食性分析是动物生态学研究的重要组成部分, 有助于揭示动物的饮食结构、觅食策略和栖息地选择偏好, 以及评估物种生存状况和种间关系等^[1]。食性研究对于濒危野生动物的保护管理具有了解其生存威胁、制定更有效的保护策略、对同域分布物种合理划分保护区、预测其种群数量等重要意义^[2—3]。

传统的食性研究方法主要包括通过观察取食行为的野外扫描取样法、笼养饲喂法、胃内容物法、粪便显微分析法等^[3], 其中扫描取样法需要长期对野生动物进行跟踪及采集植物对野生动物进行投喂, 工作效率低且不能得到较完整的食物组成^[4]；依赖于显微观察的显微分析法主要是观察粪便中残留的食物残渣以鉴别食物种类, 由于动物消化能力的差异及研究者鉴别水平的差异无法较为准确的得到完整的食物组成^[5]。而新兴的DNA宏条形码技术利用动物粪便DNA的高通量测序结果进行物种鉴定, 相较于传统的研究方法体现出鉴别效率高、结果准确率高等优势^[6]。该技术主要通过序列相似度进行物种鉴别, 这对研究者的植物识别能力要求较低且不受主观因素的干扰^[7], 但物种鉴别的准确率很大程度上受参考数据库的影响, 不完整的参考数据库会使得DNA条形码的鉴别能力大幅下降^[8]。

DNA宏条形码技术已被广泛应用于野生灵长类动物的食物组成、觅食策略、种间关系分析和物种保护等方面^[9—14]。研究发现灵长类动物不单以植物为食, 还会取食节肢动物、水生生物甚至小型哺乳动物, 其中鞍背柽柳猴(Saguinus fuscicollis)会取食蜘蛛类、甲虫类和蚁类等节肢动物以补充体内所需的蛋白质和能量^[9], 研究发现日本猕猴(Macaca fuscata)捕食蟹类、褐鳟(Salmo trutta)等其他水生动物^[10], 而在非洲的倭黑猩猩(Pan paniscus)的粪便中发现了坦桑尼亚小羚羊(Cephalophus spadix)等哺乳动物的DNA, 之前野外观察的结果也能证实其取食哺乳动物^[11]。基于DNA宏条形码技术的食性研究发现, 白脸卷尾猴(Cebus capucinus)不同年龄或不同性别的个体通过取食不同种类的昆虫规避种内竞争^[12]。马达加斯加同域分布的10种灵长类动物通过取食树冠层的不同的植物资源和节肢动物, 以实现资源的合理分配及种间共存^[13]。通过研究云南怒江金丝猴(Rhinopithecus strykeri)的食性, 对保护区内怒江金丝猴喜食的植物进行重点保护, 以促进其野外种群恢复^[14]。

川金丝猴(R. roxellana)是我国特有的灵长类动物, 属于国家一级重点保护野生动物^[15], 《中国脊椎动物红色名录》易危(VU)物种^[16]。川金丝猴分化为三个亚种, 其中指名亚种(R. roxellana roxellana)分布于四川的岷山山系和邛崃山系, 秦岭亚种(R. roxellana qinlingensis)分布于秦岭山系, 而神农架国家公园则是川金丝猴湖北亚种(R. roxellana hubeiensis)的唯一分布区^[17]。目前我国野生川金丝猴总数约为23000只, 其中湖北亚种的野外种群数量最少, 仅有1500余只, 在三个亚种之中面临最大的灭绝风险^[17]。神农架金丝猴是神农架国家公园的旗舰物种和指示性物种, 在维系森林群落结构与生态功能的完整性, 动植物协同进化上发挥着极其重要的作用, 保护和研究意义重大^[18]。目前对川金丝猴的食性研究已有较多报道, 但研究方法主要为传统的野外观察法及显微分析法等, DNA宏条形码技术尚未应用于川金丝猴的食性研究 ^[19—21]。

本研究以神农架国家公园的大龙潭野外川金丝猴补食群为研究对象, 通过采集不同季节的川金丝猴新鲜粪便, 利用DNA宏条形码技术分析神农架川金丝猴的食物组成及多样性的季节差异, 为川金丝猴的饲喂繁育和保护管理提供参考价值。

1 研究方法 1.1 研究对象

神农架国家公园的大龙潭野外川金丝猴补食群数量约为80只, 该猴群主要活动在大龙潭区域内的龙潭湾、三岔沟、龙林沟、观音洞等地(31.4903°—31.4916°N, 110.2974°—110.2988°E), 平均海拔2243m。该区域的植被类型为巴山冷杉(Abies fargesii)、华山松(Pinus armandii)和红桦(Betula albosinensis)的针阔混交林^[22]。为保证该种群的长期生存和开展川金丝猴的野外研究, 在食物短缺的冬季对川金丝猴进行人工补食, 补食食物包括苹果、红薯和胡萝卜等^[23]。

