唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.)为蓼科大黄属(Rheum Linn.)多年生高大草本植物, 为中药材大黄的原植物之一, 青海省是其著名的道地产区。唐古特大黄的药用历史悠久, 具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒等功效^[1]。现代药理学研究表明, 与这三种主要功效相关的活性成分可分为四类, 即具有抑菌功效的游离蒽醌类成分, 具有泻下功效的结合蒽醌类成分和双蒽酮类成分, 具有抗凝血功效的多酚类成分(主要是没食子酸和儿茶素)^[2-6]。大黄为我国传统常用大宗中药材, 《中华人民共和国药典》(2015版)收载的含大黄成分的中成药多达105种, 全国中药制剂中含有大黄成分的比例高达10%^[7]。

药用资源化学成分的种类及含量的地域性差异是中药材道地性的一种具体体现。特定生态环境条件与遗传基因相辅相成, 充分体现了中药的特殊性、地道性和继承性。《本草经集注》“诸药所生, 皆有境界”, 《唐本草》“离其本土, 则质同而效异”, 这些记载都说明了生态环境对中药品质影响的重要性。有研究者认为“物种内质量变异有时大于种间差异”是现代道地论的核心思想^[8]。另有学者研究发现, 不同产地的唐古特大黄其功效组分含量有显著差异, 且化学成分与环境因子间存在强关联性^[9]。大黄是多道地产区药用植物的典型代表, 青海和甘肃是唐古特大黄和掌叶大黄(Rheum palmatum L.)的主产区。因此, 唐古特大黄品质地域性以及与产地气候间的响应关系是阐释唐古特大黄道地性的重要环节。

古人用产地作为道地药材品质的映射体现出整体性思想, 药材的道地性成因是中医药领域研究的热点。目前, 对中药道地性形成的环境因子和生物因子等虽有所研究, 但往往是针对个别因子的单因子影响研究, 缺乏对环境因子的综合性和系统性研究^[10-20]。目前, 对不同产区大黄的成分差异及炮制方法, 资源分布以及药理研究较多^[21-28], 但对影响唐古特大黄品质形成的气候因子和响应特征的研究还比较少^[29-30], 尤其是尚未见到有关唐古特大黄与多尺度气候因子的系统性研究。因此, 本文基于不同产地唐古特大黄的功效组分含量对多产地的唐古特大黄进行生态型划分, 并基于多尺度气候因子和多种数学统计方法, 系统研究气候因子与唐古特大黄品质的响应特征, 明确道地药材唐古特大黄的气候响应特征, 探索唐古特大黄品质地理变异的气候成因, 揭示大黄不同化学生态型形成的生态学机制, 为唐古特大黄高品质种植区选址及其资源可持续发展提供研究依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 唐古特大黄样本

文中关于唐古特大黄样本点信息和化学功效组分含量的数据引自李莉对不同道地产区大黄药材质量特征的研究结果^[31]。本文调查的唐古特大黄样本点共11批, 分别来自于大黄的主要产区四川、甘肃、宁夏、青海省。研究样本的采样信息见表 1, 样本点分布图见图 1。

1.1.2 气候数据

本文所采用的气候数据包含三个时间尺度(表 2), 首先是4个年均因子, 来源于中国气象数据网共享平台；其次是17个反映季节性变化的综合气候因子, 来源于世界气候数据库(http://www.worldclim.org/), 为1970—2000年监测数据的平均值, 空间分辨率为2.5 min；然后是4个月均因子, 反映温度、降水和日照等因子在月际间的动态变化。

1.2 方法 1.2.1 唐古特大黄品质测定

采用HPLC法测定唐古特大黄样品中游离蒽醌类(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)、总蒽醌(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)、结合蒽醌(总蒽醌含量-游离蒽醌含量)、多酚类(没食子酸、儿茶素)、双蒽酮苷类(番泻苷A、番泻苷B)等组分含量。Agilent1100高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器), 色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相为0.05%的磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱(0—10 min, 5%B—11%B；10—30 min, 11%B—15%B；30—45 min, 15%B—17%B；45—60 min, 17%B—22%B；60—75 min, 22%B—36%B；75—90 min, 36%B—60%B；90—105 min, 60%B；105—110 min, 60%—5%B)；流速1.0 mL/min1；检测波长250nm; 柱温40℃；进样量10μL。

1.2.2 数据分析

采用Excel和SPSS 25.0进行统计数据分析, 运用Matlab、Prism 8.0进行图表绘制。用Analyze-Descriptive Statistics法标准化处理不同量纲数据, 得到标准化结果后进行数据统计分析。聚类分析将数据线性标准化后采用系统聚类法, 分析方法采用组间联结和Pearson距离法。相关性分析采用SPSS中Pearson相关性分析。

