新疆艾比湖湿地国家自然保护区位于东经82°33′-83°53′, 北纬44°37′-45°15′, 总面积达到2670.8 km², 是国内典型的温带干旱区湿地荒漠生态系统^[1], 作为北疆地区的天然生态屏障, 对于维护区域生态平衡、调节气候和保证物种的多样性等方面都起着极为重要的作用^[2]。近年来, 艾比湖湿地土壤逐年荒漠化、植被也不断退化, 加大对该地区的研究迫在眉睫。氮素作为组成地球生命的物质之一, 也是湿地恢复的限制养分之一。目前, 对于艾比湖湿地植物根际与非根际中氮素转化过程中的固氮菌^[3-5], 硝化作用中的氨氧化细菌和氨氧化古菌^[6-7]的群落结构及多样性已有部分研究, 但对于反硝化过程中的反硝化细菌的多样性情况随季节性变化状况尚未明确。

反硝化作用是氮循环过程中氮素去除的重要环节^[8], 而亚硝酸盐还原过程又是其中最关键的过程及限速步骤, 该过程主要由亚硝酸盐还原酶推动, 编码该酶的基因为nirK和nirS基因。目前, 关于反硝化细菌的研究主要涉及不同的环境, 例如海湾、河口沉积物、活性污泥、人工湿地^[9-12], 但不同类型的环境中的反硝化过程存在着明显的时空差异^[13-14]。nirS和nirK两种基因型的反硝化细菌的分布具有一定的环境特异性, 前者的氧化还原条件较低^[15]；目前已知其存在于超过70%的已知反硝化细菌中, 在环境中的分布更为广泛^[16]；nirK基因型反硝化细菌大多不明确分类归属^[17-18]。

nirS和nirK两种基因型反硝化细菌群落的多样性与植被类型、土壤状况等密切相关^[19]。高志强^[20]等在对于珠江口表层沉积物中发现, 盐度、氮素水平(总氮、铵态氮、硝态氮、亚硝态氮)是影响nirS-型反硝化细菌群落分布的重要因素。莫旭华等^[21]用RFLP技术对小麦土壤的研究结果表明, 无机氮肥含量与nirS-型反硝化细菌的群落结构显著相关。张文学等^[22]利用qPCR技术结合DGGE技术研究氮肥增效剂对水稻土壤的中的反硝化细菌丰度及群落结构的影响, 结果表明, 氮肥施加与否影响着反硝化细菌的丰度和群落结构。杨扬^[23]研究发现, 艾比湖湿地植物根际反硝化微生物群落结构与土壤电导率、有机质、铵态氮和硝态氮等相关。此外, 靳希桐等^[4]对于艾比湖湿地土壤的理化性质研究发现, 湿地中较为广泛存在的盐角草植物, 其生长的土壤类型为碱性沙壤土, 土壤中的有机质含量较高, 含水量较低。

集中开展湿地生态系统中盐角草植物覆盖区各土壤理化因子对反硝化微生物多样性及群落结构的响应, 对湿地生境特征及其演化的深入认识, 具有非常重要的作用。本研究采集艾比湖湿地夏、秋、春3个季节盐角草植物覆盖区的根际与非根际样本, 利用高通量测序技术, 分别以nirS和nirK基因作为分子标记比较研究盐角草根际与非根际样本中的反硝化细菌的多样性状况, 了解湿地中不同类型反硝化细菌的分布情况及季节性变化, 旨在为湿地的土壤肥力和土壤功能改善、生态植被恢复提供及生态系统保护提供参考。