1.2 样品采集

于2023年冬季(2月)、春季(5月)和秋季(10月)分别采集了川金丝猴补食群的新鲜粪便样品。采集时佩戴一次性无菌手套, 将疑似金丝猴的粪便样品装入含干燥剂的收集管中, 并在收集管上标注采集时间和样品编号。采集时避免在同一地点多次采集, 同时收集大小、颜色不一致的粪便以确保收集到多只个体的粪便。待粪便样品干燥后放入冰箱-40 ℃保存, 野外工作结束后带回实验室处理^[24]。共采集疑似川金丝猴粪便样品133份, 其中冬季50份, 春季42份, 秋季41份。

1.3 样品DNA提取及PCR扩增和测序

使用Qiagen Stool DNA试剂盒(Qiagen, Valencia, California, USA)提取样品中的DNA。提取完成后使用分光光度计对DNA溶液进行浓度和纯度的测定。

选用Riaz等人设计的脊椎动物通用引物12SV5(F: TAGAACAGGCTCCTCTAG；R: TTAGATACC CCACTATGC)对样品DNA进行扩增用于鉴别粪便的物种来源^[25]。PCR反应程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 循环45次；72 ℃延伸5 min。使用植物叶绿体基因trnL片段(g：GGGCAATCCTGAGCCAA；h：CATTGAGTCTCTGCACCTATC)对粪便样品中的植物DNA进行扩增^[26], PCR反应程序为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 循环35次; 72 ℃延伸2 min。PCR体系总体积为20 μL：DNA模板(10—50 ng/μL)2 μL；2×Taq Master Mix 10 μL；正反向引物(10μmol/L)各0.5 μL；ddH₂O 7 μL。扩增时在正向和反向的5′端各添加8 bp条形码序列, 以区分不同的样品。PCR扩增产物于Illumina HiSeq 2500测序平台进行高通量测序, PCR扩增及测序由广东美格基因科技有限公司完成。

1.4 测序数据处理

使用Vsearch v2.22.1对测序结果进行处理, 首先对每个样品的正反向序列进行裁剪、拼接, 将相同季节的样品测序结果合并, 并对来自不同样品的序列添加标签。之后过滤长度过长或过短的序列及累积碱基错误率高于1%的低质量序列, 然后去除重复序列及单一读数序列, 再使用uchime2功能去除包含嵌合体的序列^[27]。去除嵌合体序列后以97%的相似度阈值对结果进行聚类, 剔除单一读数序列后将每条序列记为一个分子可操作分类单元(molecular operational taxonomic unit, MOTU)。

1.5 参考数据库的建立及物种注释

对每个各样品的12S条形码测序结果与NCBI(national center for biotechnology information)的GeneBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中川金丝猴的12S序列进行比对, 进行粪便的物种鉴定。舍弃其他物种的粪便样品, 保留川金丝猴的粪便样品进行食源植物的物种注释。

综合神农架国家公园植物名录及已有神农架川金丝猴食源植物研究结果整理出包括1309种植物的神农架国家公园川金丝猴食源植物参考名录^[28—29], 从GeneBank和EMBL(european molecular biology laboratory, https://www.ebi.ac.uk)等数据库共检索到参考名录中1185种植物的trnL序列信息, 使用BLAST+(v2.15.0)软件将检索到的植物序列建立为DNA条形码的参考数据库。

将trnL条形码测序结果与建立的植物数据库进行相似度比对, 物种注释的原则为：(1)与单一物种序列的相似度≥98%, 记为该物种(2)与多个物种序列的相似度≥98%时, 记为能够涵盖所有物种≥98%的最低分类单元。(3)比对结果中, 最高相似度＜98%且≥95%时, 相似度最高序列仅有1条, 且与得分次之的序列一致度差距≥1%时, 记为相似度最高序列的上一级分类单元。最高一致度对应有多个物种时, 则记为能够涵盖所有最高相似度的物种最低分类单元。(4)比对结果中, 最高相似度 < 95%时, 认为无法判定该序列的分类单元, 不计入食性结果^[30]。

1.6 食性分析

将同一季节的川金丝猴粪便样品测序结果合并处理得到该组的食性结果。为判断取样量是否充分, 使用R软件vegan包绘制物种累积曲线图, 同时计算不同组别的Simpson指数D、Shannon指数H、Pielou指数J以比较川金丝猴的食物多样性差异^[31]。具体计算方法如下：