2 结果与分析 2.1 唐古特大黄品质地理变异

不同产地间唐古特大黄4种功效组分间的含量具有明显的地理变异(表 3)。图 2显示青海和甘肃所产唐古特大黄聚成一类, 四川产唐古特大黄单独成一类。图 3显示不同地区唐古特大黄4种功效组分含量有显著性变化, 尤其是游离蒽醌类、结合蒽醌类和多酚类化学物质含量随地域变化很大。根据4种功效组分含量, 唐古特大黄可划分为青海-甘肃型和四川型两种化学生态型。其中青海-甘肃型中结合蒽醌和多酚类物质含量比较高, 而四川型中游离蒽醌含量比较高。青海-甘肃型中结合蒽醌类含量比例为66.9%, 而四川型中游离蒽醌类含量比例为70%。图 4显示不同地区大黄多酚类成分也具有明显地理变异, 其中青海-甘肃型样本中多酚类成分含量高于四川型样本, 而双蒽酮类成分没有明显的地域差异。

2.2 唐古特大黄品质对气候因子的响应

基于年-季-月不同时间尺度的气候因子, 逐次分析唐古特大黄品质与气候因子间的响应关系。

2.2.1 年均气候因子

图 5显示唐古特大黄4种成分与年均日照时数呈正相关。游离蒽醌类物质与4个年均气候因子相关性最弱, 其次是双蒽酮类物质, 而结合蒽醌类物质和多酚类物质与4个年均气候因子都有一定的相关性。

表 4可知结合蒽醌和多酚类物质与4种年均因子有较大相关性。其中, 结合蒽醌类物质与年均温呈显著负相关；多酚类物质与年均温和年降水呈负相关, 而与日照正相关。说明低温少雨且日照时间长的地区适宜结合蒽醌和多酚类物质的产生与积累。

2.2.2 季度气候因子

表 5说明四类组分中只有结合蒽醌和多酚类物质与气候因子间有一定相关性, 这与2.2.1中结论是一致的。

在0.01水平上, 与结合蒽醌类物质具有显著负相关的气候因子Bio 9(最干季平均温度)、Bio 11(最冷季平均温度), 说明低温有利于结合蒽醌类物质的累积；在0.05水平上, 与结合蒽醌类物质具有负相关性的气候因子有Bio 3(等温性)、Bio 5(最热月份最高温)、Bio 6(最冷月份最低温)、Bio 10(最热季平均温度), 说明温度变化剧烈的地区有助于结合蒽醌类物质的积累, 最热月份和最冷月份温度越低对结合蒽醌物质形成越有利；而与Bio 4(温度季节性变化系数)呈现显著正相关, 说明温度变化剧烈有利于结合蒽醌物质形成。

在0.01水平上, 多酚类物质与Bio 3(等温性)负相关, 与Bio 4(温度季节性变化系数)正相关, 说明一年中的温度变化剧烈有利于多酚类物质形成。在0.05水平上, 与多酚类物质具有显著负相关的气候因子为Bio 2(昼夜温差月均值)、Bio 9(最干季平均温度)、Bio 11(最冷季平均温度)、Bio 16(最湿季降雨量)、Bio 18(最暖季降雨量), 说明昼夜温差大和最冷季的低温有助于多酚类物质累积, 同时降水量越少越有助于多酚类物质形成。

总之, 温差大(昼夜温差, 季节温差), 温度低且降水量少的区域有助于唐古特大黄中结合蒽醌类和多酚类物质的形成和累积。

2.2.3 月均因子

通过2.2.1和2.2.2研究表明, 降水量、均温和日照均影响唐古特大黄的组分形成, 为深入研究气候因子对各成分的动态影响, 进一步分析在月均尺度上三个因子与唐古特大黄功效组分间的相关性, 结果见表 6、图 6、表 7。

表 6显示除了游离蒽醌与每月平均气温(7月和8月除外)呈现正相关外, 其他三种功效组分与每月平均气温都是负相关, 符合2.2.1部分结论。其中, 与结合蒽醌类物质呈强负相关的是1月至6月气温和9月至12月气温, 说明最干季节的低温对结合蒽醌累积有利。而月气温对多酚类物质的影响不显著, 只有1月至4月气温和12月气温低温对多酚类物质累积有促进作用。

图 6说明每月平均降水量只有对多酚类物质有一定的响应。多酚类物质与6—7月平均降水量、9—10月平均降水量呈负相关, 说明在最湿季降水量越少越有助于多酚类物质形成。

表 7说明, 每月平均日照量与结合蒽醌和多酚类物质都呈正相关。尤其是多酚类物质在唐古特大黄生长季节呈现出与日照的强正相关性, 说明在唐古特大黄的生长季, 日照量对多酚类物质累积有促进作用。

2.3 大黄不同品质区气候特征

上述研究结果说明, 只有月均温和月均日照量与结合蒽醌和多酚类物质呈强相关性。因此, 通过分析这两种因子在唐古特大黄不同品质区的气候差异, 以期获得唐古特大黄不同品质区的气候特征。