1 材料与方法 1.1 土壤样品的采集

分别于2017年7, 10月和2018年4月在艾比湖湿地盐角草群落区(82°43′46.35″E, 44°51′3.59″N, 海拔193.2 m), 参照文献^[24]的方法, 采集根际和非根际土样。随机选择3个10 m×10 m大小的植物群落样区, 在每个样区中随机选择5个采样位点, 采集与植物根部表面紧密结合的土壤, 共15个土样, 将15个土样混合即为根际样本。采集植物非根际样本时, 在采集根际样本区域, 采集无植物生长5-20 cm土层的土壤即为非根际样本。将采集土样装入无菌袋于4℃手提式冰箱暂时保存运输回实验室, 保存于-80℃冰箱, 用于土壤总DNA的提取。2017年7, 10月和2018年4月采集的盐角草根际土样分别命名为S7、S10、S4；采集的非根际土样分别命名为SN7、SN10、SN4。

1.2 样品理化性质指标测定

土壤环境因子数据：土壤电导率(EC)、有机质(SM)、含水量(SOM)、速效氮(AN)、速效磷(AP)、速效钾(AK)、全氮(TN)、全磷(TP)、全钾(TK)、硝态氮(NO₃^--N)、铵态氮(NH₄⁺-N)参照土壤常规分析方法^[25]进行测定。

1.3 土壤总DNA的提取及反硝化细菌基因PCR扩增

土壤预处理：取适量保存于-80℃冰箱的湿润土壤置于无菌且预冷后的研钵中, 迅速研磨至土壤颗粒完全破碎后用于提取总DNA。用DNeasy PowerSoil Kits试剂盒(MoBio公司)提取各样本总DNA, 操作步骤参照试剂盒说明书。每个土壤样品各提取3个总DNA, 混匀后用于反硝化细菌基因序列的扩增。

选用引物nirS-cd3aF：5′-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3′和nirS-R3cd：5′- GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3′^[26], PCR扩增nirS基因序列, 扩增片段长度约为425 bp。选用引物nirK-F：5′-TCATGGTGCTGCCGCGY GANGG-3′和nirK-R：5′-GAACTTGCCGGTKGCCCAGAC-3′^[27], PCR扩增nirK基因序列, 扩增片段长度约为326 bp。nirS基因扩增条件为：95℃ 3 min；95℃ 30 s, 54℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35个循环；72℃ 10 min。nirK基因扩增条件为：95℃ 3 min；95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 32个循环；72℃ 10 min。PCR反应体系(50 μL)：2×PCR Mix 25 μL, 上游、下游引物各1 μL, DNA模板3 μL, ddH₂ O 20 μL。

分别用带有不同barcode的nirS基因引物和nirK基因引物对各根际和非根际土壤样品的总DNA进行PCR扩增, 用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测后, 将有清晰条带的PCR扩增产物送诺禾致源公司进行高通量测序, 测序平台为Illumina Hiseq PE250。

1.4 数据处理与分析

对高通量测序得到的原始数据进行拼接、过滤, 质控后得到Effective Tags, 利用Uparse软件对获得的Effective Tags进行聚类分析, 基于97%的一致性划分OTUs(operational taxonomic units, 可操作性分类单元), 然后对每个OTU中多次出现的序列进行过滤以获得代表序列, 利用Silva132数据库进行物种注释(阈值为0.8-1), 进而确定基因序列在各分类水平上的物种信息及群落结构组成情况。利用MUSCLE软件进行多序列比对, 并对各样本数据进行均一化处理, 用于计算反硝化细菌的多样性, 进而利用Mothur软件分析Shannon指数、Simpson指数Chao 1指数和ACE指数, 探究不同样本间群落结构的差异^[28]。利用Canoco4.5软件对反硝化细菌的多样性及主要类群与环境因子进行冗余分析(RDA), 得到显著影响反硝化细菌群落多样性及丰富度的环境因子。

2 结果与分析 2.1 盐角草根际与非根际样本土壤理化性质

盐角草根际与非根际样本土壤理化性质特征：土壤盐度呈现明显的季节性变化, 土壤碱解氮、钾元素的含量在不同季节存在显著性差异, 土壤硝态氮、速效磷的含量在根际样本和非根际样本间存在差异, 土壤整体有机质含量较高, 水分含量较低。

2.2 测序数据分析

高通量测序的所有样本中反硝化细菌nirS基因和nirK基因的有效序列数均超过50000条, 且所有样本的覆盖率(表 1)均高于99.0%, 表明这些样本的nirS基因和nirK基因的高通量测序数据能真实地反映样本的信息。

