集约化和大规模的连年种植是现代农业生产管理的主要栽培模式, 即同一作物在同一地块上连续种植多年。而这种栽培模式通常会导致连作障碍, 造成植物生长发育缓慢, 生产力和活力降低。事实上, 连作问题在三七(Panax notoginseng)^[1]、半夏(Pinellia ternate)^[2]和太子参(Pseudostellaria heterophylla)^[3]等药用植物的集约化栽培中普遍存在。光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)为豆科甘草属的多年生草本植物, 其根及根状茎是一味极其重要的中药材, 对肺炎、肺通道炎症和肺结核等疾病具有很好的疗效^[4]。然而农业生产实践发现, 光果甘草患有严重的连作障碍, 具体表现为：植株生长发育不良, 根腐现象频繁发生, 药材品质下降, 产量降低^[5]。

土壤微生物是影响植物生长发育的重要因素, 其群落结构的改变是造成植物连作障碍的主要原因之一^[6]。一方面, 微生物可将土壤中的有机物质分解为植物生长所需的营养元素, 相比于非根际土壤, 根际土壤微生物的分解效率更高^[7]。另一方面, 微生物分泌的某些次生代谢产物, 如赤霉素、黄酮类物质等均会影响植物的生长发育^[8—9]。因此, 越来越多的研究试图从植物根际土壤微生物群落结构和多样性的角度评估其对连作障碍的影响。然而, 不同种类的植物发生连作障碍的机制不尽相同^[10—12]。近几年关于光果甘草的生产调研发现, 农田生产系统中常采用轮作的模式缓解连作障碍, 而有关光果甘草连作障碍发生原因及作用机制的研究尚未见报道。本研究利用高通量测序技术, 对比分析了不同种植年限的光果甘草根际土壤微生物群落的变化, 尝试从微生态系统变化的角度阐明光果甘草连作障碍的发生原因, 以期为缓解和消除连作障碍, 保障光果甘草的可持续发展提供科学依据。

1 材料及方法 1.1 样品采集

采样点位于新疆塔城地区甘草种植基地, 土壤类型为沙质土。在种植本轮甘草之前, 该样地长期种植玉米, 且样地水肥管理方式一致。

本研究采集生长了1a(Gg1)和5a(Gg5)的光果甘草根际土壤, 以及同一地块中未生长任何植物的土壤(Control), 每种处理重复取样三次。试验期间样地的田间管理措施, 如水肥管理等, 均保持一致。根际土采集参照张敏^[13]的方法。

1.2 土壤微生物DNA的提取及生物信息学分析

土壤样品中微生物DNA的提取, 物种注释和生物信息学分析参照张敏等^[13—14]的方法进行。

1.3 统计分析

土壤样品数据的的统计分析参照张敏^[13]的方法进行。

2 结果与分析 2.1 测序数据分析

通过分析土壤样品的测序数据, 可分别得到细菌和真菌有效序列645813条和716706条。细菌和真菌的平均长度分别为419 bp和237 bp。以97%的一致性进行聚类分析, 共获得4261个细菌OTUs(Operational taxonomic units)和2127个真菌OTUs, 每一个样品OTUs的覆盖度均在98%以上, 该结果说明本研究测序深度合理, 检测结果包含了土壤中绝大部分的细菌及真菌, 具有良好的代表性。

2.2 Alpha多样性分析

由图 1和图 2可知, Gg5的细菌Chao1指数是Control和Gg1的1.07倍, 真菌的Chao1指数分别是Control和Gg1的90.47%和87.69%, 该结果表明光果甘草的连续种植增加了细菌群落的丰富度, 降低了真菌群落的丰富度(P>0.05)。

2.3 Beta多样性分析

PCoA(principal co-ordinates analysis, PCoA)分析结果可解释光果甘草根际土壤细菌(图 3)和真菌(图 4)群落总变化的91.93%和87.18%。如图所示, Control、Gg1和Gg5在PC2轴上存在明显间隔, 该结果表明, 甘草的连续种植可显著改变其根际土壤微生物的群落结构。

2.4 土壤微生物群落差异性分析

LEfSe分析可判断各处理组中有显著差异的群落。如图所示, 光果甘草连作系统中有63个细菌(图 5)和57个真菌群落(图 6)表现出显著差异(Biomarker)。在属水平上, Gg5中有3个属的细菌存在显著差异, 分别为Amycolatopsis、Buchnera和Subdoligranulum, 在所有属中, Amycolatopsis的LDA score最高; Gg5中有4个属的真菌存在显著, 分别为Psathyrella、Nematoctonus、Coprinopsis和Rhizophagus, 其中Psathyrella的LDA score最高; Gg1中有9个属的细菌存在显著差异, 分别为Arthrobacter、Methylophilus、Hymenobacter、Romboutsia、Dyadobacter、Arcticibacter、Verrucomicrobium、Rubritepida和Modestobacter, 其中Arthrobacter的LDA score最高, 在Gg1中起着重要的作用; Gg1中差异显著的真菌属有5个, 分别为Dothiora、Rosellinia、Arthrobotrys和Podospora, 其中Dothiora的LDA score最高; 在未种植甘草的对照中差异显著的细菌属有4个, 分别为Polycyclovorans、Silvanigrella、Candidatus Solibacter和Sorangium, 真菌属有6个, 别为Collarina、Preussia、Chrysosporium、Pseudeurotium、Suillus和Kodamaea, 其中Collarina的LDA score最高。

2.5 土壤微生物门水平相对多度

在门水平上, Gg1和Gg5及Control的微生物群落组成具有一定的相似性。三者优势度相对较大的细菌门均为Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Bacteroidetes、Chloroflexi和Verrucomicrobia, 平均相对多度分别为36.24%, 18.34%, 13.52%, 9.28%, 8.33%, 4.82%和2.76%(图 7)。优势度相对较大的真菌门均为Ascomycota、Basidiomycota和Mortierellomycota, 平均相对多度分别为24.67%、17.99%和4.49%(图 8)。

但Control、Gg1和Gg5的微生物群落组成也存在一定的差异。Control中Gemmatimonadetes的相对多度显著高于Gg5和Gg1(P < 0.05), Acidobacteria的相对多度显著高于Gg5, 而Actinobacteria的相对多度显著低于Gg5。Gg5中Blastocladiomycota及Mortierellomycota的相对多度显著高于Gg1。

2.6 土壤微生物属水平相对多度

在所有土壤样品中相对多度排名前10的细菌属为Arthrobacter、Sphingomonas、Thiopseudomonas、Marinobacterium、Pseudomonas、Haliangium、Halomonas、Blastococcus、Steroidobacter和Terrimonas, 平均相对多度分别为4.42%、2.52%、2.45%、2.19%、1.30%、1.15%、1.06%、0.95%、1.30和0.80%。相对多度排名前10的真菌属为Psathyrella、Fusarium、Mortierella、Pseudogymnoascus、Polythrincium、Naganishia、Leptosphaeria、Thielavia、Plectosphaerella和Myrothecium, 平均相对多度分别为13.54%、5.78%、3.90%、3.68%、3.30%、2.63%、1.31%、0.81%、0.42%和0.38%。

统计学分析表明, 在所有检测到的550个细菌属和260个真菌属中, 分别有28个细菌属和7个真菌属的相对多度在各处理间发生显著变化(表 1)。其中大部分物种相对多度的变化均发生在Control和Gg1之间以及Control和Gg5之间, 如Caenimonas、Blastococcus、Iamia、Reyranella等。该结果表明, 光果甘草的种植显著影响其根际土壤微生物群落的组成。而在光果甘草连作系统中, Gg5中细菌属Brevundimonas、Arthrobacter、Pseudomonas、Sorangium以及真菌属Rhizopus、Naganishia、Polythrincium的相对多度显著低于Gg1, 细菌属Kribbella和Pseudolabrys以及真菌属Psathyrella、Fusarium和Thanatephorus的相对多度显著高于Gg1。