图 7显示两区域的月均温差呈现大-小-大的漏斗形, 即1到4月份温差较大, 而从5月到8月两区域间的温差变小, 从9月到12月温差又变大。说明影响结合蒽醌和多酚类物质累积的主要时间窗口(最冷季)内, 两区域间的月均温有较大差异。图 8显示青海-甘肃区域内的每个月的月均日照量都高于四川区域, 但在5—8月份期间, 两地区间差值较小。根据表 5和表 6的结论, 最冷季月均温与结合蒽醌物质和多酚类物质均呈负相关, 而每月日照量与多酚类物质呈正相关, 青海-甘肃地区由于最冷季(1至5月份, 9至12月份)每月平均气温远低于四川地区, 且每月日照量均高于四川地区, 所以青海-甘肃地区结合蒽醌物质和多酚类物质含量高于四川地区, 这恰恰阐释了青海-甘肃地区和四川地区的唐古特大黄品质存在差异的气候原因。

3 讨论

药用植物化学成分含量的地域性差异是中药材道地性的一种具体体现。“产之有地, 采之有时, 清洁加工, 依古炮制”, 说明一定的产地环境是保障道地药材好品质的重要环节^[32]。

3.1 唐古特大黄化学成分地理变异

除双蒽酮类成分外, 不同产地间唐古特大黄中功效组分含量具有明显的地理变异, 可划分为青海-甘肃型和四川型两种化学生态型。其中, 青海-甘肃型中结合蒽醌和多酚类物质含量比较高, 而四川型是游离蒽醌含量比较高。由于大黄泄下功效的主要物质基础是结合蒽醌类物质, 因此, 青海和甘肃地区唐古特大黄的泄下功效比较强^[33-34]。

3.2 唐古特大黄品质与气候因子的响应

本文首次采用不同时间尺度的气候因子, 研究影响唐古特大黄品质形成的关键气候因子和主要时间窗口。

(1) 在年均因子层次上, 结合蒽醌和多酚类2种组分与4种年均因子具有一定的相关性。低温少雨且日照时间长的地区适宜结合蒽醌和多酚类物质的积累。由于甘肃-青海和四川地区在温度、日照和降水方面的差异, 导致了不同地区唐古特大黄在结合蒽醌和多酚类物质含量存在明显差异。

(2) 在季均因子层次上, 温度变化剧烈且最冷季度时(最干季度)温度低的地区, 有利于结合蒽醌类物质的累积。同时, 温度变化幅度大(昼夜温差、季节性浮动), 最冷季温度低且降水量少的地区, 有助于多酚类物质形成。这与年均尺度因子结论一致。

(3) 在月均因子层次上, 只有结合蒽醌和多酚类物质与月均温度因子和日照因子间具有强相关性, 这一结论在三个时间尺度上具有一致性。结果表明, 最冷季度时温度越低越有利于结合蒽醌类物质和多酚类物质的累积。每月平均日照量与结合蒽醌和多酚类物质都呈正相关, 尤其是对多酚类物质影响最大。相关性研究数据表明, 多酚类物质在唐古特大黄生长季节呈现出与日照的强正相关性, 说明在唐古特大黄的生长季, 高日照量对多酚类物质累积有促进作用。

总而言之, 月均温和月均日照量是导致青海-甘肃和四川两个产区唐古特大黄品质差异的主要气候原因, 且两地区间气候差异的主要时间窗口为1—6月份和9—12月份。这与车国东等^[35]所研究栽培唐古特大黄蒽醌含量的季节动态变化结果相一致。本文基于多层次气候因子的相关性研究结果, 探讨了道地药材唐古特大品质地域差异的气候成因。

3.3 唐古特大黄品质形成因素探讨及研究展望

中药材品质的形成受环境、遗传等诸多因素的影响。有学者发现不同道地产区唐古特大黄药材质量产生差异的原因与其遗传背景差异有关系^[36-37]。此外, 有学者认为环境是影响唐古特大黄组分的主要因素, 其次才是种源^[38]。而环境主要是包括气候和土壤因素, 土壤对药用植物的生长发育、活性成分的合成积累有较大影响^[39]。有研究表明药用植物锁阳两个道地产区土壤微生物群落存在多样性差异^[40]；不同的土壤营养元素和无机元素差异导致大黄药材功效组分间的含量有显著差异, 这也进一步说明土壤因素也是形成药材道地性的主导因子^[41]。由此可知, 不同地区的气候和土壤条件差异是导致药材品质区域变异的主要生态因素。本文着重从多层次气候因子角度深入研究造成唐古特大黄品质差异的气候原因, 探索影响唐古特大黄品质形成的关键气候因子和主要时间窗口, 在后续的唐古特大黄品质研究中会继续考虑土壤条件对唐古特大黄品质的影响。同时, 进一步对唐古特大黄进行代谢组学研究和产区试种, 期望全面揭示唐古特大黄道地性的生态机制。