2.3 盐角草根际与非根际样本中的反硝化细菌基因多样性

利用每个样本的OTU数目、覆盖率、Shannon指数、Simpson指数和Chao 1指数和ACE指数评估反硝化细菌基因多样性及丰富度。

由表 1可知, 在艾比湖湿地各土样中, nirS-型反硝化细菌Shannon指数、Simpson指数均呈现出S10>SN7>S4>S7>SN4>SN10, nirK-型反硝化细菌Shannon指数、Simpson指数均呈现出S10>S7>S4>SN7>SN10>SN4；在艾比湖湿地3个季节盐角草中, nirS-型反硝化细菌ACE指数和Chao1指数呈现出S7>S10>SN7>SN10>S4>SN4, nirK -型反硝化细菌群落ACE指数和Chao1指数呈现出S7>S10>S4>SN7>SN4>SN10。

总体而言, 盐角草根际土样中的nirS-型和nirK-型反硝化细菌群落多样性均普遍高于非根际土样, nirS-型反硝化细菌群落多样性在季节上呈现秋季>春季>夏季, nirK-型反硝化细菌群落多样性在季节上呈现秋季>夏季>春季, 可知两种类型反硝化细菌群落多样性最高的均为秋季的根际土样。

2.4 盐角草根际与非根际样本中的反硝化细菌群落结构组成 2.4.1 门水平上的群落结构组成

艾比湖湿地盐角草各样品中的nirS和nirK基因序列分别与数据库Silva132比对, 进行物种注释后分别统计其在门水平下的物种相对丰度, 结果见图 1(Others为未能鉴定出来的序列)。由图 1可知, 在门分类水平上, 盐角草根际与非根际各样本中的nirS-型反硝化细菌主要隶属于变形菌门(Proteobacteria), 厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)。Proteobacteria在各样本中的相对丰度分别为6.063%、10.692%、27.995%、5.139%、10.539%、16.388%, 表明Proteobacteria为每个样本的绝对优势菌门, Firmicutes在各样本中的相对丰度分别为0.007%、0%、0.002%、0.007%、0.019%、0%, 其普遍存在于根际各样本中, Actinobacteria仅存在于夏季根际样本中, 相对丰度为0.002%, 占比较低。各样本中的nirK-型反硝化细菌仅隶属于Proteobacteria和Firmicutes。Proteobacteria在各样本中的相对丰度分别为0.295%、5.117%、0.523%、2.583%、0.400%、2.983%, 为每个样本的优势菌门, 但其在每个样本中的占比又存在着差异, Firmicutes仅存在于夏季盐角草根际样本中, 相对丰度为0.195%。

比较两种类型的反硝化细菌在门分类水平上的差异发现(表 2), 在盐角草根际与非根际两种类型的反硝化细菌所共有的门为Proteobacteria和Firmicutes, 但它们在各样本中的占比存在差异。相比于nirK-型反硝化细菌, nirS-型反硝化细菌中的这两个门的占比相对较多。