(1)

(2)

(3)

(4)

式中, S为MOTU总数；P_i为某MOTU的相对序列丰度(relative read abundance, RRA/%)；R_i为某组中第i个MOTU的序列读数。

2 结果 2.1 物种鉴定

采集的133份粪便样品均扩增出目的条带并进行物种鉴定, 鉴定结果显示127份粪便为川金丝猴的粪便, 其中冬季50份, 春季40份, 冬季37份。

2.2 神农架川金丝猴食性分析

对上述127份粪便样品进行trnL区域的PCR扩增测序, 分别对3个季节的MOTU进行物种注释, 共得到127个物种类别, 其中79个鉴定到种水平, 占比为62%；38个仅鉴定到属水平, 占比为30%；10个仅鉴定到科水平, 占比为8%。不同季节的MOTU物种注释结果见表 1。

物种累积曲线显示样品数量大于30时, 鉴定得到的物种数趋于稳定, 因此说明本研究的样品数量足以表征金丝猴粪便中的植物种类(图 1)^[32]。

在科水平上, 食物种类涵盖了62个科, 其中相对序列丰度较高的5个优势科为：蔷薇科(Rosaceae, 37.70%)、猕猴桃科(Actinidiaceae, 11.33%)、茄科(Solanaceae, 8.62%)、无患子科(Sapindaceae, 4.88%)和山茱萸科(Cornaceae, 4.45%)。

在属水平上, 食物种类涵盖了110个属, 其中相对序列丰度较高的5个优势属为：花楸属(Sorbus, 25.27%)、地海椒属(Archiphysalis, 8.73%)、藤山柳属(Clematoclethra, 8.63%)、委陵菜属(Potentilla, 8.13%)和槭属(Acer, 4.94%)。

在种水平上, 共鉴定出79种食物。其中相对序列丰度较高的5个优势种为：地海椒(18.20%)、藤山柳(Clematoclethra scandens)(17.99%)、委陵菜(Potentilla chinensis)(16.95%)、菱叶茴芹(Pimpinella rhomboidea)(8.89%)和勾儿茶(Berchemia sinica)(7.51%)。

神农架川金丝猴不同季节的食物组成详见附表 1。

2.3 神农架川金丝猴食物组成的季节变化

不同季节川金丝猴的食物组成也有一定差异, 川金丝猴在春季的偏好食物为花楸属一种(27.34%)和藤山柳(16.56%)；秋季的偏好食物是委陵菜(22.12%)和花楸属一种(16.52%)；冬季的偏好食物为地海椒(33.49%)和花楸属一种(28.13%)不同季节的食物组成见图 2。

从不同季节川金丝猴食物种类venn图中可以看出不同季节的食物重叠情况, 3个季节的共有食物有20种, 冬季的特有食物有16种, 春季有29种, 秋季有27种, 分别占植物总数的15.75%、12.60%、22.83%和21.26%。三个季节的共有食物包括勾儿茶、喜阴悬钩子(Rubus mesogaeus)、湖北三毛草(Sibirotrisetum henryi)、花楸属一种、槭属一种(Acer sp.)和山茱萸属一种等, 冬季特有食物主要有地海椒、青荚叶(Helwingia japonica)、连香树(Cercidiphyllum japonicum)、云杉属一种(Picea sp.)和鼠李属一种(Rhamnus sp.)等, 春季特有食物主要包括菱叶茴芹、鄂西卷耳(Cerastium wilsonii)、活血丹(Glechoma longituba)和五味子属一种(Schisandra sp.), 秋季特有食物包括构树(Broussonetia papyrifera)、栾树(Koelreuteria paniculata)、枫杨(Pterocarya stenoptera)和漆树(Toxicodendron vernicifluum)等。春季和秋季之间的重叠食物种类最多有舌叶金腰(Chrysosplenium glossophyllum)、委陵菜和茶藨子(Ribes janczewskii)等35种, 春季和冬季的重叠食物种类有巴山冷杉(Abies fargesii)、勾儿茶和藤山柳等32种而冬季和秋季重叠食物种类最少仅有宜昌橙(Citrus cavaleriei)、皂荚(Gleditsia sinensis)和接骨木(Sambucus williamsii)等28种, 分别占总数的27.56%和22.83%(图 3)。

2.4 神农架川金丝猴食物多样性的季节变化

使用R软件vegan程序包计算不同季节川金丝猴食物的多样性指数, 比较发现川金丝猴在春季的食物多样性最高, 秋季次之, 冬季最低。而春季的Pielou均匀度指数最高即食物种类分布最均匀, 冬季均匀度指数最低, 在3个季节中分布最不均匀(表 2)。

3 讨论

研究印证了传统的神农架川金丝猴食性研究结果^[33], 并进一步丰富了川金丝猴的食物组成。研究结果的食源植物种类虽小于传统食性研究的结果, 但在科(62)和属(110)水平上均高于传统食性研究结果, 这表明DNA条形码技术可能较传统的方法鉴定出更多的食源植物类群。食性结果中的地海椒、委陵菜和菱叶茴芹等草本植物在已有的川金丝猴食性研究结果中并未出现, 可能是因为显微分析法等难以鉴别粪便中残留的草木植物, 而野外观察法鉴定草木植物的识别率不高, 使得传统的食性结果中草木植物在川金丝猴的食物组成中占比较低^[33]。发现了神农架川金丝猴食物组成中未记录过的食物, 如箭竹属植物, 但在四川白河川金丝猴和白马雪山的滇金丝猴(R. bieti)食物中均发现过箭竹属植物, 因此推测神农架川金丝猴可能取食箭竹属植物的叶片或者取食其竹笋^[34—35]。在梅花鹿(Cervus nippon)和豹猫(Prionailurus bengalensis)等动物的食性研究中也发现基于DNA条形码研究方法比传统的研究方法能够得到更丰富的食物组成^[36—37]。

食性研究结果表明神农架国家公园川金丝猴补食群的食物组成存在季节差异, 冬季食物多样性维持在最低水平, 春季食物多样性明显升高, 秋季时又开始下降, 这与神农架植物群落物候特性是一致的^[38]。在冬季, 川金丝猴喜食植物的叶片、花和果实已经凋落, 而且降雪过后林下的草本植物也被覆盖, 川金丝猴的可获得食物数量锐减。除此之外, 植物的营养成分随季节的变化也对川金丝猴的食物组成造成了影响, 从冬季至春季神农架川金丝猴栖息地内的植物种类和营养成分含量不断变化, 致使川金丝猴的食物组成也发生变化^[39]。

建立了川金丝猴食物DNA条形码参考数据库, 包括了神农架国家公园分布的1185种植物参考序列。但是数据库中缺失松萝属植物及神农架部分特有种的trnL序列片段, 因此食性结果中未鉴别出金丝猴经常取食的松萝(Usnea diffracta)。表明建立本地植物的序列数据库相比于使用公共数据库具有更高的物种鉴别率, 特别是在种和属的级别上^[40—41]。但由于序列信息均来自于公共数据库, 其中存在的错误序列也会对鉴别结果造成一定影响, 因此建立本地化的物种序列数据库仍是非常重要的^[42]。

DNA条形码的选择也是影响物种鉴定分辨率的重要因素, 选用的trnL为叶绿体DNA片段, 因此仅能用于识别含叶绿体的部分植物, 由于trnL条形码在同属近缘种之间的鉴别成功率较低, 因此部分植物仅鉴定到属水平。鉴定出的127种食物中, 有60%左右的食物鉴定到物种级别, 这与所选择的DNA条形码鉴别率有很大关系。用于植物鉴别的条形码包括trnL、ITS、rbcL、matK等, 不同条形码的鉴别率有所差异^[43]。表明条形码组合使用有更高的识别成功率, 如rbcL和matK组合使用对物种的识别率高达98%^[44]。因此, 未来的食性研究中应选用多种条形码进行物种鉴别以提高物种鉴别精确度。

使用DNA条形码技术得到了神农架川金丝猴不同季节的食物组成, 证实了DNA条形码技术在野生灵长类动物食性研究中的可行性, 为植食性动物的食性研究提供了方法借鉴。基于食性结果, 可以为川金丝猴野外种群的补食和笼养群的人工饲养制定更科学的食谱, 同时对川金丝猴主要取食的植物重点保护, 以促进其栖息地的恢复和野外种群数量的增长。本研究仍存在一定的不足, 虽然在样本采集过程中通过大小、形态及采集地点尽可能地收集不同个体的粪便, 但是仍可能存在来自同一个体的粪便样本, 这会对研究结果的准确性造成影响。因此, 使用本方法时应对粪便样本进行个体识别, 在食性分析时排除来自同一个体的粪便样本。样品采集时间仅选取了, 春季、秋季和冬季三个时间段, 缺少川金丝猴食物种类可能最为丰富的夏季。川金丝猴取食昆虫和脊椎动物已有报道^[45—46], 还有待对其粪便中存在的动物DNA进行分析, 以便得到更为完整的川金丝猴食物组成。