拷贝数/g到10⁸拷贝数/g之间, 且随生物结皮演替的变化趋势与form IAB一致, 地衣结皮中form IC基因丰度最高。Form ID基因丰度在结皮各演替阶段均无明显差异(P>0.05)。

图 1 cbbL基因丰度随生物结皮演替的变化 Fig. 1 Changes in the abundance of cbbL gene with the succession of biological soil crusts BS：裸沙Bare sand；AC：藻结皮Algal crusts；LC：地衣结皮Lichen crusts；MC：藓结皮Moss crusts; 不同字母表示同种cbbL基因丰度在生物结皮演替各阶段的差异显著(P < 0.05)

图选项

随着生物结皮演替, form IAB的Chao1指数逐渐升高, 在藓结皮达到最高, 地衣结皮和藻结皮次之, 裸沙最低(图 2)；Shannon指数则无显著差异(图 2)。Form IC的Chao1指数随生物结皮发育呈现出先上升后下降的趋势, 在藻结皮中最高, 显著高于裸沙和藓结皮阶段(P < 0.05)；而Shannon指数在裸沙阶段最低, 在藻结皮、地衣结皮和藓结皮呈升高趋势, 但差异不显著(P>0.05)。Form ID的Chao1在藻结皮中最高, 裸沙和藓结皮次之, 地衣结皮最低；Shannon指数在生物结皮不同演替阶段无显著差异(P>0.05)。

图 2 cbbL基因α-多样性随生物结皮演替的变化 Fig. 2 Changes in the α-diversity of cbbL gene with the succession of biological soil crusts o 不同字母表示同种cbbL基因α-多样性在生物结皮演替各阶段的差异显著(P < 0.05)

图选项

2.3 固碳功能菌物种组成

在门水平上, IAB、IC和ID型固碳功能菌的优势类群是蓝藻门(Cyanobacteria), 变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿藻门(Chlorophyta)和硅藻门(Bacillariophyta)(图 3), 它们的相对丰度在生物结皮不同阶段具有明显的变化规律。蓝藻门在IAB型微生物中占据主导地位, 其在裸沙中的相对丰度明显低于生物结皮样品中的丰度。IC型固碳功能菌主要是变形菌门和放线菌门, 变形菌门的相对丰度在藓结皮最高, 藻结皮和地衣结皮次之, 裸沙阶段最低；放线菌门的丰度在裸沙最高, 在藻结皮、地衣结皮和藓结皮的丰度较低。ID型固碳功能菌中, 硅藻门的相对丰度在裸沙中最高(94.28%), 地衣结皮最低。

图 3 门水平上不同生物结皮固碳功能菌相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of carbon-fixing microbes in different biological soil crusts at phylum level

图选项

在目水平上, IAB型固碳功能菌的主要优势类群是颤藻目(Oscillatoriales), 其次是聚球藻目(Synechococcales)其相对丰度在裸沙、藻结皮、地衣结皮和藓结皮分别为(3.31%、11.66%、13.59%、25.16%)。此外生丝微菌目(Hyphomicrobiales)、Chroococcidiopsidales、念珠藻目(Nostocales)的相对丰度分别在裸沙、藻结皮和藓结皮的相对丰度较高(图 4)。IC型固碳功能菌在裸沙中物种单一, 主要有土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)、Gaiellales、颤藻目；在藻结皮、地衣结皮和藓结皮中, 土壤红杆菌目的相对丰度明显下降, 生丝微菌目、亚硝化单胞菌目(Nitrosomonadales)、红螺菌目(Rhodospirillales)明显升高, 伯克氏菌目(Burkhoolderiales)在藻结皮的丰度明显高于其它结皮类型。另外, 未知种类在生物结皮中亦占较高比例(20%—30%)。舟形藻目(Naviculales)是ID型固碳功能菌中最占优势的类群, 它们在裸地中的相对丰度最高, 藓结皮和藻结皮居中, 地衣结皮最低；桥弯藻目(Cymbellales)在裸地和藻结皮属第二优势类群；此外地衣结皮中聚球藻目、柄球藻目(Mischococcales)、颤藻目和卡盾藻目(Chattonellales)的优势度也相对较高。