3 讨论

根际土壤微生物群落的改变是造成作物连作障碍的重要原因之一, 而植物的次生代谢产物, 如来自根系分泌物、凋落物、植物残茬等, 在土壤中的常年积累是诱导土壤微生物群落变化的关键因子^[15—17]。因此, 以生长5a光果甘草的根际土壤作为试验材料, 其本质与连作5a甘草的根际土壤是一致的。

土壤微生物的多样性被认为是评价土壤生态功能的重要指标^[18—19]。在本研究中, 随着光果甘草种植年限的增加, 其根际土壤细菌多样性增加, 而真菌多样性降低, 这与Wang等^[20]关于西瓜(Citrullus lanatus)连作的研究结果相似。在连作系统中, 单一作物连年种植会造成农田中化感物质种类单一化, 这一方面影响了植株正常的生长发育, 另一方面破环了土壤微生态平衡, 造成群生物群落失调, 导致土壤中部分功能丧失, 影响土壤生态功能^[21]。

有关大豆(Glycine max)^[22]、茶(Camellia sinensis L.)^[23]、洋姜(Jerusalem artichoke)^[24]等作物连作障碍的研究表明, 连作障碍的主要原因为: 作物连作抑制了土壤中有益微生物的生长与繁殖, 促进了病原微生物的生长与繁殖。如茶连作增加了植物病原菌Fusarium oxysporum, F. solani, 和Microidium phyllanthi的相对多度, 大豆连作增加了植物病原菌F. oxysporum和Lectera longa的相对多度。实际上这种现象在光果甘草的连作过程中也同样存在。PCoA分析发现, 光果甘草连作改变了土壤微生物的群落结构组成。在门水平上, 光果甘草连作显著地增加了根际土壤中Blastocladiomycota及Mortierellomycota的相对多度。这与Chen等^[25]的研究结果具有一定的相似性, 该研究结果表明苍术(Atractylodes lancea)连作显著增加了Mortierellomycota的相对多度。在属水平上, 光果甘草连作显著地降低了根际土壤中有益菌Arthrobacter、Pseudomonas和Naganishia的相对多度, 增加了病原菌Fusarium和Thanatephorus的相对多度, 该现象在棉花^[26](Gossypium sp.)、烟草^[27](Nicotiana tabacum L.)、太子参^[28]等植物的连作中也曾被发现。

根腐病是造成甘草产量降低和品质下降的主要疾病, 其多发于生长3—5a甘草的根及根状茎上, 病情严重时, 农田中甘草的根腐发病率可高达80%以上, 其主要致病菌为Fusarium^{[13, 29]}。Fusarium除了是甘草根腐病的主要致病菌以外, 其还可以引起多种植物茎腐、茎基腐和花腐等, 是一类常见的植物病原菌^[30—31]。Arthrobacter和Pseudomonas是环境中常见的植物根际促生菌, 二者均可通过固氮、溶解磷酸盐、产生植物生长激素等方式促进植物生长^[32—33]。值得注意的是, Pseudomonas chlororaphis可抑制甘草根腐病的致病菌F. solani和F. oxysporum的生长与繁殖^[34]。Tapia-Vázquez等^[35]的研究发现, Naganishia sp.也可以抑制Fusarium的生长与繁殖。本研究中, 5a生光果甘草根际土壤中Fusarium的相对多度分别比Control和Gg1增加了76.68%和78.08%, 而Pseudomonas和Naganishia的相对多度分别比Gg1降低了31.31%和63.57%。因此, 我们推测Fusarium相对多度的增加可能与其潜在的拮抗菌株Pseudomonas和Naganishia相对多度的降低相关。Thanatephorus是水稻纹枯病的主要病原菌, 其相对多度在甘草连作期间也显著增加, 然而它是否会抑制光果甘草的生长还有待进一步的研究^[36]。综上所述, 推测土壤微生物群落丰富度的变化, 尤其是有益微生物相对多度的降低和病原微生物相对多度的增加, 可能是导致光果甘草连作障碍的重要原因。