2020, Vol. 40文章信息
- 王磊, 王静, 张爱君, 张辉, 张永春
- WANG Lei, WANG Jing, ZHANG Aijun, ZHANG Hui, ZHANG Yongchun
- 小麦-甘薯轮作长期增施有机肥对碱性土壤固氮菌群落结构及多样性的影响
- Effects of long-term organic fertilization on soil diazotrophic community structure and diversity under wheat-sweet potato rotation system
- 生态学报. 2020, 40(16): 5771-5782
- Acta Ecologica Sinica. 2020, 40(16): 5771-5782
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201907231551
-
文章历史
- 收稿日期: 2019-07-23
- 修订日期: 2020-06-12
2. 南京农业大学, 南京 210095;
3. 江苏省徐淮地区徐州农科所, 徐州 221131
2. Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
3. Xuzhou Institute of Agricultural Sciences of the Xuhuai District of Jiangsu Province, Xuzhou 221131, China
氮是植物必需的大量元素, 也是获得农业高产最主要的限制因子之一。固氮微生物是生物圈中固定大气氮的重要微生物[1], 氮固定能力广泛分布于原核分类群中, 包括非常不同的, 远缘相关的细菌和古细菌[2-3]。生物固氮是陆地氮循环的重要组成部分, 每年为生物圈贡献90—130 Tg N[4], 且主要由细菌与豆科植物共同完成。然而, 近年来土壤自生固氮微生物由于其对氮素的重要作用而受到越来越多的关注[5]。在农业生态系统中, 管理经验对固氮微生物的结构和固氮能力均具有重要的影响[6-7]。施肥管理经验通过改变土壤特性直接影响土壤微生物群落和丰度或影响植物的反馈间接对土壤微生物群落和丰度产生影响[8-9]。近年来, 化肥特别是氮肥的过量施用导致一系列的生态和环境问题, 例如土壤酸化, 氮淋失和潜在的大气污染等[10-11]。施用有机肥料可以增加土壤有机质和养分含量, 并改善土壤pH和土壤养分[12-14]。研究发现长期的施肥模式通过改变土壤pH、养分有效性和碳含量, 对土壤微生物种群产生积极或消极的影响[8, 15-16]。有研究发现固氮微生物群落中的一些类群对外界的扰动也异常敏感[17]。因此, 探究固氮微生物群落对无机或有机施肥的响应, 对于了解土壤氮素的供应过程和选择有效的施肥策略至关重要。
许多研究表明土壤中充足的氮通常会抑制微生物的生物固氮, 从而对固氮微生物群落结构产生重要影响[18-19]。当向土壤中施用氮肥后, 充足的可利用氮(如铵态氮和硝态氮)能够充分满足固氮微生物对氮素的需求, 从而影响固氮微生物的活性并抑制其基因的表达[20-21]。例如, 有研究发现氮肥的施用降低了菊芋根际土壤中固氮菌的数量, 改变了固氮微生物的群落结构[22]。Wang等[23]研究表明长期施用化肥能改变固氮菌群落结构及降低其群落多样性。然而, Mårtensson等[24]研究发现施用氮磷钾肥对稻田固氮微生物的影响较小。Piceno和Lovell[25]研究也发现在短期的施肥试验中氮肥施用与固氮菌的群落结构之间没有明显的相关性。出乎意料的是Juraeva等[26]研究发现黄瓜根中固氮酶基因的丰度与氮肥供应呈正相关关系。此外, 在有机肥处理的土壤中高水平的碳和其它养分可能为固氮微生物提供更理想的条件。有研究表明单独施用有机肥或与化肥配合施用都能明显恢复固氮菌群落的多样性[27]。另一方面, 施用有机肥也会增加土壤有效氮的含量, 这可能也会抑制固氮微生物的群落多样性和丰度。有研究发现在酸性和中性土壤中长期施用有机肥能显著抑制固氮微生物的群落多样性[28-29]。然而, 在碱性土壤中研究施用有机肥对固氮菌群落影响的报道还相对较少。因此, 研究碱性土壤中增施有机肥对固氮菌群落结构、组成和多样性的影响显得尤为重要。
中国是世界上最大的甘薯生产国, 其种植面积和总产量均居世界第一[30], 甘薯-小麦轮作是其主要轮作模式, 其广泛分布在长江中下游地区和北方薯区[31]。甘薯-小麦轮作与其它轮作方式存在显著不同, 在甘薯生产中, 适当的氮肥投入是甘薯增产的有力措施之一[32], 过高的氮肥施用量使甘薯藤蔓生长过旺, 降低光合同化产物向薯块的运输, 进而降低甘薯的收获指数[33-34]。此外, 考虑到矿质氮肥在农业生产中的过量施用已经引起严重的环境问题[35-37]。通过合适的措施增强自生固氮菌的生物固氮是在低氮肥投入条件下满足植物营养需求的另一种方法[5]。因此, 研究小麦-甘薯轮作体系中不同施肥方式尤其是增施有机肥对土壤固氮菌群落的影响及其环境驱动因子尤为重要。本文以种植小麦-甘薯长期定位试验中不同施肥处理的甘薯季碱性土壤样本为研究对象, 采用Illumina MiSeq高通量测序技术, 探讨其轮作模式下不同施肥处理对土壤固氮菌群落结构及多样性的影响及其环境驱动因子, 结果对于我们更加充分认识长期施肥尤其是增施有机肥条件下固氮菌的群落及合理施用有机肥提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 长期试验点概况及试验设计本研究所选取的长期施肥定位试验点位于徐州农业科学研究所内(117°09′ E, 34°17′ N), 海拔42 m, 属温带季风气候, 年均气温14 ℃, 年降雨量800—930 mm, 无霜期约210 d, 年日照时数2284—2495 h, 日照率52%—57%。气候特点是：四季分明, 光照充足, 雨量适中, 雨热同期。土壤类型为黄潮土, 质地沙壤。试验从1980年开始, 试验前耕层(0—20 cm)土壤有机质含量10.8 g/kg, 全氮0.66 g/kg, 速效磷12.0 mg/kg, pH 8.01。1981—2002年为“小麦-玉米轮作”, 2002年后改为“小麦-甘薯轮作”。试验设9个处理：(1)不施肥对照(CK)；(2)氮肥(N)；(3)施氮磷肥(NP)；(4)施氮钾肥(NK)；(5)单施化肥(NPK)；(6)单施有机肥(M)；(7)氮肥+有机肥(NM)；(8)氮磷肥+有机肥(NPM)；(9)化肥+有机肥(NPKM)。本研究选取其中3个施肥处理：CK：不施肥对照；NPK：单施化肥；NPKM：化肥+有机肥。试验采用随机区组设计, 4次重复, 小区面积33.6 m2(7 m×4.8 m), 选取其中的3个重复用于本次研究。氮磷钾肥每年施用量为纯N 300 kg/hm2, P2O5 150 kg/hm2, K2O 225 kg/hm2。有机肥为堆积制腐的厩肥。1981—1985年每年施用量(鲜基)为75000 kg/hm2, 1985年后为37500 kg/hm2, 有机肥平均含N 6.3 g/kg、P2O5 5.14 g/kg、K2O 7.93 g/kg, C:N为20.3。小麦、玉米季氮肥的基、追肥比例为各50%, 甘薯季氮、磷、钾及有机肥在翻地前均作基肥一次施用。