图 4 目水平上不同生物结皮固碳功能菌相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of carbon-fixing microbes in different biological soil crusts at order level

图选项

在属水平, 裸沙中IAB型固碳功能菌的优势属是发毛针藻属(Crinalium)、硝化菌属(Nitrobacter)、微枝形杆菌属(Microvirga)、微鞘藻属(Microcoleus)。在藻结皮、地衣结皮和藓结皮中, 微鞘藻属和浮丝藻属(Planktothrix)均是典型的优势属, 但它们的相对丰度在不同生物结皮类型中有明显的变化, 如微鞘藻的相对丰度在藻结皮-地衣结皮-藓结皮的演替过程中呈下降趋势, 而浮丝藻呈上升趋势；除此以外, 拟甲色球藻属(Chroococcidiopsis)在藻结皮, 细鞘丝藻(Leptolyngbya)和束藻属(Symploca)在地衣结皮, 细鞘丝藻和Stenomitos在藓结皮占明显优势(表 3)。IC型固碳功能菌在裸沙中以土壤红杆菌属(Solirubrobacter)占绝对优势, 亚硝化螺菌属(Nitrosospira)在藻结皮、地衣结皮和藓结皮中均为第一优势属, Gaiella在以上三种生物结皮中亦占明显优势, 但相对丰度明显低于亚硝化螺菌属。除此以外, 土壤红杆菌属、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)在藻结皮中也占一定的优势。羽纹藻属(Pinnularia)是ID型固碳功能菌的第一优势属, 在藓结皮的丰度最高, 裸沙和藻结皮次之, 地衣结皮最低；而对纹藻属(Biremis)的相对丰度随结皮演替逐渐降低。

表 3 属水平上不同生物结皮固碳功能菌相对丰度 Table 3 Relative abundance of carbon-fixing microbes in different biological soil crusts at genus level

属名 Genus name	裸沙 Bare soil	藻结皮 Algal crusts	地衣结皮 Lichen crusts	藓结皮 Moss crusts
IAB Group
微鞘藻属Microcoleus	0.079±0.072c	0.347±0.054a	0.250±0.032ab	0.138±0.037bc
浮丝藻属Planktothrix	0.011±0.009b	0.151±0.049ab	0.164±0.043a	0.211±0.050a
发毛针藻属Crinalium	0.405±0.074a	0.023±0.008b	0.012±0.009b	0.020±0.009b
细鞘丝藻属Leptolyngbya	0.008±0.008b	0.035±0.009ab	0.068±0.006ab	0.081±0.032a
席藻属Phormidium	0.007±0.004c	0.014±0.002bc	0.053±0.014a	0.043±0.013ab
束藻属Symploca	0.007±0.006b	0.016±0.006b	0.065±0.019a	0.024±0.010b
Limnoraphis	0.003±0.003a	0.019±0.012a	0.026±0.017a	0.059±0.024a
立碗藓属Physcomitrium	0.021±0.021a	0.008±0.007a	0.041±0.016a	0.030±0.020a
拟甲色球藻属Chroococcidiopsis	0.005±0.004a	0.074±0.056a	0.012±0.002a	0.002±0.001a
Coleofasciculus	0.031±0.020ab	0.053±0.019a	0.014±0.005ab	0.005±0.002b
Stenomitos	0.000±0.000b	0.000±0.000b	0.005±0.002b	0.072±0.009a
Pantanalinema	0.002±0.002a	0.021±0.011a	0.029±0.009a	0.007±0.003a
微枝形杆菌属Microvirga	0.081±0.081a	0.000±0.000a	0.006±0.004a	0.001±0.001a
硝化菌属Nitrobacter	0.085±0.024a	0.001±0.001b	0.002±0.001b	0.000±0.000b
Myxacorys	0.000±0.000b	0.009±0.002ab	0.005±0.002ab	0.040±0.020a
念珠藻属Nostoc	0.001±0.001a	0.003±0.001a	0.004±0.002a	0.042±0.039a
Trichocoleus	0.015±0.007ab	0.029±0.012a	0.003±0.001a	0.003±0.001a
Pycnacronema	0.003±0.003a	0.013±0.005a	0.015±0.004a	0.011±0.004a
Coccobotrys	0.000±0.000a	0.001±0.001a	0.020±0.018a	0.009±0.005a
假诺卡氏菌属Pseudonocardia	0.045±0.042a	0.000±0.000b	0.002±0.001b	0.001±0.000b
IC Group
土壤红杆菌属Solirubrobacter	0.600±0.070a	0.066±0.020b	0.118±0.031b	0.054±0.011b
亚硝化螺菌属Nitrosospira	0.003±0.002b	0.139±0.035a	0.157±0.033a	0.112±0.026a
Gaiella	0.108±0.027a	0.088±0.021a	0.059±0.007a	0.093±0.030a
中慢生根瘤菌属Mesorhizobium	0.003±0.001b	0.065±0.006a	0.042±0.003a	0.054±0.015a
斯科曼氏球菌属Skermanella	0.004±0.001c	0.071±0.024a	0.055±0.008ab	0.026±0.007bc
慢生根瘤菌属Bradyrhizobium	0.011±0.003b	0.018±0.003ab	0.017±0.003ab	0.046±0.019a
Acidisphaera	0.004±0.002a	0.011±0.005a	0.025±0.018a	0.036±0.014a
酸铁杆菌属Acidiferrobacter	0.000±0.000c	0.011±0.002bc	0.023±0.004ab	0.041±0.013a
微鞘藻属Microcoleus	0.037±0.031a	0.017±0.006a	0.015±0.007a	0.002±0.001a
Sinimarinibacterium	0.000±0.000b	0.005±0.000b	0.014±0.016b	0.044±0.006a
鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas	0.002±0.001b	0.041±0.008a	0.011±0.003b	0.005±0.002b
新草螺菌属Noviherbaspirillum	0.004±0.001b	0.034±0.013a	0.007±0.002b	0.006±0.001b
类诺卡氏菌属Nocardioides	0.034±0.007a	0.008±0.002b	0.007±0.003b	0.004±0.001b
红微菌属Rhodomicrobium	0.000±0.000a	0.007±0.006a	0.013±0.008a	0.025±0.011a
微枝形杆菌属Microvirga	0.000±0.000a	0.015±0.002b	0.014±0.002b	0.009±0.002b
颤弯菌属Oscillochloris	0.005±0.001ab	0.004±0.002b	0.013±0.004a	0.013±0.003a
罗河杆菌属Rhodanobacter	0.000±0.000b	0.009±0.007ab	0.023±0.011a	0.001±0.001b
红长命菌属Rubrivivax	0.001±0.001b	0.010±0.002ab	0.005±0.001b	0.018±0.007a
根瘤菌属Rhizobium	0.001±0.000b	0.008±0.002ab	0.006±0.001b	0.018±0.007a
诺卡菌属Nocardia	0.004±0.000a	0.007±0.001a	0.008±0.001a	0.014±0.006a
ID Group
羽纹藻属Pinnularia	0.508±0.012a	0.350±0.075a	0.206±0.106a	0.552±0.130a
对纹藻属Biremis	0.186±0.006a	0.174±0.044a	0.132±0.049a	0.087±0.041a
细鞘丝藻属Leptolyngbya	0.015±0.015a	0.003±0.002a	0.191±0.091a	0.066±0.066a
异极藻属Gomphonema	0.071±0.002a	0.071±0.013a	0.033±0.016a	0.044±0.006a
Fibrocapsa	0.003±0.003a	0.052±0.029a	0.085±0.053a	0.032±0.025a
Luticola	0.050±0.011a	0.059±0.008a	0.012±0.004b	0.036±0.019ab
微鞘藻属Microcoleus	0.002±0.002b	0.006±0.004b	0.092±0.034a	0.005±0.002b
Sphaerosorus	0.005±0.005a	0.008±0.005a	0.071±0.060a	0.003±0.001a
Pleurochloris	0.000±0.000a	0.006±0.038a	0.041±0.000a	0.000±0.000a
辐节藻属Stauroneis	0.004±0.000a	0.028±0.010a	0.003±0.001a	0.016±0.013a
双眉藻属Amphora	0.014±0.002a	0.019±0.002a	0.007±0.002a	0.017±0.009a
Coleofasciculus	0.001±0.001a	0.026±0.012a	0.006±0.002a	0.002±0.002a
拟气球藻属Botrydiopsis	0.002±0.002a	0.002±0.001a	0.030±0.028a	0.001±0.000a
发毛针藻属Crinalium	0.000±0.000a	0.019±0.019a	0.004±0.004a	0.009±0.009a
Scoliopleura	0.013±0.009a	0.018±0.012a	0.000±0.000a	0.000±0.000a
贝氏藻属Berkeleya	0.018±0.015a	0.003±0.001a	0.002±0.002a	0.014±0.009a
马鞍藻属Campylodiscus	0.008±0.005a	0.008±0.003a	0.002±0.002a	0.006±0.002a
Gogorevia	0.009±0.006a	0.004±0.001ab	0.001±0.001b	0.009±0.004a
Gaiella	0.007±0.006a	0.009±0.007a	0.001±0.001a	0.001±0.001a
Schizostauron	0.004±0.000a	0.005±0.000a	0.003±0.001a	0.005±0.003a
不同小写字母表示属水平上同一固碳功能菌相对丰度在生物结皮演替各阶段的差异显著(P < 0.05)

表选项

2.4 影响固碳功能菌群落的关键环境因子

固碳功能菌群落在生物结皮不同演替阶段均具有明显的差异, 藻结皮和地衣结皮之间IAB和IC型固碳功能菌群落无明显分离, 表示其群落结构类似, 但与裸沙、藓结皮有明显的分离, 表明其群落差异较明显(图 5)。PERMANOVA分析进一步揭示, IAB型固碳功能菌群落在裸沙与地衣结皮和藓结皮、藻结皮与藓结皮之间均有显著差异(P < 0.05), 裸沙与藻结皮、藻结皮与地衣结皮、地衣结皮与藓结皮之间的群落差异不显著(P>0.05)(表 4)。IC型固碳功能菌在裸沙与藻结皮和藓结皮、藻结皮与藓结皮间表现出极显著的群落差异(P < 0.01), 裸沙与地衣结皮之间也具有显著差异(P < 0.05)。此外, ID型固碳功能菌群落在生物结皮演替各阶段之间无显著差异(P>0.05)。

图 5 生物结皮不同演替阶段固碳功能菌群落结构与环境因子的冗余分析(RDA) Fig. 5 Redundancy analysis (RDA) of community structure of carbon-fixing microbes and environmental factors at different succession stages of biological soil crusts NO₃^--N：硝态氮Nitrate nitrogen；TOC：总有机碳Total organic carbon；AP：有效磷Available phosphorous；TN：全氮Total nitrogen；TP：全磷Total phosphorous；NH₄⁺-N：铵态氮Ammonium nitrogen

图选项

表 4 固碳功能菌群落组间差异 Table 4 Differences between carbon-fixing microbial communities

CbbL 基因 CbbL gene	生物结皮类型 Types of biological soil crusts	藻结皮 Algal crusts	地衣结皮 Lichen crusts	藓结皮 Moss crusts
IAB	裸沙Bare sand	0.051	0.031^*	0.017^*
	藻结皮Algal crusts		0.068	0.017^*
	地衣结皮Lichen crusts			0.153
IC	裸沙Bare sand	0.008^**	0.016^*	0.009^**
	藻结皮Algal crusts		0.589	0.008^**
	地衣结皮Lichen crusts			0.255
ID	裸沙Bare sand	0.429	0.098	0.902
	藻结皮Algal crusts		0.054	0.927
	地衣结皮Lichen crusts			0.106
及 *表示同一类型固碳功能菌群落结构在生物结皮不同演替阶段间差异显著(P < 0.05)及极显著(P < 0.01)

表选项

RDA分析表明, 全磷(TP)、全氮(TN)、速效磷(AP)、铵态氮(NH₄⁺-N)、土壤总有机碳(TOC)和pH与固碳功能菌群落有明显的相关性(图 5)。Mantel test进一步证明, AP、TP、TN、NH₄⁺-N和pH均极显著影响IAB和IC型固碳功能菌的群落结构(P < 0.01)(表 5), TOC显著影响IAB型固碳功能菌群落结构(P < 0.05), 与IC型固碳功能菌群落则表现出极显著相关性(P < 0.001)。此外, IAB型固碳功能菌群落中聚球藻目与AP呈极显著正相关关系(P < 0.01), 与TOC和TN呈显著正相关, TP与生丝微菌目呈显著负相关(图 6)。IC型固碳功能菌群落中TOC、AP、TN与生丝微菌目和涅瓦菌目(Nevskiales)、TP与生丝微菌目和亚硝化单胞菌目均呈极显著正相关关系(P < 0.01)；而AP、TN、TP和NH₄⁺-N与土壤红杆菌目呈极显著负相关关系(P < 0.01)。

表 5 环境因子对固碳功能菌群落结构的影响 Table 5 Effects of environmental factors on the community structure of carbon-fixing microbes

环境因子 Environmental factor	IAB group		IC group		ID group
环境因子 Environmental factor	P	Sig	P	Sig	P	Sig
有效磷AP Available phosphorous	0.003	**	0.001	***	0.925
全磷TP Total phosphorous	0.003	**	0.001	***	0.681
全氮TN Total nitrogen	0.003	**	0.001	***	0.756
硝态氮NO₃^--N Nitrate nitrogen	0.306		0.038	*	0.910
铵态氮NH₄⁺-N Ammonium nitrogen	0.001	***	0.001	***	0.732
总有机碳TOC Total organic carbon	0.033	*	0.001	***	0.651
pH	0.002	**	0.008	**	0.995

表选项

图 6 环境因子与目水平上固碳功能菌关键物种的相关性 Fig. 6 Correlation between environmental factors and key species of carbon-fixing microbes at order level

图选项

3 讨论 3.1 固碳功能菌群落随结皮演替的变化

多数研究表明, 生物结皮演替促进土壤养分积累, 改变土壤理化特性^[31—32]。本研究表明, 土壤全碳、全氮和有效磷随着生物结皮的演替, 呈现显著的上升趋势, 在藓结皮最高；全磷、铵态氮和pH则在地衣结皮达到峰值, 这表明生物结皮的演替改变了土壤理化特征, 加之生物结皮演替过程中藻类-地衣-苔藓生物类群的变化为自养微生物提供了不同的微生境(生态位), 导致固碳功能菌群落组成和生物量的变化。在本研究中, 裸地cbbL基因丰度最低且IAB型固碳功能菌以蓝藻中的颤藻目种类为主, 在养分匮乏的荒漠生态系统中, 蓝藻颤藻目中的微鞘藻属(Microcoleus)、席藻属(Phormidium)和颤藻属(Oscillatoria)是生物结皮的优势物种或常见物种^[33—34], 它们能够适应养分贫瘠的极端干旱环境, 是荒漠生物结皮中的先锋生物^[7]。随着丝状蓝藻在裸地上的生长与繁殖, 蓝藻分泌的胞外多糖对土壤颗粒的粘结作用和藻丝对土壤颗粒的捆绑作用, 使松散的土壤颗粒形成藻结皮, 并逐渐发育成地衣结皮^[33]。本研究藻结皮和地衣结皮中IAB型固碳功能菌以蓝藻占绝对优势(相对丰度分别是89.65%和78.68%), 这说明蓝藻在藻结皮和地衣结皮光合固碳功能中发挥着关键作用, 它们向土壤中输入的有机碳使土壤肥力明显增加, 促使生物结皮进一步发育演替^[35—36]。另外, 本研究藓结皮中IAB型固碳功能菌的蓝藻丰度明显低于藻结皮, 其原因可能是蓝藻与苔藓植物存在竞争, 藓结皮中的苔藓植株个体较大、密度较高, 蓝藻得不到充足的光照和营养, 在资源竞争中处于不利地位导致蓝细菌的相对丰度下降^[37]；加之生物结皮的演替提高土壤的环境条件, 利于异养微生物的生长, 导致其它异养微生物挤占了蓝藻的生存空间^[38]。在生物结皮演替过程中的另一个明显变化是颤藻目呈下降趋势, 具固氮功能的念珠藻目和球形的聚球藻目丰度升高, 这说明生物结皮演替后期养分相对丰富, 能支持更多的物种。

除蓝藻外, 本研究发现变形菌门与放线菌门是IC型固碳功能菌的优势类群, 其中放线菌门的土壤红杆菌目(Soilrubrobacterales)和Gaiellales在裸沙阶段占优势, 变形菌门的生丝微菌目(Hyphomicrobiales)、亚硝化单胞菌目(Nitrosomonadales)、红螺菌目(Rhodospirillales)的相对丰度在藻结皮、地衣结皮和藓结皮明显升高。研究发现, 古尔班通古特沙漠裸沙中非蓝藻自养微生物在IC型固碳功能菌中占优势, 它们多与放线菌门和变形菌门的物种有关^[23]。放线菌是沙漠土壤中的优势群体, 因其能以丝状方式生长而可有效降低干旱、高温和辐射所带来的损害^[39]。变形菌门是生物结皮中的常见类群, 它们可以产生胞外多糖在土壤固定和生物结皮形成过程中发挥重要作用^[40—42]。在澳大利亚西部半干旱区, 发现藻结皮微生物群落以变形菌门的根瘤菌目和蓝藻门的色球藻目、念珠藻目为主, 地衣结皮的优势类群是酸杆菌目、红螺菌目、放线菌目和变形菌门的未知类群^[43]。在不同生物结皮类型中, IC型固碳功能菌的变化可能与不同物种的耐贫瘠程度和土壤的养分差异有关, 但仍需实验室生理培养数据的进一步证实。

3.2 环境因子对固碳功能菌群落的调控作用

碳、氮、磷是构成生命的基本元素物质, 同时是调控微生物生长和代谢的重要元素^[44]。本研究发现, 有机碳、全N、全P和速效P是影响固碳功能菌的关键环境因子。在生物结皮演替过程中, 细菌-藻类-地衣-苔藓等关键生物类群的变化影响其光合固碳过程, 致使光合速率及有机碳含量均呈显著升高趋势^[45]。Lange等研究发现, 生物结皮的演替显著影响其光合速率, 藻类的光合速率较低而地衣结皮和藓结皮的光合速率较高^[46]。而土壤有机质是陆地生态系统最重要的基础物质, 决定着生态系统的功能和可持续性^[44]。本研究中, 土壤总有机碳含量(TOC)显著、极显著影响IAB和IC型固碳功能菌群落, 并与IAB、IC型固碳功能菌群落中的多数物种呈显著正相关, 如聚球藻目和生丝微菌目, 这一方面表明固碳功能菌在生物结皮固碳中的贡献, 另一方面也说明土壤有机碳通过对固碳功能菌机体构成、生理调控而影响其群落结构。相关研究表明, 在植被稀疏、水分匮乏的干旱半干旱地区, 生物结皮是地表碳固定的重要贡献者, 生物结皮中的蓝藻、绿藻、苔藓、地衣等均能通过光合作用固定大气中的CO₂, 除此以外, 变形菌门、放线菌门和厚壁菌门、绿弯菌门也含有丰富的固碳功能菌^[47]。生物结皮演替过程中逐渐增加的TOC为异养细菌和真菌提供了能源物质, 它们吸收并分解有机质的同时释放出氮磷等元素, 又给固碳功能菌的生长发育提供了养分。氮素是生物生长所需的大量元素, 也是土壤生产力的主要限制因素。对于微生物而言, 氮是微生物生长和代谢的关键元素^[44]。生物结皮中的固氮蓝藻和一些含有固氮酶活性的异养细菌能够通过固氮作用将大气中的N₂有效转化成NH₄+进入土壤。多数研究表明, 在生物结皮演替早期, 固氮蓝细菌是主要的固氮功能群, 随着生物结皮的演替, 念珠藻目、红螺菌目、根瘤菌目等异养固氮菌成为了地衣及苔藓结皮的主要固氮类群, TN含量随生物结皮演替呈显著的增加趋势^[42]。在藏北高原不同海拔土壤中, cbbL基因丰度与NH₄⁺-N含量呈正相关, 表明NH₄⁺-N含量的增加刺激了固碳功能菌的生长^[48]。土壤氮素是构成固碳功能菌细胞的重要元素, TN和NH₄⁺-N含量的增加给生物结皮中固碳功能菌的生长提供了充足的养分, 进而调控固碳功能菌的群落结构。除碳、氮外, 磷也是微生物生长的关键营养元素, 土壤微生物体内的磷一般占其体内元素的2%—10%, 主要来自土壤和生物残体降解过程中磷的同化^[44]。土壤有效磷是土壤磷素中易被生物利用的部分, 有效磷含量的变化显著影响着土壤微生物的生命过程^[49]。生物结皮演替能显著提高土壤全磷和速效磷含量^[50], 本研究中TP和AP极显著影响着固碳功能菌群落结构, 随着生物结皮的发育, TP、AP含量逐渐升高, 变形菌、放线菌、酸杆菌等解磷微生物将土壤中难以吸收利用的磷转化成微生物可吸收利用的磷素^[51], 进而提供给固碳功能菌, 促进其生长代谢。此外, 本研究中, pH也对固碳功能菌群落产生了显著影响, 多数研究表明土壤pH值是驱动微生物群落结构变化的关键环境因子, pH主要通过H⁺浓度改变土壤中营养元素的形态从而影响固碳功能菌类群^[52—53]。

4 结论

毛乌素沙地生物结皮的演替对cbbL基因丰度、α多样性、固碳功能菌物种组成及群落结构有显著影响。生物结皮中的固碳功能菌主要包括蓝细菌门、变形菌门、放线菌门和硅藻门, 目水平上, 颤藻目、土壤红杆菌目、生丝微菌目、亚硝化单胞菌目、红螺菌目是固碳功能菌的关键类群。IAB和IC型固碳功能菌在门、目和属水平上的相对丰度以及群落结构在生物结皮不同演替阶段均具明显差异, 其群落结构主要受土壤总有机碳(TOC)、全氮(TN)、铵态氮(NH₄⁺-N)全磷(TP)、有效磷(AP)和pH的综合调控。生物结皮演替过程中生物类群和土壤理化特征的改变为固碳功能菌提供了不同的生态位, 通过对固碳功能菌的筛选和调控作用, 最终改变固碳功能菌群落组成和结构。

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