2.4.2 属水平上的群落结构组成

根据物种注释结果, 统计各样本在属水平上的分布情况, 每个样本在属水平上丰富度排名前10的物种的统计结果见图 2(Others为未能鉴定到种属的序列)。nirS-型反硝化细菌在属水平上排名前10的物种包括链球菌属(Streptococcus)、海杆菌属(Marinobacter)、磁螺菌属(Magnetospirillum)、副球菌属(Paracoccus)、含铜菌属(Cupriavidus)、固氮螺旋菌属(Azospirillum)、红长命菌属(Rubrivivax)、短枝单胞菌属(Brachymonas)、盐单胞菌属(Halomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)。其中, Pseudomonas和Halomonas是各土壤样本中nirS-型反硝化细菌所共有的绝对优势属, 其余8个属在各样本中的占比相对较低。在样本S7中nirS-型反硝化细菌的优势属为Pseudomonas(1.13%)、Halomonas(2.50%)、Rubrivivax(0.99%)和Paracoccus(0.64%), 展现出较为丰富且分布均衡的群落结构。在样本S10中nirS-型反硝化细菌的优势属为Pseudomonas(1.33%)和Halomonas(25.61%)。样本S4中所包含的属的种类同S10相似, 区别在于缺少了Rubrivivax以及优势菌属的相对丰度不同。在样本SN7中nirS-型反硝化细菌优势属为Pseudomonas(1.12%)、Halomonas(8.78%), 其他5个属的相对丰度均较低。在样本SN10中nirS-型反硝化细菌的优势属为Pseudomonas(3.54%)和Halomonas(1.15%), 其余各属的分布较少且均匀。样本SN4主要包括了Pseudomonas(1.13%)、Halomonas(2.50%)、Azospirillum(0.02%)、Paracoccus(0.08%)和Magnetospirillum(0.002%)。盐角草非根际土样中nirS-型反硝化细菌的多样性相对较低。

nirK-型反硝化细菌在属水平上排名前10的物种包括Chelativorans、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、巴西氏菌属(Bosea)、副球菌属(Paracoccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、卡斯特兰尼氏菌属(Castellaniella)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)、无色杆菌属(Achromobacter)。Castellaniella和Rhizobium是各土样中所共有的nirK-型反硝化细菌属。根际各样本中nirK-型反硝化细菌的各个属的分布较为均匀。Pseudomonas和Chelativorans在样本SN7中的相对丰度较高, 分别为1.20%和3.24%；Rhizobium在样本SN10中占比最高, 为0.16%；Castellaniella在样本SN4中占比最高, 为1.03%, 远高于在其他样本中的占比。

比较两种类型的反硝化细菌在属分类水平上的分布情况(表 3和表 4), 在所有土壤样本中共有的反硝化细菌的属为Pseudomonas和Paracoccus, 但二者在各样本中的相对丰度存在差异。nirK-型反硝化细菌中的Paracoccus仅存在于样本SN10中, 相对丰度仅为1.22%, 较低；nirS-型反硝化细菌中的Pseudomonas在各样本中的相对丰度明显高于nirK-型反硝化细菌。植物根际与非根际各样本中两种类型的反硝化细菌分别存在一定比例的独有属。nirS-型反硝化细菌中, 在各样本中较为广泛存在的独有属是Halomonas、Azospirillum和Magnetospirillum, 在nirK-型反硝化细菌中相对丰度较高的独有属是Rhizobium和Castellaniella。

2.5 盐角草根际与非根际样本中反硝化细菌的多样性及群落结构影响因子分析 2.5.1 nirS-型反硝化细菌的多样性影响因子分析

图 3为盐角草中nirS-型反硝化细菌多样性指数与环境因子之间的RDA分析(RD1和RD2轴的解释度分别为93.7%和6.2%), 样本S7、S10和S4分别位于3个不同的象限, 且根际各样本与非根际各样本分别位于不同的象限, 表明盐角草根际样本中的nirS-型反硝化细菌的多样性在三个季节上存在一定的差异, 且根际与非根际样本中的nirS-型反硝化细菌的多样性也存在较大差异；nirS-型反硝化细菌的多样性指数之一Shannon指数与SOM、AN呈明显的正相关, 与SM呈明显的负相关, 而丰富度指数与pH、EC、SOM、AP、TN呈正相关, 与SM、TP、TK、NH₄⁺-N呈负相关；图 3为盐角草各样本中的nirS-型反硝化细菌属水平的Top10的菌属与环境因子之间的RDA分析(RD1和RD2轴的解释度分别为90.9%和8.9%), 样本S7、样本S4和样本S10在图中的位置较为分散, 且根际各样本与非根际各样本也普遍分别位于不同的象限, 表明三个季节盐角草各样本中的nirS-型反硝化细菌群落结构发生改变, 且根际与非根际的群落结构也存在着差异；Paracoccus、Brachymonas、Rubrivivax和Marinobacter的相对丰度与EC、AP和TN呈正相关, 与TK、NH₄⁺-N和TP呈负相关；Cupriavidus的相对丰度与AN呈正相关, 而与其他理化因子之间的相关性较弱；Azospirillum和Halomonas的相对丰度与TK、AN和EC呈正相关；Magnetospirillum的相对丰度与SOM、AN呈正相关, 与TP、TK、NH₄⁺-N呈负相关；绝对优势属之一的Pseudomonas的相对丰度与TP、TK呈正相关, 与EC、TN呈负相关。结果表明, SOM、SM、TN、NH₄⁺-N是影响盐角草土壤nirS-型反硝化细菌多样性的主要环境因子。在属水平上, EC、TN、TK、TP和AN含量变化是造成nirS-型反硝化细菌群落结构差异的主要因素。

2.5.2 nirK-型反硝化细菌的多样性影响因子分析

图 4为盐角草土壤中nirK-型反硝化细菌多样性指数与环境因子之间的RDA分析(RD1和RD2轴的解释度分别为99.6%和0.3%), 样本S4位于第二象限, 样本S7和样本S10在图中的距离较为接近, 表明盐角草根际土壤中nirK-型反硝化细菌的多样性在夏季与秋季差异较小, 而在春季与夏季, 春季与秋季之间差异较大；根际各样本与非根际各样本分别位于不同的象限, 表明盐角草根际与非根际各样本中的nirS-型反硝化细菌的多样性存在较大差异；nirK-型反硝化细菌的多样性指数均与EC、SOM、AN、TN呈正相关关系, 与SM、TP、NH₄⁺-N呈负相关；图 4为盐角草各样本中nirK-型反硝化细菌属水平的Top10的菌属与环境因子之间的RDA分析(RD1和RD2轴的解释度分别为82.4%和11.7%), 样本S7、S10和S4在图中位置较为接近, 表明随着季节推移, 盐角草根际各样本中的nirK-型反硝化细菌群落结构变化不甚明显；而根际与非根际各样本分别普遍位于不同的象限, 表明两者之间的群落结构存在较大差异；Chelativorans和Pseudomonas的相对丰度与pH、AP呈正相关, 与TP、TK、NO₃^--N呈负相关；Paracoccus的相对丰度与SM、AP呈正相关, 与SOM、AK呈负相关；在属水平上, 相对丰度排名前三的nirK-型反硝化细菌主要受到SM、AK、pH、AP和NO₃^--N的影响。其余各属在图中均靠近原点, 相对丰度均较低, 并没有随季节变化发生明显的改变。结果表明, SM、SOM、AN、NH₄⁺-N是影响盐角草土壤nirK-型反硝化细菌多样性的主要环境因子, 而影响群落结构的主要因素有SM、AK、pH、AP和NO₃^--N。

3 讨论 3.1 盐角草根际与非根际样本中的反硝化细菌多样性及群落结构

多样性结果表明, 艾比湖湿地盐角草各样品都含有较高的nirS和nirK基因多样性, 且nirK基因多样性普遍高于nirS基因。秋季根际样本中的nirS和nirK基因多样性最高。盐角草根际各样本中的反硝化细菌多样性普遍高于非根际, 这主要是植物的根系环境造成的, 植物的根系能够产生有机酸、氨基酸、胞外酶等多种物质, 这些物质在植物根际形成了植物根际效应^[29]。

反硝化细菌群落结构分析表明, 各样本中的nirS-型反硝化细菌在门分类水平上主要包括了：Proteobacteria, Firmicutes和Actinobacteria, 这与杨扬^[23]的研究结果, 湿地植物根际中的nirS基因序列在门水平仅有Proteobacteria, 其余均为unidentified的研究结果存在一定的差异；本研究测得的各样本的Coverage均高于0.995, 这与她测得的0.61的覆盖度形成了鲜明的对比；本研究测得的多样性及丰富度指数也均高于其测定结果, 这些都展现了高通量测序技术研究反硝化过程的优势。各土壤样本中的nirK-型反硝化细菌在门分类水平上仅包括了Proteobacteria和Firmicutes, 且在各样本中存在的others的比例明显高于nirS-型反硝化细菌, 这表明盐角草各土壤样本中存在着较多的未知的nirK-型反硝化细菌类群。Proteobacteria作为各土壤样本中所共有的两种类型反硝化细菌优势门, 是盐角草各样本中起主导作用的反硝化细菌门类。这与杨文焕等^[30]对于包头市南海湖表层沉积物中的nirS-型反硝化细菌的群落特征的研究结果是相符的, 也与李博超^[31]对辽宁河口沉积物中的反硝化细菌多样性的研究结论是较为一致的, 这可能是由于Proteobacteria中包含了各种营养类型的细菌, 且其在艾比湖湿地土壤中的分布较为广泛^[32-34]。Gamma-Proteobacteria的Halomonas和Pseudomonas作为各土壤样本中所共有的、分布较为广泛的nirS-型反硝化细菌优势属, 是盐角草各样本中起主导作用的nirS-型反硝化细菌属, 这与鲍林林等^[35]在北运河沉积物中发现主要的反硝化细菌类群为Halomonas和Pseudomonas的结果是一致的, 表明了这两个属在沉积物与土壤样本之间的广泛存在。Pseudomonas是各土壤样本中共同存在的nirS-型和nirK-型反硝化细菌, 主要是因为Pseudomonas具有着丰富的代谢多样性, 能够适应不同的环境状况, 可以普遍存在于不同的环境中。前人的研究已经证实了这一点, 黄鑫等^[36]在对珠江水体研究中发现nirK-型和nosZ-型反硝化细菌的优势属均为Pseudomonas, 杨文焕等^[30]就在包头南海湖高原湖泊沉积物中发现nirS-型反硝化细菌的优势属主要为Pseudomonas。Halomonas的菌株属于中度嗜盐菌, 主要分布在高盐碱环境中^[37], 而盐角草植物附近盐渍化的土壤环境适合该类菌株的生长。Azospirillum是在各样本中少量存在的nirS-型反硝化细菌, 这可能与典型的反硝化菌属Azospirillum可以促进反硝化作用, 加快脱氮过程相关^[26]。Alpha-Proteobacteria的Rhizobium为各土壤样本中所共有的、分布较为广泛的nirK-型反硝化细菌优势属, 是盐角草各样本中起主导作用的nirK-型反硝化细菌属, 部分样本中少量存在的Bradyrhizobium和Sinorhizobium的菌株, 已有研究表明根瘤菌不仅可以与豆科植物共生固氮, 其中的许多菌株都具有反硝化能力^[38]。邹艳艳等^[39]就曾研究发现了一株隶属于Rhizobium的异养硝化-好氧反硝化细菌, 方芳等^[40]对活性污泥反应器中的反硝化细菌进行研究, 结果发现, 所有样本中的大部分nirK-型反硝化菌株均隶属于根瘤菌目。本研究发现Castellaniella也存在于各土壤样本中, 陈寒玉等^[41]从盐渍化土壤中分离获得一株高效好氧反硝化菌隶属于Castellaniella, 它可以高效地还原硝酸盐为一氧化氮、氮气、一氧化二氮。Chelativorans是存在于盐角草根际与非根际这一盐碱环境中的nirK-型反硝化细菌, 戴九兰^[42]等曾在黄河三角洲的盐碱农田土壤中发现了少量的Chelativorans的菌株。

3.2 盐角草根际与非根际样本中的反硝化细菌多样性及群落结构对环境因子响应分析

RDA分析结果表明, 在盐角草根际与非根际中, nirS-型反硝化细菌的多样性及群落结构呈现季节性差异, 夏秋两季中的nirK-型反硝化细菌的多样性差别较小, 且nirK-型反硝化细菌的群落结构在各个季节上存在较小的差异。而根际与非根际各样本中的nirS-型和nirK-型反硝化细菌的多样性及群落结构存在着一定的差异性。

反硝化微生物的群落多样性在不同理化性质的土壤之间存在差异差异, 主要的原因有植被类型、植物残体和植物根系分泌物等^[19]。前人研究发现盐度、氮素各水平(总氮、铵态氮、亚硝态氮)、有机质等均会影响反硝化细菌群落多样性及结构^{[20, 23]}。杨文焕等^[30]在对于包头市南海湖的表层沉积物中反硝化细菌多样性研究中发现, 反硝化菌的优势属Pseudomonas与硝态氮、亚硝态氮和总磷密切相关。本研究发现, EC、AP、TN、AN、SM、SOM和铵态氮等对于nirS-型反硝化细菌的多样性影响较大。影响nirK-型反硝化细菌多样性的主要因素包括SOM、TP、SM、TN、AN和铵态氮。温慧洋等^[43]研究了不同程度的盐碱土壤中的反硝化细菌功能基因丰度的关系, 结果发现在一定的盐分条件下, 盐度与反硝化细菌基因丰度存在正相关关系。EC与反硝化细菌之间的相关性, 主要是EC会影响硝酸盐还原过程中的酶活性, 进而影响后续的反硝化过程。而艾比湖湿地土壤中硝态氮的含量并非反硝化细菌多样性的主要影响因素, 这与前人的研究结果是一致的, 李刚^[44]等利用DGGE技术对沙地土壤中的nirK基因型的反硝化细菌进行研究, 结果表明nirK-型反硝化细菌的多样性与硝态氮之间无相关关系, Alexander Mergel^[45]等利用基因探针技术对酸性森林土壤中的反硝化细菌进行研究, 结果也表明了两者之间的相关性很低。对于盐角草各样本中反硝化细菌属水平的Top10的菌属与环境因子之间的冗余分析发现：AP、TP和硝态氮的含量等与共有属Pseudomonas的相对丰度密切相关, 表明Pseudomonas的群落结构与磷元素之间存在较强的响应关系^[46], 这和Wang Chun-Chin等^[47]的研究结果是一致的, 研究发现太湖流域沉积物中的优势菌属Pseudomonas的相对丰度与总磷含量相关, 而其他的优势菌属与环境因子的相关性较低。Azospirillum的相对丰度和氮素水平密切相关, 相对丰度和碱解氮含量均是植物根际样本中较高。土壤EC含量整体呈现根际高于非根际, 而Halomonas的相对丰度并没有呈现此趋势, 表明, Halomonas的相对丰度虽然受到EC的影响, 但并非仅由该因素决定。本研究中反硝化细菌中top10的菌属相对丰度高低并非单一土壤理化因子驱动, 两种类型的反硝化菌群落结构差异受到不同土壤理化因子影响。EC、TN、TK、TP和AN在属水平协同影响nirS-型反硝化细菌的生长；SM、AK、pH、AP和硝态氮共同影响着nirK-型反硝化细菌。艾比湖湿地盐角草根际与非根际中反硝化细菌的群落结构组成是由多种土壤理化因子共同起作用的, 这和WOLSING M ^[48]等的研究结果具有一定的相似性。

4 结论

在艾比湖湿地, 随着季节的变化, 盐角草根际与非根际中的nirS-型和nirK-型反硝化细菌多样性及群落结构发生着变化, 且两种基因型的反硝化细菌在多样性及群落结构方面存在着差异。盐角草根际各样本中的反硝化细菌基因多样性普遍高于非根际, 且根际与非根际中的反硝化细菌的群落结构并不相同。湿地土壤各理化因子对于两种基因型的反硝化细菌的多样性及群落结构的影响不尽相同。艾比湖湿地反硝化细菌呈现季节性变化, nirS-型和nirK-型反硝化细菌以不同的主要菌属, 共同推进湿地反硝化作用。对于湿地生态系统的保护, 需要进行长期而广泛的土壤状态评估和土壤反硝化微生物菌群的动态监测。