1.2 土壤样品采集土壤样品于2018年10月(甘薯收获后)采集。其中每个小区间隔为40 cm, 每个区组间隔为70 cm, 将每个小区中距水泥埂1 m左右的区域定为采样区域, 避免边缘效应。去除表面土壤后, 各小区按“S”形采样路线随机选取5个取样点, 用采样器(直径为2.5 cm)采集0—20 cm的耕作层土壤。各小区采集的5个土芯经初步破碎混匀后, 所有样品采用冰袋保鲜运回实验室。土壤样品在去除植物根系和大的石块后过2 mm筛混匀。所有样品分为两部分, 一部分室温下风干后用于土壤理化性质测定, 另一部分置于-80 ℃用于土壤DNA提取。
1.3 土壤理化性质测定土壤pH利用混合电极pH计测定(PE-10, Sartorious, Germany)(水土比为5:1)；土壤有机碳(Soil organic carbon, SOC)采用油浴加热-重铬酸钾容量法测定；土壤铵态氮和硝态氮(Ammonium nitrogen, NH4+-N；Nitrate nitrogen, NO3--N)测定采用0.01 M的CaCl2浸提(1:10, w/v)土壤振荡1 h后过滤, 利用化学分析仪(SMARTCHEM 200, France)测定滤液中NH4+-N和NO3--N含量；土壤速效磷(Available phosphorus, AP)含量采用钼锑抗比色法测定。土壤速效钾(Available potassium, AK)利用NH4OAc浸提火焰光度法测定。土壤总氮(Total nitrogen, TN)采用半微量凯氏法测定。SOC、TN、NH4+-N、NO3--N、AK和AP均参考《土壤农化分析》中的方法[38]。
1.4 土壤DNA提取及固氮菌nifH基因高通量测序称取0.50 g新鲜的土壤样品, 用强力土壤DNA提取试剂盒(QIAGEN laboratories, Carlsbad, CA, Germany)参照其操作说明提取土壤样品中的总DNA, 提取获得的DNA于超低温(-80 ℃)冰箱中保存。固氮菌nifH基因的高通量测序采用引物PolF(5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3′)和PolR (5′-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3′)[28]。每个样品前段引物均含有不同的8 bp Barcode用于区分不同样品。PCR的扩增条件为95 ℃ 2 min, 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 25个循环, 最后72 ℃延伸5 min。PCR反应体系为20 μL, 其中包括4 μL(5×FastPfu)缓冲液, 2 μL (2.5 mM)dNTP, 0.8 μL正反引物, 0.4 μL(5×FastPfu)DNA聚合酶, 1 μL DNA模板, ddH2O补充到20 μL。扩增后的产物利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, U.S.)进行纯化。将不同样品的PCR扩增产物等摩尔混合后, 采用Illumina MiSeq测序平台完成序列分析(委托南京集思慧远生物科技有限公司测定)。
1.5 高通量数据分析利用QIIME软件对下机后的原始序列根据相应的barcode信息进行各样品序列分配并去除接头和引物序列[39]。利用FLASH软件拼接正反向序列, 对拼接后的序列进行质控, 去除低质量序列。具体步骤如下：1)去除q值小于0.5或长度不足250 bp的序列；2)去除单序列；3)序列97%相似度水平上生成一个OTU；4)去除嵌合体；5)挑选每个OTU代表序列；6)nifH序列与proGenomes数据库(http://progenomes.embl.de/)比对进行注释。将生成的OTU表格转换成适合Mothur软件分析用的文件, 然后利用Mothur软件进行各处理Alpha多样性分析[40]。基于Unweight_unifrac距离的主坐标分析(PCoA)在QIIME软件上进行。用冗余分析(Redundancy analysis, RDA)探索固氮菌群落结构、样方和理化性质之间的关系；Mantel test用于检测微生物群落组成与土壤理化之间的相关性；相似性分析(ANOSIM, Analysis of Similarities)用于检验各处理群落的相似性。前向选择(forward selection)用于选取最优解释变量。RDA、Mantel test、ANOSIM和前向选择均在R 3.3.1统计软件的Vegan[41]包里进行。
1.6 统计分析用SPSS 20.0进行统计分析, 单因素方差分析(One-way ANOVA)配合Tukey′s-b检验多处理间均值的显著性。
2 结果与分析 2.1 土壤理化性质长期不同施肥处理对土壤理化性质的影响如表 1所示。与CK处理相比, NPK和NPKM处理显著降低土壤pH(P < 0.05), 显著增加土壤有机碳和全氮含量(P < 0.05), 其中pH分别降低0.30和0.54个单位, 有机碳分别增加33.24%和104.26%, 全氮分别增加61.54%和105.13%。铵态氮和硝态氮含量在3个处理中差异显著(P < 0.05), 其中铵态氮含量在3个处理的高低顺序为NPKM > CK > NPK, 硝态氮按照NPKM > NPK > CK的顺序排列。土壤有效磷和速效钾在3个处理中差异显著(P < 0.05), 其含量在3个处理中的高低顺序为NPKM > NPK > CK。以上结果可以发现, 在碱性土壤上增施有机肥通过降低土壤pH有效改善土壤酸碱度, 通过增加土壤有机碳、全氮和速效养分的含量显著改善土壤肥力水平。
| 处理 Treatment |
pH | 土壤有机碳 SOC/(g/kg) |
全氮 TN/(g/kg) |
铵态氮 NH4+-N/(mg/kg) |
硝态氮 NO3--N/(mg/kg) |
有效磷 AP/(mg/kg) |
速效钾 AK/(mg/kg) |
| CK | 8.70±0.03a | 7.04±0.14c | 0.78±0.09c | 0.83±0.12b | 3.80±0.49c | 4.00±0.29c | 53.00±3.61c |
| NPK | 8.40±0.01b | 9.38±0.11b | 1.26±0.16b | 0.14±0.06c | 5.35±0.19b | 8.85±1.14b | 75.00±1.00b |
| NPKM | 8.16±0.01c | 14.38±0.15a | 1.60±0.02a | 1.29±0.24a | 7.59±0.69a | 119.77±6.27a | 98.00±2.00a |
| 不同的字母表示在P < 0.05(Tukey′s-b test)水平上差异显著；CK:不施肥对照, without fertilizers control; NPK:单施化肥, chemical fertilizer alone; NPKM:化肥+有机肥, chemical fertilizer plus organic fertilizer; SOC: soil organic carbon; TN: total nitrogen; AP: available phosphorus; AK: available potassium | |||||||
如表 2所示, 不同施肥处理间土壤固氮菌群落Alpha多样性存在不同程度的差异。与CK处理相比, NPK和NPKM处理降低土壤固氮菌群落Chao1丰富度指数、观测的物种数和Shannon多样性指数, 其中NPKM处理的Chao1丰富度指数、观测的物种数显著低于CK和NPK处理(P < 0.05), Shannon多样性指数在NPKM处理中最低, 但差异不显著(P > 0.05)。因此, 长期施肥降低土壤固氮菌群落多样性和丰富度, 增施有机肥降低的程度更大。
| 处理 Treatment |
Chao1丰富度指数 Chao1 richness index |
观测的物种 数Observed_species |
Shannon多样性指数 Shannon diversity index |
| CK | 1013±52a | 986±40a | 7.88±0.25a |
| NPK | 932±52a | 891±66a | 6.96±1.07a |
| NPKM | 751±46b | 700±33b | 6.70±0.37a |
| 不同的字母表示在P < 0.05(Tukey′s-b test)水平上差异显著；CK：不施肥对照；NPK：单施化肥；NPKM：化肥+有机肥 | |||
如图 1所示, 不同施肥处理间土壤固氮菌群落Beta多样性差异显著。在OTU水平上, 基于Unweight_unifrac距离进行主坐标分析, 结果发现主坐标的前两轴共解释群落变异的58.60%, 第一轴和第二轴分别解释群落变异的43.88%和14.72%。CK、NPK和NPKM处理的群落组成沿着第一轴依次分开, 相似性分析(ANOSIM)也表明CK、NPK和NPKM处理的群落组成差异显著(R = 0.4825, P = 0.005)。冗余分析主要是分析土壤理化、群落组成与样方之间的关系, 结果表明土壤理化因子显著影响固氮菌群落的组成(Mantel test, R = 0.4825, P = 0.01)。通过解释变量的前向选择(forward selection)发现土壤速效钾和有机碳分别能解释群落变异的75.01%和24.99%。因此, 长期增施有机肥显著增加土壤速效钾和有机碳, 这种变化驱动着土壤固氮菌群落结构的转变。
|
| 图 1 长期不同施肥处理中土壤固氮菌群落组成及其与土壤理化性质的关系 Fig. 1 Soil diazotrophic community composition and its relationship with soil physicochemical properties in long-term different fertilization treatment ANOSIM：相似性分析；Mantel test：检验群落组成与理化因子的相关性；CK：不施肥对照；NPK：单施化肥；NPKM：化肥+有机肥RDA:冗余分析; SOC:有机碳Soil organic carbon; AK:速效钾Available potassium |
固氮菌测序得到的原始序列经过质控获得1104419条高质量的序列, 每个样品的序列从112486到131951条不等, 平均每个样品有122713条序列, 99%的序列被划分为细菌界, 共获得1337个OTU, 归属为9个门, 12个纲, 27个目, 32个科, 36个属, 61个种。固氮菌门水平相对丰度如图 2所示, 具体9个主要门：变形菌门(47.66%—90.61%), 硝化螺旋菌门(2.65%—49.52%), 蓝藻菌门(0.18%—7.60%), 放线菌门(0.27%—2.24%), 浮霉菌门(0—1.68%), 酸杆菌门(0.04%—0.80%), 厚壁菌门(0.04%—0.64%), 芽单胞菌门(0—0.56%), 拟杆菌门(0—0.38%)。在门水平上, 长期不同施肥处理对其相对丰度产生显著影响。与CK和NPK处理相比, NPKM处理显著增加酸杆菌门和硝化螺旋菌门的相对丰度(P < 0.05), 但也显著降低了变形菌门的相对丰度(P < 0.05)。与CK处理比较, 两个肥料处理NPK和NPKM处理均显著降低蓝藻菌门的相对丰度(P < 0.05), 其中在NPKM处理中其相对丰度最低。
|
| 图 2 长期不同施肥处理中土壤固氮菌群落门水平的相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of soil diazotrophic phyla level within long-term different fertilization treatment 不同的字母表示在P < 0.05(Tukey′s-b test)水平上差异显著；CK：不施肥对照；NPK：单施化肥；NPKM：化肥+有机肥 |
如图 3所示, 在固氮菌纲水平上, Beta-变形菌和Gamma-变形菌是最丰富的类群。在不同施肥处理中纲水平上的相对丰度差异明显。Alpha-变形菌、Beta-变形菌和Delta-变形菌在NPKM处理的土壤中其相对丰度最低, 其中Beta-变形菌的相对丰度显著低于CK和NPK处理(P < 0.05)。Gamma-变形菌在3个处理中差异不显著, 其相对丰度的高低顺序为CK > NPKM > NPK。
|
| 图 3 长期不同施肥处理中土壤固氮菌群落纲水平的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of soil diazotrophic class level within long-term different fertilization treatment 不同的字母表示在P < 0.05(Tukey′s-b test)水平上差异显著；CK：不施肥对照；NPK：单施化肥；NPKM：化肥+有机肥 |
如图 4所示, 对固氮菌群落属水平上进行分析, 结果发现CK处理的土壤中拟色球蓝细菌属相对丰度高于NPK和NPKM处理, 但差异不显著(P > 0.05)。与CK和NPK处理相比, NPKM处理显著增加硝化螺菌属的相对丰度(P < 0.05), 但显著降低固氮弧菌属的相对丰度(P < 0.05)。
|
| 图 4 长期不同施肥处理中土壤固氮菌群落属水平的相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of soil diazotrophic genus level within long-term different fertilization treatment 不同的字母表示在P < 0.05(Tukey′s-b test)水平上差异显著；CK：不施肥对照；NPK：单施化肥；NPKM：化肥+有机肥 |
土壤理化因子与固氮菌群落多样的相关分析如表 3所示。土壤硝态氮与Shannon多样性指数显著负相关(P < 0.05)；丰富度指数Chao1和观测到的物种数与土壤pH达到极显著的正相关(P < 0.01), 而与土壤有机碳、全氮、硝态氮、有效磷和速效钾之间均达到极显著的负相关(P < 0.01)。以上结果可以发现, 长期施肥尤其是增施有机肥能显著提升土壤肥力水平, 这从某种程度上降低了固氮菌的群落多样性。
| pH | 土壤有机碳 SOC |
全氮 TN |
硝态氮 NO3--N |
有效磷 AP |
速效钾 AK |
|
| Chao1指数 | 0.890** | -0.927** | -0.875** | -0.907** | -0.901** | -0.917** |
| Observed_species | 0.912** | -0.940** | -0.879** | -0.930** | -0.909** | -0.931** |
| Shannon指数 | NS | NS | NS | -0.675* | NS | NS |
| *和**表示在P < 0.05和P < 0.01的水平上显著相关；NS：无显著相关性 | ||||||
如表 4所示, 相关分析表明土壤pH、有机碳、全氮、铵态氮、硝态氮、有效磷和速效钾与放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门和Gamma-变形菌间均无显著相关性(P > 0.05)；土壤pH与酸杆菌门、硝化螺旋菌门和硝化螺菌属显著负相关(P < 0.05), 与蓝藻菌门、变形菌门、Beta-变形菌、拟色球蓝细菌属和固氮弧菌属间均呈显著(P < 0.05)正相关；而土壤有机碳和全氮与酸杆菌门、硝化螺旋菌门和硝化螺菌属间显著正相关(P < 0.05), 与蓝藻菌门、变形菌门、Beta-变形菌、拟色球蓝细菌属和固氮弧菌属显著负相关(P < 0.05)；铵态氮与酸杆菌门显著正相关(P < 0.05), 与Alpha-变形菌显著负相关(P < 0.05)；硝态氮与酸杆菌门、硝化螺旋菌门和硝化螺菌属显著正相关(P < 0.05), 与蓝藻菌门、变形菌门、Beat-变形菌、拟色球蓝细菌属和固氮弧菌属显著负相关(P < 0.05)；有效磷和速效钾均与酸杆菌门、硝化螺旋菌门和硝化螺菌属显著正相关(P < 0.05), 均与变形菌门、Beta-变形菌和固氮弧菌属显著负相关(P < 0.05), 其中有效磷与Delta-变形菌显著负相关(P < 0.05), 速效钾与蓝藻菌门和拟色球蓝细菌属显著负相关(P < 0.05)。综上, 施肥导致土壤pH的变化对固氮菌群落类群产生潜在积极的影响, 而土壤有机碳及有效养分改变对其产生潜在消极的影响。
| pH | 土壤有机碳 SOC |
全氮 TN |
铵态氮 NH4+-N |
硝态氮 NO3--N |
有效磷 AP |
速效钾 AK |
|
| Acidobacteria | -0.842** | 0.938** | 0.777* | 0.699* | 0.919** | 0.970** | 0.872** |
| Actinobacteria | NS | NS | NS | NS | NS | NS | NS |
| Bacteroidetes | NS | NS | NS | NS | NS | NS | NS |
| Cyanobacteria | 0.874** | -0.785* | -0.783* | NS | -0.844** | NS | -0.844** |
| Firmicutes | NS | NS | NS | NS | NS | NS | NS |
| Gemmatimonadetes | NS | NS | NS | NS | NS | NS | NS |
| Nitrospirae | -0.886** | 0.961** | 0.892** | NS | 0.858** | 0.957** | 0.905** |
| Planctomycetes | NS | NS | NS | NS | NS | NS | NS |
| Proteobacteria | 0.844** | -0.938** | -0.863** | NS | -0.821** | -0.950** | -0.875** |
| Alphaproteobacteria | NS | NS | NS | -0.854** | NS | NS | NS |
| Betaproteobacteria | 0.823** | -0.883** | -0.790* | NS | -0.818** | -0.861** | -0.884** |
| Deltaproteobacteria | NS | NS | NS | NS | NS | -0.675* | NS |
| Gammaproteobacteria | NS | NS | NS | NS | NS | NS | NS |
| Chroococcidiopsis | 0.743* | NS | NS | NS | -0.692* | NS | -0.729* |
| Nitrospira | -0.748* | 0.870** | 0.735* | NS | 0.840** | 0.935** | 0.771* |
| Azoarcus | 0.817** | -0.901** | -0.782* | NS | -0.828** | -0.903** | -0.874** |
| *和**表示在P < 0.05和P < 0.01的水平上显著相关；NS：无显著相关性; Acidobacteria:酸杆菌门Actinobacteria:放线菌门Bacteroidetes:拟杆菌门Cyanobacteria:蓝藻菌门Firmicutes:厚壁菌门Gemmatimonadetes:芽单胞菌门Nitrospirae:硝化螺旋菌门Planctomycetes:浮霉菌门Proteobacteria:变形菌门Alphaproteobacteria: Alpha-变形菌Betaproteobacteria: Beta-变形菌Deltaproteobacteria: Delta-变形菌; Gammaproteobacteria: Gamma-变形菌Chroococcidiopsis:拟色球蓝细菌属Nitrospira:消化螺旋菌属Azoarcus:固氮弧菌属 | |||||||
土壤固氮微生物群落多样性对不同土壤施肥方式异常敏感。本研究中, 长期增施有机肥显著降低土壤固氮菌群落多样性、改变固氮菌群落结构。有研究发现在中性黑土上, 长期施用化肥或有机肥均降低土壤固氮菌群落的多样性[42], 在氮素缺乏的土壤中固氮微生物更具竞争优势, 土壤氮素含量的变化会影响固氮微生物与其它土壤微生物的竞争关系, 从而影响固氮微生物的群落组成[43]。本文中我们发现长期增施有机肥显著改变土壤pH、有机碳、全氮及有效养分的含量, 这些土壤特性是驱动固氮菌群落丰富度变化的主要因子[44-45], 这可能解释了在增施有机肥处理的土壤中固氮菌群落多样性和结构与对照和单施化肥处理相比差异更大。此外与对照和单施化肥处理相比, 增施有机肥显著降低土壤pH、增加土壤有机碳、全氮、硝态氮、有效磷和速效钾(表 1), 这些改变分别对土壤固氮菌群落多样性产生潜在积极和消极的影响(表 3)。土壤养分含量的增加导致固氮菌群落多样性降低, 可能是养分含量上升增加了固氮微生物与其它土壤微生物的竞争关系, 从而影响固氮微生物的群落丰富度和多样性。然而在有些研究中报到了不同的结果, 如wang等[45]研究指出有机管理的水稻田中固氮细菌多样性相对较高。Feng等[46]研究发现单施化肥显著降低土壤固氮菌多样性, 而添加畜禽粪便能保持其多样性。Lin等[28]研究表明长期施肥显著降低土壤固氮菌丰度和群落多样性, 而添加猪粪增加了其抑制作用。在Orr等[47]对传统和有机管理的农业土壤进行比较时, 发现土壤肥力管理对固氮菌群落和多样性影响不大。产生以上不同的结果可能是施肥改变了其它的土壤特性, 例如土壤pH[48, 23]和有机质含量[49], 这些变化可能对固氮微生物产生二次的影响。
由于土壤类型和土壤利用方式的差异, 土壤固氮菌群落结构受到不同环境因子的调控。有学者指出在土壤pH < 5时, 土壤pH对固氮菌群落有着重要的影响[50]。Lin等[28]研究也发现土壤pH是驱动固氮菌群落变化的关键因子。Hu等[29]结果表明土壤有效磷是影响固氮菌群落改变最重要的因子。在Yang等[42]研究中发现土壤硝态氮和有效磷驱动固氮菌群落结构的改变。冗余分析中解释变量的前向选择结果表明土壤有机碳和速效钾的变化能最大程度上解释土壤固氮菌群落的改变(图 1)。而本研究中不同施肥处理间土壤pH值均大于8, 且pH值变化范围较小(8.16—8.70), 因此pH的变化可能对固氮菌群落结构的影响没有有机碳和速效钾强烈。此外随着长期化肥或有机肥的添加, 土壤有机碳、全氮及速效养分改变较大(表 1), 可能这些土壤特性的变化驱动着固氮菌群落结构的变化。综上所述, 在小麦-甘薯轮作中土壤有机碳和速效钾与固氮菌群落的变化密切相关。
3.2 长期不同施肥对固氮菌群落类群的影响本研究发现变形菌门和硝化螺旋菌门为优势的自生固氮菌群(图 2)。在变形菌门内, Beta-变形菌和Gamma-变形菌为优势的菌群(图 3), 这和贾雨雷等[51]研究结果一致。更为重要的是长期不同施肥对固氮菌群落类群在土壤中的分布产生显著的影响。如长期增施有机肥显著降低变形菌门、蓝藻菌门、Beta-变形菌和固氮弧菌属的相对丰度, 增加硝化螺旋菌门、酸杆菌门和固氮弧菌属的相对丰度(图 4)。已有研究发现变形菌门属于革兰氏阴性菌, 是一类生长在富营养环境中的类群, 其相对丰度与养分含量呈正相关性[52-53]。蓝藻细菌由于其固氮能力, 在维持水稻土肥力水平起着至关重要的作用[54-55]。然而, 在本文中我们发现变形菌门、蓝藻菌门、Alpha-变形菌、Beta-变形菌、Delta-变形菌、Gamma-变形菌和固氮弧菌属均与土壤有机碳和有效养分显著负相关, 结果的不同可能是因为长期施肥导致土壤养分显著提高, 土壤养分的提升为其它土壤微生物提供充足的养分供应, 加速了与固氮微生物间的竞争。此外, 长期施用化肥或有机肥也显著提高土壤可利用氮的水平, 而高氮含量的土壤中并不适合自生固氮菌的生长和繁殖[47, 57], 这可能也是固氮微生物群落某些类群受到一定抑制的原因。在本研究中土壤pH虽然变化很小, 对土壤固氮微生物群落结构的影响较小, 但也可能对某些固氮微生物类群在土壤中的分布产生重要的影响。酸杆菌门是土壤中新发现的一类嗜酸菌, 有研究发现土壤酸杆菌门与pH呈负相关性[57]。本研究也发现增施有机肥显著降低土壤pH, 而酸杆菌门在增施有机肥的处理中最高, 相关分析也表明酸杆菌门与土壤pH显著负相关。因此, 在增施有机肥的土壤中pH显著降低, 同时显著富集了固氮菌酸杆菌门。在属水平上, 在高养分含量的土壤中, 硝化螺旋菌属相对丰度较高, 固氮弧菌属相对丰度受到明显的抑制。有研究表明, 硝化螺菌属中的微生物可以独立完成氨氧化成硝酸盐的氮代谢过程, 并将这类微生物定义为全程氨氧化微生物[58-59]。因此, 在我们研究中长期增施有机肥可能显著影响全程氨氧化微生物的群落, 从而使硝化螺旋菌属的相对丰度显著提高。固氮弧菌属是一类革兰氏阴性细菌, 隶属于Beta-变形菌纲、红环菌目的红环菌科, 目前发现的有7个代表种, 具有生物固氮的功能, 一般情况下每消耗1 g碳水化合物, 至少10 g大气氮被非共生固定。固氮弧菌属广泛存在于自然界, 是一类兼性厌氧菌[60], 在生物固氮过程中有着重要作用的微生物[61]。从生态的角度出发, 固氮弧菌属可分为土壤固有的细菌和植物根系的内生菌[63]。本研究结果发现长期增施有机肥显著降低固氮弧菌属的相对丰度(图 4), 相关分析也表明固氮弧菌属的相对丰度与有机碳、全氮、硝态氮、有效磷和速效钾的含量显著负相关(表 4)。因此, 长期施用有机肥增加了土壤有机碳、全氮和有效养分进而对固氮弧菌属产生潜在消极的影响。综上所述, 长期增施有机肥显著改变土壤pH、有机碳和土壤有效养分的含量, 这些土壤性质的变化显著影响土壤固氮微生物的群落结构, 在某种程度上对固氮微生物群落多样性和一些类群产生一定的抑制作用。
4 结论本研究揭示了在碱性土壤上, 与不施肥比较长期增施有机肥对固氮菌群落结构的影响强于单施化肥, 对固氮菌群落多样性的抑制作用更大。长期增施有机肥增加了土壤有机质、丰富了土壤养分, 这些改变增加了酸杆菌门、硝化螺旋菌门和硝化螺旋菌属的相对丰度, 但也降低了变形菌门、蓝藻菌门、Beta-变形菌和固氮弧菌属的相对丰度。长期增施有机肥显著改变土壤固氮菌群落结构和多样性, 这与土壤有机碳和速效钾的变化密切相关。因此, 长期增施有机肥对土壤固氮菌群落结构的影响更大, 且不利于其群落多样性的维持。
| [1] |
Gaby J C, Buckley D H. A comprehensive evaluation of PCR primers to amplify the nifH gene of nitrogenase. PLoS One, 2012, 7(7): e42149. DOI:10.1371/journal.pone.0042149 |
| [2] |
Zehr J P, Turner P J. Nitrogen fixation:nitrogenase genes and gene expression. Methods in Microbiology, 2001, 30: 271-286. DOI:10.1016/S0580-9517(01)30049-1 |
| [3] |
Zehr J P, Jenkins B D, Short S M, Steward G F. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure:a cross-system comparison. Environmental Microbiology, 2003, 5(7): 539-554. DOI:10.1046/j.1462-2920.2003.00451.x |
| [4] |
Galloway J N, Schlesinger W H, Levy II H, Michaels A, Schnoor J L. Nitrogen fixation:anthropogenic enhancement-environmental response. Global Biogeochemical Cycles, 1995, 9(2): 235-252. DOI:10.1029/95GB00158 |
| [5] |
Cleveland C C, Townsend A R, Schimel D S, Fisher H, Howarth R W, Hedin L O, Perakis S S, Latty E F, Von Fischer J C, Elseroad A, Wasson M F. Global patterns of terrestrial biological nitrogen (N2) fixation in natural ecosystems. Global Biogeochemical Cycles, 1999, 13(2): 623-645. DOI:10.1029/1999GB900014 |
| [6] |
DeLuca T H, Drinkwater L E, Wiefling B A, DeNicola D M. Free-living nitrogen-fixing bacteria in temperate cropping systems:influence of nitrogen source. Biology and Fertility of Soils, 1996, 23(2): 140-144. DOI:10.1007/BF00336054 |
| [7] |
Reed S C, Seastedt T R, Mann C M, Suding K N, Townsend A R, Cherwin K L. Phosphorus fertilization stimulates nitrogen fixation and increases inorganic nitrogen concentrations in a restored prairie. Applied Soil Ecology, 2007, 36(2/3): 238-242. |
| [8] |
Geisseler D, Scow K M. Long-term effects of mineral fertilizers on soil microorganisms-a review. Soil Biology and Biochemistry, 2014, 75: 54-63. DOI:10.1016/j.soilbio.2014.03.023 |
| [9] |
Zeng J, Liu X J, Song L, Lin X G, Zhang H Y, Shen C C, Chu H Y. Nitrogen fertilization directly affects soil bacterial diversity and indirectly affects bacterial community composition. Soil Biology and Biochemistry, 2016, 92: 41-49. DOI:10.1016/j.soilbio.2015.09.018 |
| [10] |
Lassaletta L, Billen G, Grizzetti B, Anglade J, Garnier J. 50 year trends in nitrogen use efficiency of world cropping systems:the relationship between yield and nitrogen input to cropland. Environmental Research Letters, 2014, 9(10): 105011. DOI:10.1088/1748-9326/9/10/105011 |
| [11] |
Sun R B, Zhang X X, Guo X S, Wang D Z, Chu H Y. Bacterial diversity in soils subjected to long-term chemical fertilization can be more stably maintained with the addition of livestock manure than wheat straw. Soil Biology and Biochemistry, 2015, 88: 9-18. DOI:10.1016/j.soilbio.2015.05.007 |
| [12] |
Zhong W H, Gu T, Wang W, Zhang B, Lin X G, Huang Q R, Shen W S. The effects of mineral fertilizer and organic manure on soil microbial community and diversity. Plant and Soil, 2010, 326(1/2): 511-523. |
| [13] |
Liang Q, Chen H Q, Gong Y S, Fan M S, Yang H F, Lal R, Kuzyakov Y. Effects of 15 years of manure and inorganic fertilizers on soil organic carbon fractions in a wheat-maize system in the North China Plain. Nutrient Cycling in Agroecosystems, 2012, 92(1): 21-33. DOI:10.1007/s10705-011-9469-6 |
| [14] |
García-Orenes F, Roldán A, Morugán-Coronado A, Linares C, Cerdà A, Caravaca F. Organic fertilization in traditional Mediterranean grapevine orchards mediates changes in soil microbial community structure and enhances soil fertility. Land Degradation & Development, 2016, 27(6): 1622-1628. |
| [15] |
Levy-Booth D J, Prescott C E, Grayston S J. Microbial functional genes involved in nitrogen fixation, nitrification and denitrification in forest ecosystems. Soil Biology and Biochemistry, 2014, 75: 11-25. DOI:10.1016/j.soilbio.2014.03.021 |
| [16] |
Li C H, Yan K, Tang L S, Jia Z J, Li Y. Change in deep soil microbial communities due to long-term fertilization. Soil Biology and Biochemistry, 2014, 75: 264-272. DOI:10.1016/j.soilbio.2014.04.023 |
| [17] |
Pereira e Silva M C, Semenov A V, van Elsas J D, Salles J F. Seasonal variations in the diversity and abundance of diazotrophic communities across soils. FEMS Microbiology Ecology, 2011, 77(1): 57-68. DOI:10.1111/j.1574-6941.2011.01081.x |
| [18] |
Tan Z Y, Hurek T, Reinhold-Hurek B. Effect of N-fertilization, plant genotype and environmental conditions on nifH gene pools in roots of rice. Environmental Microbiology, 2003, 5(10): 1009-1015. DOI:10.1046/j.1462-2920.2003.00491.x |
| [19] |
Barron A R, Wurzburger N, Bellenger J P, Wright S J, Kraepiel A M L, Hedin L O. Molybdenum limitation of asymbiotic nitrogen fixation in tropical forest soils. Nature Geoscience, 2008, 2(1): 42-45. |
| [20] |
Halbleib C M, Ludden P W. Regulation of biological nitrogen fixation. The Journal of Nutrition, 2000, 130(5): 1081-1084. DOI:10.1093/jn/130.5.1081 |
| [21] |
Mirza B S, Potisap C, Nüsslein K, Bohannan B J M, Rodrigues J L M. Response of free-living nitrogen-fixing microorganisms to land use change in the Amazon rainforest. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(1): 281-288. |
| [22] |
Meng X F, Wang L, Long X H, Liu Z P, Zhang Z H, Zed R. Influence of nitrogen fertilization on diazotrophic communities in the rhizosphere of the Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.). Research in Microbiology, 2012, 163(5): 349-356. DOI:10.1016/j.resmic.2012.03.005 |
| [23] |
Wang C, Zheng M M, Song W F, Wen S L, Wang B R, Zhu C Q, Shen R F. Impact of 25 years of inorganic fertilization on diazotrophic abundance and community structure in an acidic soil in southern China. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 113: 240-249. DOI:10.1016/j.soilbio.2017.06.019 |
| [24] |
Mårtensson L, Díez B, Wartiainen I, Zheng W W, El-Shehawy R, Rasmussen U. Diazotrophic diversity, nifH gene expression and nitrogenase activity in a rice paddy field in Fujian, China. Plant and Soil, 2009, 325(1/2): 207-218. |
| [25] |
Piceno Y M, Lovell C R. Stability in natural bacterial communities:I. Nutrient addition effects on rhizosphere diazotroph assemblage composition. Microbial Ecology, 2000, 39(1): 32-40. DOI:10.1007/s002489900192 |
| [26] |
Juraeva D, George E, Davranov K, Ruppel S. Detection and quantification of the nifH gene in shoot and root of cucumber plants. Canadian Journal of Microbiology, 2006, 52(8): 731-739. DOI:10.1139/w06-025 |
| [27] |
Tang H, Yu M, Wang Y Y, Han X W, Wang X G, Jin W, Chi F Q, Wei D. Effects of long-term fertilization on nifH gene diversity in agricultural black soil. African Journal of Microbiology Research, 2012, 6(11): 2659-2666. |
| [28] |
Lin Y X, Ye G P, Liu D Y, Ledgard S, Luo J F, Fan J B, Yuan J J, Chen Z M, Ding W X. Long-term application of lime or pig manure rather than plant residues suppressed diazotroph abundance and diversity and altered community structure in an acidic Ultisol. Soil Biology and Biochemistry, 2018, 123: 218-228. DOI:10.1016/j.soilbio.2018.05.018 |
| [29] |
Hu X J, Liu J J, Zhu P, Wei D, Jin J, Liu X B, Wang G H. Long-term manure addition reduces diversity and changes community structure of diazotrophs in a neutral black soil of northeast China. Journal of Soils and Sediments, 2018, 18(5): 2053-2062. DOI:10.1007/s11368-018-1975-6 |
| [30] |
马代夫, 李强, 曹清河, 钮福祥, 谢逸萍, 唐君, 李洪民. 中国甘薯产业及产业技术的发展与展望. 江苏农业学报, 2012, 28(5): 969-973. |
| [31] |
江苏省农业科学院, 山东省农业科学院. 中国甘薯栽培学. 上海: 上海科学技术出版社, 1984: 1-10.
|
| [32] |
Tsuno Y, Fujise K. Studies on the dry matter production of sweet potato:Ⅲ. The relation between the dry matter production and the absorption of mineral nutrients. Japanese Journal of Crop Science, 1964, 32(4): 297-300. DOI:10.1626/jcs.32.297 |
| [33] |
Hartemink A E, Johnston M, O'Sullivan J N, Poloma S. Nitrogen use efficiency of taro and sweet potato in the humid lowlands of Papua New Guinea. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2000, 79(2/3): 271-280. |
| [34] |
Ankumah R O, Khan V, Mwamba K, Kpomblekou-A K. The influence of source and timing of nitrogen fertilizers on yield and nitrogen use efficiency of four sweet potato cultivars. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2003, 100(2/3): 201-207. |
| [35] |
Le C, Zha Y, Li Y, Sun D, Lu H, Yin B. Eutrophication of lake waters in China:cost, causes, and control. Environmental Management, 2010, 45(4): 662-668. DOI:10.1007/s00267-010-9440-3 |
| [36] |
Liu X J, Zhang Y, Han W X, Tang A H, Shen J L, Cui Z L, Vitousek P, Erisman J W, Goulding K, Christie P, Fangmeier A, Zhang F S. Enhanced nitrogen deposition over China. Nature, 2013, 494(7438): 459-462. DOI:10.1038/nature11917 |
| [37] |
Gao B, Huang T, Ju X T, Gu B J, Huang W, Xu L L, Rees R M, Powlson D S, Smith P, Cui S H. Chinese cropping systems are a net source of greenhouse gases despite soil carbon sequestration. Global Change Biology, 2018, 24(12): 5590-5606. DOI:10.1111/gcb.14425 |
| [38] |
鲍士旦. 土壤农化分析(第三版). 北京: 中国农业出版社, 2000.
|
| [39] |
Caporaso J G, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman F D, Costello E K, Fierer N, Peña A G, Goodrich J K, Gordon J I, Huttley G A, Kelley S T, Knights D, Koenig J E, