长江水系作为我国最大的淡水生态系统, 其中的淡水渔业资源量一直处于我国各水系的最高水平^[1]。为了保护长江渔业资源, 自2020年1月1日起我国在长江流域实施为期十年的禁渔计划, 并全面禁止天然渔业资源的任何生产性捕捞。利用网捕、笼捕、甚至电捕等方式的传统渔业资源调查方法在禁渔期间将受到较大限制, 且长期使用传统渔业资源调查方法, 不仅会影响到鱼类自身生存(特别是对于那些野生资源量已经处于较低水平的濒危珍稀鱼类), 还会一定程度地破坏水域生态环境^[2—3]。此外, 受传统调查方法所使用网具选择性, 以及某些鱼类个体小、数量少、善隐蔽等因素的影响, 导致实际鱼类多样性调查结果被低估的现象时有发生^[4—5]。因此, 单靠传统渔业资源调查方法可能已无法满足当下长江鱼类多样性保护的全面要求, 亟需探索新的渔业资源调查与监测方法。

近年来, 随着分子生物学技术的高速发展, 以环境DNA(Environmental DNA, eDNA)检测为核心的物种监测方法, 即eDNA技术开始兴起^[6—8]。eDNA是指能够从水体、土壤、沉积物、空气等环境介质中提取到的不同物种DNA片段的总和, 其主要来源包括生物体的皮肤细胞、粘液、排泄物、卵子或精子等^[9]。eDNA技术则是通过从环境样本中富集、提取上述eDNA样本(即DNA片段), 并对其进行扩增、测序和生物信息学分析, 进而确定取样环境中的生物物种组成、分布状况、遗传多样性等^[10—11]。eDNA技术以无创采样、方便高效和检测灵敏度高等优势弥补了传统渔业资源调查方法的不足, 逐渐发展为一种新型的水生生物资源调查手段, 近几年也已被广泛应用于濒危珍稀鱼类监测、水生外来或入侵生物监测、渔业资源生物量评估、鱼类多样性调查等水生态研究领域^[2,8,12]。目前, 运用eDNA技术监测长江流域鱼类多样性的可行性已得到部分研究的验证, 调查范围覆盖了长江干流(包括上、中、下游)^[13—19]、部分支流(包括嘉陵江、赤水河、乌江、汉江、赣江、雅砻江、秦淮河等)^[20—27]和长江口^[28]。

綦江作为长江上游右岸的一级支流, 发源于贵州省桐梓县东北部山区, 北流至石门坎进入重庆市境内, 后经綦江区城区, 在江津区仁沱镇汇入长江^[29]。自1952至2018年由于航道运输和水电开发等原因, 重庆市在綦江中共建成9座水坝, 自下游至上游分别为五福电站坝、车滩电站坝、桥溪口电站坝、大常电站坝、大华电站坝、石溪口电站坝、珠滩电站坝、盖石洞电站坝、羊蹄洞电站坝。已有研究表明, 在河道中建造水坝会对水域生态及鱼类群落有诸多不利影响, 包括破坏河流的连通性, 影响鱼类洄游, 引起生境破碎化和水文情势改变等, 这也是造成全球淡水鱼类多样性下降的主要原因之一^[30—37]。本研究便针对上述研究结果, 采用eDNA技术对水坝阻隔下綦江不同区段的鱼类物种组成与多样性开展研究, 以探究水坝对不同鱼类的阻隔效应。此外, 将传统渔业资源调查方法与eDNA技术调查结果进行比较, 探讨eDNA技术在长江水系鱼类监测中的应用前景, 以期为禁渔期间长江水系的鱼类多样性监测提供基础数据和技术支持。

1 材料与方法 1.1 基于eDNA技术的綦江鱼类组成调查 1.1.1 水样的采集与处理

本研究监测水域为綦江重庆段的江津区下坝镇至綦江区赶水镇江段, 长度约80 km, 共涉及9座水坝, 在每座水坝的下游设置采样点, 将9个采样点自下游至上游依次编号为Ⅰ至Ⅸ(图 1), 9座水坝的基本情况见表 1, 各采样点的经纬度见表 2。于2021年5月使用全新采样瓶在各采样点采集2 L表层水样, 每个采样点平行采集2瓶水样进行混合, 混合完成后低温保存。每个采样点设置1个采样阴性对照。将采集的所有水样24 h内带回实验室, 先低温静置沉淀1 h后使用混合纤维素滤膜(0.45 μm孔径)进行抽滤, 并将滤膜装入10 ml无菌无酶的离心管, 置于-80℃条件下冷冻保存, 以备后续eDNA的提取和分析。阴性对照水样同样采用上述方法处理。为避免样品间的交叉污染, 每次抽滤开始前及结束后均使用次氯酸钠溶液对所用器材进行消毒处理。

1.1.2 eDNA提取

将含有eDNA的滤膜使用HiPure Water DNA Kit试剂盒(美基生物, 中国)进行DNA提取, 每张滤膜独立提取, 并设置空白滤膜作为阴性对照来评估提取过程是否存在污染。然后, 使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量, 并将提取的DNA样品放入-80℃冰箱保存。

1.1.3 目的基因扩增及高通量测序

利用鱼类通用引物MiFish-U/E(MiFish-U-F: 5′-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3′和MiFish-U-R; 5′-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3′)对12s rRNA的高变区进行扩增, 具体方法参照Miya等^[38]。PCR反应体系(20 μL)为：5×缓冲液4 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL、Taq DNA聚合酶0.4 μL、DNA模板1 μL、正反引物(5 μmol/L)各0.8 μL, 最后加入11 μL ddH₂O。PCR仪采用的是ABI GeneAmp^®9700, 反应程序为：预变性95℃ 5 min, 变性95℃ 30 s, 退火59℃ 30 s, 延伸72℃ 45 s, 变性-退火-延伸反应循环数为35, 终延伸72℃ 10 min。每个样本均使用ddH₂O为模板进行PCR阴性对照来评估扩增过程是否存在污染。扩增结束后将产物混合, 并使用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。检测合格后, 使用凝胶回收试剂盒对产物进行回收, 并使用Illumina NovaSeq 6000测序平台(上海凌恩生物科技, 中国)进行高通量测序。

1.1.4 鱼类物种比对

将高通量测序所得序列经过去除引物、质控过滤、组装拼接和去除嵌合体等步骤处理后得到有效序列, 按照相似度≥97%的条件对有效序列进行OTU(Operational Taxonomic Units)聚类分析。此处的OTU, 又称操作分类单元, 是指通过序列间的相似性将测序读数分组, 从而产生读数簇, 该簇即被称为OTU^[39], 理想情况下每个OTU都应该代表一个实际物种。为了得到每个OTU对应的物种分类信息, 将OTU代表序列与美国国家生物技术信息中心数据库(National Center for Biotechnology Information, NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对、分类注释, 实现各物种在界、门、纲、目、科、属、种分类水平上的可视化。对注释结果进行人工校对, 剔除比对到的非鱼类数据信息后, 统计得到各采样点的鱼类物种组成, 最后参照《中国内陆鱼类物种与分布》^[40]完善鱼类分类学信息。

1.2 基于传统渔业资源调查方法的綦江鱼类组成调查

本研究统计了2002年1月至2023年4月西南大学渔业资源环境研究中心基于传统渔业资源调查方法(采样渔具包括长度为20—50 m, 高度为3—4 m, 网目为3—11 cm的三层定置刺网, 以及长度为8—20 m, 网目为2 cm的地笼)调查的綦江鱼类组成数据。鱼类样本的物种鉴定参照《中国鱼类系统检索》^[41]、《中国动物志· 硬骨鱼纲· 鲤形目(下卷)》^[42]等, 并将上述鱼种调查结果与相关历史文献资料进行逐一比对^[43—45], 最终统计得到基于传统渔业资源调查方法的綦江鱼类物种组成。

1.3 数据处理与分析 1.3.1 珍稀特有鱼类统计

根据《国家重点保护野生动物名录》、《重庆市重点保护野生动物名录》和《长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区科学考察报告》^[46], 统计基于eDNA技术与传统渔业资源调查方法的綦江鱼类组成中的国家级保护鱼类、重庆市重点保护鱼类与长江上游特有鱼类。

1.3.2 鱼类生态类型划分

参考相关历史文献资料^[43—45], 通过对基于eDNA技术检测到的綦江鱼类栖息水层、生境偏好进行整理分析后, 对其生态类型进行划分：首先, 根据栖息水层划分为中上层鱼类、中下层鱼类和底层鱼类3种类型；其次, 根据对流水生境的喜好程度划分为喜流水鱼类与喜静缓流鱼类。对基于传统渔业资源调查方法调查到的綦江鱼类, 同样进行上述生态类型划分。

1.3.3 鱼类物种多样性分析

采用G-F指数^[47—48]分析基于eDNA技术所获得的綦江鱼类物种多样性, 计算公式如下：

F指数(D_F) (表示科间的多样性)：

式中, P_i＝S_ki/S_k, S_ki为k科i属中的物种数, S_k为k科中的物种数, n为k科中的属数, m为科数。

G指数(D_G) (表示属间的多样性)：

式中, q_j＝S_j/S, S_j为j属中的物种数, S为物种数, p为属数。

G-F指数(表示鱼类物种多样性)：

G-F指数的测度区间为0—1, 非单个物种的科越多, G-F指数数值越大。

1.3.4 鱼类物种相似性分析

采用Jaccard相似性系数^[49—50]分析基于eDNA技术检测到的綦江各采样点与全流域, 以及每一采样点与其相邻后一采样点间的鱼类物种相似性, 计算公式如下：

式中, C_i为相似性系数, A、B分别为群落A和群落B中的物种数, AB为群落A和群落B中的共有物种数。当C_i数值为75%—100%时, 属极相似；为50%—75%时, 属中等相似；为25%—50%时, 属中等不相似；为0—25%时, 属极不相似。

1.3.5 数据处理

数据处理使用Microsoft Excel 2019, 图表绘制使用Origin 2021(Origin Lab)和Microsoft PowerPoint 2019。

2 结果 2.1 基于eDNA技术的綦江鱼类物种组成

根据OTU聚类分析和物种注释结果, 本研究共检测出鱼类59种, 隶属于7目16科49属, 其中仅食蚊鱼(Gambusia affinis)1种外来鱼类(表 3)。从目水平来看, 鲤形目(Cypriniformes)的种类最多, 共有41种, 约占本次调查鱼类物种总数的69.49%；其次是鲇形目(Siluriformes), 共有9种, 约占15.25%；再次是鲈形目(Perciformes), 共有5种, 约占8.47%；鲟形目(Acipenseriformes)、颌针鱼目(Beloniformes)、合鳃鱼目(Synbranchiformes)和鳉形目(Cyprinodontiformes)的种类最少, 均只检测出1种(表 3)。从科水平来看, 鲤科(Cyprinidae)的种类最多, 共有33种, 约占55.93%；其次是花鳅科(Cobitidae)和鲿科(Bagridae), 均为5种, 约占8.47%(表 3)。

本研究共检测出12种珍稀特有鱼类, 其中, 国家级保护鱼类4种, 包括长江鲟(Acipenser dabryanus)、长薄鳅(Leptobotia elongata)、岩原鲤(Procypris rabaudi)、长鳍吻鮈(Rhinogobio ventralis)；重庆市重点保护鱼类2种, 包括中华沙鳅(Botia superciliaris)、白缘鱼央(Liobagrus marginatus)；长江上游特有鱼类10种, 包括长江鲟、长薄鳅、岩原鲤、长鳍吻鮈、四川华吸鳅(Sinogastromyzon szechuanensis)、半䱗(Hemiculterella sauvagei)、张氏䱗(H. tchangi)、厚颌鲂(Megalobrama pellegrini)、华鲮(Sinilabeo rendahli)、宽体沙鳅(B. reevesae) (表 3)。此外, 本研究所检测出的鱼类中, 按栖息水层划分, 底层鱼类的种类数最多, 共有36种, 约占鱼类物种总数的61.02%；其次是中上层鱼类, 共有13种, 约占22.03%；中下层鱼类最少, 共有10种, 约占16.95%。按对流水生境的喜好程度划分, 喜流水鱼类共有33种, 约占鱼类物种总数的55.93%；喜静缓流鱼类共有26种, 约占44.07%(表 3)。

2.2 基于eDNA技术的綦江不同区段鱼类物种多样性、相似性及生态类型

基于eDNA技术在綦江的Ⅰ至Ⅸ采样点检测出的鱼类物种数分别为59、47、46、30、27、23、21、18、16, 即自下游至上游检出鱼类物种数逐渐减少, 且呈阶梯式下降, 采样点Ⅸ检出鱼类物种数仅为采样点Ⅰ检出鱼类物种数的27.12%(16:59)(表 3)。此外, 本研究检出的12种珍稀特有鱼类中, 在采样点Ⅰ全部检出；在采样点Ⅱ检出4种, 包括岩原鲤、半䱗、张氏䱗、厚颌鲂；在采样点Ⅲ检出4种, 包括岩原鲤、半䱗、张氏䱗、白缘鱼央；在采样点Ⅳ及之后的上游采样点均未检测到珍稀特有鱼类(表 3)。

从物种多样性来看, 采样点Ⅰ的F指数、G指数、G-F指数均最大, 而采样点Ⅸ的上述指数均最小, 且自采样点Ⅰ至Ⅸ的F指数、G指数、G-F指数总体均呈逐渐减小的趋势(表 4)。从物种相似性来看, 采样点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与全流域间的鱼类物种相似性系数分别为100%、79.66%、77.97%, 属极相似；采样点Ⅳ为50.85%, 属中等相似；采样点Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ分别为45.76%、38.98%、35.59%、30.51%、27.12%, 属中等不相似(图 2)。此外, 采样点Ⅰ与Ⅱ、Ⅲ与Ⅳ之间的鱼类物种相似性系数分别为73.77%、65.22%, 属中等相似；而采样点Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ与Ⅴ、Ⅴ与Ⅵ、Ⅵ与Ⅶ、Ⅶ与Ⅷ、Ⅷ与Ⅸ之间分别为89.80%、90.00%、81.19%、91.30%、85.71%、88.89%, 属极相似(图 2)。

从生态类型来看, 按栖息水层划分, 在采样点Ⅰ至Ⅸ, 底层鱼类的物种数均最多。但是从下游至上游, 底层鱼类的物种数量百分比由61.02%(采样点Ⅰ, 36:59)减小至56.25%(采样点Ⅸ, 9:16)；中上层鱼类由22.03%(采样点Ⅰ, 13:59)增大至25.00%(采样点Ⅸ, 4:16)；中下层鱼类由16.95%(采样点Ⅰ, 10:59)增大至18.75%(采样点Ⅸ, 3:16)。按对流水生境的喜好程度划分, 在采样点Ⅰ, 喜流水鱼类的物种数较喜静缓流鱼类多；在采样点Ⅱ至Ⅸ, 均为喜流水鱼类的物种数较喜静缓流鱼类少；且自采样点Ⅰ至Ⅸ, 喜流水鱼类物种数与喜静缓流鱼类物种数的比值由33:26变为4:12, 呈减小趋势(图 3)。

2.3 基于传统渔业资源调查方法的綦江鱼类物种组成

综合历次调查数据与历史文献资料, 传统渔业资源调查方法在綦江重庆段共监测到鱼类92种, 隶属于7目17科64属, 其中包括食蚊鱼和散鳞镜鲤(Cyprinus carpio haemato pterus Temm.et Sch)2种外来鱼类。从目水平来看, 鲤形目的种类最多, 共有71种, 约占历史调查鱼类物种总数的77.17%；其次是鲇形目, 共有10种, 约占10.87%。从科水平来看, 鲤科的种类最多, 共有56种, 约占60.87%；其次是花鳅科, 共有8种, 约占8.70%。传统渔业资源调查方法共监测到18种珍稀特有鱼类, 其中, 国家级保护鱼类5种, 包括胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)、长薄鳅、长鳍吻鮈、多鳞白甲鱼(Onychostoma macrolepis)、四川白甲鱼(O. angustistomata)；重庆市重点保护鱼类3种, 包括鳤(Ochetobius elongates)、中华沙鳅、白缘鱼央；长江上游特有鱼类13种, 包括长薄鳅、半䱗、张氏䱗、厚颌鲂、华鲮、长鳍吻鮈、宽体沙鳅、中华金沙鳅(Jinshaia sinensis)、四川华吸鳅、四川白甲鱼、圆筒吻鮈(R. cylindricus)、短体副鳅(Homatula potanini)、西昌华吸鳅(S. sichangensis) (表 3)。此外, 基于传统渔业资源调查方法监测到的綦江鱼类中, 按栖息水层划分, 同样是底层鱼类的种类数最多, 共有52种, 约占鱼类物种总数的56.52%；中上层鱼类与中下层鱼类的物种数相等, 各有20种, 分别占21.74%。按对流水生境的喜好程度划分, 喜流水鱼类共有56种, 占鱼类物种总数的60.87%；喜静缓流鱼类共有36种, 占39.13%(表 3)。

2.4 基于eDNA技术与传统渔业资源调查方法的綦江鱼类物种组成比较

研究结合eDNA技术与传统渔业资源调查方法所得调查结果, 发现历史上共有96种鱼类分布在綦江中。其中, 基于eDNA技术与传统渔业资源调查方法均监测到的鱼类有55种, 约占綦江鱼类物种总数的57.29%(55:96) (表 3, 图 4)。此外, 相较于传统渔业资源调查方法, 基于eDNA技术新检测到的鱼类有4种, 包括长江鲟、岩原鲤、乐山小鳔鮈(Microphysogobio kiatingensis)、长蛇鮈(Saurogobio dumerili)；未检测到的鱼类有37种, 包括胭脂鱼、多鳞白甲鱼、四川白甲鱼、短体副鳅、斑点蛇鮈(S. punctatus)等(表 3)。

3 讨论 3.1 基于eDNA技术与传统渔业资源调查方法的綦江鱼类物种组成分析

綦江作为长江的一级支流, 其与长江干流交汇江段属长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区的缓冲区^[46], 且在每年2至5月春季繁殖季节, 许多生活于长江上游干流的鱼类会洄游至綦江中繁殖产卵, 例如胭脂鱼、长鳍吻鮈、华鲮、中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)等^[43—45]。因此, 綦江自身的水生态环境, 及其中的鱼类物种组成对长江上游鱼类多样性保护具有重要意义。运用eDNA技术调查了綦江中的鱼类物种组成, 共检测出鱼类59种, 其中仅食蚊鱼1种外来鱼类。从目水平来看, 鲤形目的种类最多, 其次是鲇形目；从科水平来看, 鲤科的种类最多, 其次是花鳅科和鲿科(表 3)；上述调查结果与其他研究或历史文献资料中所描述的长江上游鱼类区系组成特征基本一致^[40,43—46]。此外, 本研究基于eDNA技术共检测出12种珍稀特有鱼类, 包括4种国家级保护鱼类、2种重庆市重点保护鱼类和10种长江上游特有鱼类(表 3)。这一调查结果也与就近江段的鱼类资源调查结果类似^[15,46], 例如王梦等^[15]基于eDNA技术对长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区重庆段鱼类多样性开展了相关研究, 共检测出鱼类74种, 其中就有国家级保护鱼类2种, 长江上游特有鱼类10种, 重庆市重点保护鱼类6种(原文为1种), 以及外来鱼类8种。

对基于eDNA技术检测出的鱼类进行了生态类型划分, 结果表明按栖息水层划分, 綦江中的底层鱼类种类数最多；按对流水生境的喜好程度划分, 喜流水鱼类的种类数较喜静缓流鱼类偏多(表 3)。分析原因不难发现：首先, 綦江的河流底质多由卵石、砂砾石和沙泥质组成, 这为底层鱼类的生存(包括摄食、繁殖、躲避敌害等)提供了适宜的底质环境；其次, 綦江中险滩较多, 且具有水流较急的原始生境特征^[29,51]。因此, 綦江自身的底质环境与生境特征可能是造成其中鱼类上述生态类型划分结果的重要原因。综合上述所有分析结果, 可以发现基于eDNA技术获得的綦江鱼类物种组成与其他在就近江段的调查或研究结果相似, 且上述鱼类物种组成所对应的生态类型划分结果与綦江生境特征相符。

基于传统渔业资源调查方法在綦江监测到的92种鱼类无论是鱼类区系组成特征、生态类型划分结果还是外来鱼类组成均与eDNA检测结果相近。另外, 基于eDNA技术与传统渔业资源调查方法均监测到的鱼类共有55种(图 4), 约占eDNA检测鱼类物种总数的93.22%, 以及传统渔业资源调查方法调查到鱼类物种总数的59.78%, 表明本研究基于eDNA技术所获鱼类物种数量较传统渔业资源调查方法所获鱼类物种数量明显偏低, 但考虑到参考的物种注释数据库(NCBI)尚不完善, 以及目前eDNA技术具有的其他缺陷(例如部分鱼种eDNA的存留时间较短、无法精准区分近缘鱼种等), eDNA检测结果仍具有较高可信度, 可用于后续綦江不同区段鱼类物种多样性、相似性及生态类型分析。

3.2 基于eDNA技术的綦江不同区段鱼类物种多样性、相似性及生态类型分析

从基于eDNA技术在各采样点检测出的鱼类物种数, 及计算所得相关F指数、G指数、G-F指数来看, 綦江不同区段的鱼类物种多样性存在明显差异, 且呈现出自下游至上游阶梯式下降的趋势(表 4)。上述綦江鱼类物种多样性的变化特征符合河流生态系统中鱼类空间分布格局的普遍规律, 即随着河流上游至下游的非生物、生物因子和生态过程的纵向梯度变化, 鱼类群落结构也随之发生相应的梯度变化, 并表现出物种丰富度逐渐增加的普遍规律^[52—54]。郭宁宁等^[22]基于eDNA技术研究了赤水河212 km河道中鱼类多样性分布特征后, 发现随着赤水河上游至下游海拔的逐渐降低(高度落差可达1254 m), 赤水河上游至下游的鱼类物种数逐渐增多, 且上游鱼类物种数约占总数的49.35%(38:77)。綦江9个采样点之间的河道长度与海拔高度落差分别约为80 km与125 m, 但是在采样点Ⅸ检测出的鱼类物种数却仅占总数的27.12%(16:59)。因此, 不难发现綦江中鱼类物种多样性的纵向梯度变化幅度远大于保持自然流态的赤水河, 本研究调查水域内的9座水坝可能是造成上述差异的重要原因。换言之, 綦江中的梯级水坝对鱼类在不同区段种群间的交流与扩散(包括迁入、迁出, 以及洄游)造成了明显的阻隔效应。

从鱼类物种相似性来看, 本研究基于eDNA技术检测出的59种鱼类在采样点Ⅰ均被检测到, 且有3个采样点与全流域间的鱼类物种相似性属极相似, 1个采样点属中等相似, 5个采样点属中等不相似(图 2)。此外, 每一采样点与其相邻下一采样点间的鱼类物种相似性有6个组属极相似, 2个组属中等相似(图 2)。上述研究结果表明受多个大坝阻隔的两个采样点间的鱼类物种相似性较单个大坝阻隔的两个相邻采样点间的鱼类物种相似性低。已有研究表明在天然河流中建设水坝往往会导致河流物理、化学、地貌和水文特征的剧烈变化, 而当这些变化来自多个水坝时, 累积效应会被放大, 并对其中的鱼类物种组成造成比单个水坝更显著的影响^[23,30—37]。被水坝分隔的綦江不同区段鱼类物种多样性与相似性分析结果均印证了上述推论, 即本研究调查区域内的9座水坝对綦江不同区段间鱼类扩散的阻隔及对綦江流水生境的破坏较单个水坝更加严重。

各采样点检测出的鱼类物种中, 首先按对流水生境的喜好程度划分, 仅在采样点Ⅰ喜流水鱼类物种数较喜静缓流鱼类多, 且自下游至上游, 喜流水鱼类物种数与喜静缓流鱼类物种数之间的比值逐渐减小(表 3, 图 3)。梯级水坝对河流水文环境最直接的影响便是将原本自然流淌的河流转变成多个类湖泊的深水水库, 梯级水库蓄水运行导致部分鱼类产卵场被淹没, 并阻断了鱼类的洄游通道, 致使需要流水刺激才能完成产卵繁殖的喜流水鱼类以及需要洄游活动来完成生活史鱼类的物种数量及其占比自下游至上游逐渐减小(包括长江鲟、长鳍吻鮈、华鲮、四川华吸鳅等)^{[43—45,55—56]}。与之相反, 喜静缓流鱼类的繁殖一般不需要流水刺激, 也不需要洄游活动来完成其生活史, 从而使得喜静缓流鱼类的物种数量及其占比自下游至上游逐渐增大。其次按栖息水层划分, 各采样点底层鱼类物种数占比均最多, 但是从下游至上游, 底层鱼类的物种数量百分比逐渐减小, 而中上层和中下层鱼类的物种数量百分比逐渐增大(图 3)。究其原因, 綦江中的多数底层鱼类多以底栖无脊椎动物或着生藻类为食(包括岩原鲤、中华倒刺鲃、中华沙鳅等)^[43—45], 而此类食性鱼类分布会更容易受到梯级水库蓄水运行的影响^[32—33]。对比分析上述生态类型划分结果, 对梯级水坝响应较为敏感的鱼类生态类型划分标准为生境偏好, 即根据对流水生境的喜好程度划分。此外, 本研究检出的12种珍稀特有鱼类仅在采样点Ⅰ全部检出, 采样点Ⅱ和Ⅲ各检出4种, 其余采样点均未检出, 而外来鱼类(食蚊鱼)则在所有采样点检出。综合上述研究结果, 綦江的梯级水坝对喜流水和洄游性鱼类, 以及底层鱼类具有较明显的阻隔效应, 且上述鱼种多属长江上游珍稀特有鱼类。这一研究结果与陈美玲^[32]、杨志^[33]有关梯级水电开发对鱼类分布和鱼类群落影响的研究结果基本一致。由于本研究未采用传统渔业资源调查方法监测綦江不同区段的鱼类物种组成, 基于传统方法和eDNA技术所得綦江不同区段鱼类多样性研究结果的差异还有待进一步验证与探讨。

3.3 eDNA技术在长江水系鱼类物种组成调查与监测中的应用前景

近年来, 随着eDNA技术的发展, 其已逐渐成为水生生物多样性和群落结构评估的一个潜在工具。按照研究水域、方法论、优缺点等将目前基于eDNA技术开展的我国内陆水域鱼类物种组成调查与监测的研究进行了综述, 具体见表 5。eDNA技术的实验流程一般可概括为“野外样品采集→eDNA捕获→eDNA提取→目的基因扩增与测序→物种注释→后续分析”, 而不同实验方法(包括采集水样体积、滤膜孔径与材质、DNA提取方法、引物等)的选择会显著影响从样品中获得DNA的浓度, 并最终影响到鱼类物种组成的分析结果^[8,21]。

在野外样品采集中, 由于各研究水域的水质, 以及研究目标差异等原因, 采集的水样体积一般在0.5—20 L不等, 现有研究中采用最多的为2 L (表 5)。在滤膜的选择上, 综合抽滤时间和DNA捕获量考虑, 现有研究中使用最多的是孔径大小为0.45 μm的混合纤维素膜(表 5)。王月^[21]比较了6种不同材质滤膜(硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、聚碳酸酯膜、聚四氟乙烯膜、混合纤维素膜、尼龙膜)的DNA捕获总量, 结果显示混合纤维素膜的捕获效果显著优于其它5种材质的滤膜。此外, 王月^[21]用5种不同的DNA提取方法(酚氯仿异戊醇法、高盐法、磁珠法、Qiagen DNeasy PowerWater Kit、Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit)进行实验, 结果表明使用Qiagen DNeasy PowerWater Kit提取的DNA所得ddPCR产物浓度显著高于其它4种方法, 且现有研究中最常用的也是Qiagen DNeasy PowerWater Kit(表 5)。从引物选择来看, 目前最常用的是Miya等^[38]基于12S rRNA基因的一个高变区(163—185 bp)开发的鱼类通用引物(即MiFish) (表 5)。最后, 当进行物种注释时, 目前使用最多的是NCBI(表 5)。然而, 也有部分学者指出现有公共数据库的完整性和准确性仍不够, 因此在进行eDNA检测之前应先构建本地鱼种数据库^[21,27,57]。

eDNA技术作为一种新型的水生生物资源和生态学调查手段, 现有研究结果表明将其应用于鱼类物种监测时, 相较于传统渔业资源调查方法, 其在很多方面都能体现出显著优势。例如, eDNA技术应用过程中的时间和人力成本较低^{[13,21,23—24,57—66]}；对采样生境及对象无破坏和损伤^{[13—14,21,23—24,28,57—59,61,63,65,67]}；能够有效减少物种鉴定过程中的主观差异^{[15,26,63,68]}；不受物种各生活史时期的限制^[22,59]等(表 5)。此外, 许多研究还指出eDNA技术检测灵敏度高, 适用于监测种群密度较低、样本采集困难的物种, 如珍稀特有和外来入侵物种以及小型鱼类^{[13—14,17,20—22,57—60,63,65,67]}。研究结果也印证了这一结论, 即本研究使用eDNA技术检测到了传统渔业资源调查方法未监测到的珍稀特有鱼类(包括长江鲟和岩原鲤)和小型鱼类(包括长蛇鮈和乐山小鳔鮈) (表 3)。但应指出的是, eDNA技术应用于鱼类物种监测时, 仍然存在以下缺点和局限性：eDNA的产生、降解和移动除受到鱼类不同生活史阶段的影响之外, 还受到水温、pH、流速等诸多水环境因素的影响^{[13,20—24,32,61,67]}；由于通用引物对同源鱼种的区分度不够, 部分近缘鱼种无法区分, 并且引物还可能存在一定的扩增偏向性^{[13—14,18—19,28,60,66]}；eDNA技术还存在尚无统一的标准化操作规范、无法获得目标鱼种各生长发育阶段的生物学特征、无法准确评估目标鱼种的位置信息、无法实现鱼类的绝对定量(包括体重体长组成、年龄结构、性比等种群结构特征)、数据库生物信息缺失及精准度不够、易出现“假阳性”或“假阴性”, 以及eDNA随气候、地域、季节的不规律变化会影响监测结果等问题^{[14,21,23—24,28,57,69,62—68,70—72]}。研究中也存在部分通过传统渔业资源调查方法监测到的物种未被eDNA技术检出的现象。引起这一现象的原因：首先, 可能与调查的水域范围有关, 历史调查的水域范围涵盖了綦江干流及其河汊, 本研究的9个采样点位于綦江干流的江津区和綦江区共80 km江段, 未检测到的鱼种可能分布于綦江的其它江段或河汊中；其次, 可能与eDNA采样次数较少有关, 本研究统计了2002年1月至2023年4月通过传统渔业资源调查方法监测到的鱼种, 而采用eDNA技术检测的结果仅来自于2021年5月一次性采集的水样, 因此eDNA检测的结果可能没有历史数据全面；最后, 可能是eDNA检测结果出现了“假阴性”, 本研究选用的引物和物种注释参考数据库均可能导致“假阴性”的出现。使用的MiFish引物虽然是目前鱼类多样性研究中应用最广, 扩增效果最好的鱼类通用引物, 但该引物仍然具有对近缘鱼种的分辨率不高, 种属间区分度有限等问题^[12,28,60]。此外, 参考的物种注释数据库(NCBI)可能缺乏部分特有物种及新物种(例如斑点蛇鮈)的序列信息, 从而导致这类鱼种无法被准确注释^{[14,28,61,64,66,69—70,72]}。综上, 研究基于eDNA技术对綦江鱼类多样性的调查结果基本可信, 但不可否认的是, 目前eDNA技术应用于我国内陆水域鱼类资源调查过程中仍具有诸多缺点和局限。因此, 在现有研究基础和背景条件下, 在我国内陆水域, 包括长江水系鱼类物种监测中, 如果用于物种注释的本地鱼种数据库已根据传统渔业资源调查结果进行了充分补充和完善, 采用eDNA技术进行鱼种调查基本可行, 且应适当增加eDNA的采集次数(例如每个季度或逐月采样), 能够得到更全面的检测结果；否则, 应将eDNA技术与传统渔业资源调查方法进行适当结合, 进而有效提高调查结果的全面性与可信度。

4 结论

综上所述, 研究运用eDNA技术在綦江共检测出鱼类6科49属59种, 其中包含12种珍稀特有鱼类, 59种鱼类中以鲤形目为主, 约占总数的69.49%。通过传统渔业资源调查方法历史上在綦江共监测到鱼类7目17科64属92种。综合两种方法的监测结果, 綦江共有鱼类96种, 且两种方法共同监测到的鱼种共55种, 约占鱼种总数的57.29%。由于受到梯级水坝蓄水运行的不利影响, 研究基于eDNA技术的鱼类监测结果表明綦江不同区段的鱼类物种多样性、各采样点与全流域间的鱼类物种相似性均呈现出自下游至上游阶梯式降低的趋势。此外, 多个梯级水坝造成的这一影响较单个水坝更加严重, 同时梯级水坝对喜流水和洄游性鱼类, 以及底层鱼类具有较明显的阻隔效应, 且上述鱼种多属长江上游珍稀特有鱼类。在现有研究基础和背景条件下, 如果用于物种注释的本地鱼种数据库已充分完善, 将eDNA技术应用于长江水系的鱼类监测总体可行；否则, 应将eDNA技术与传统渔业资源调查方法进行适当结合以得到更为全面、可信的调查结果。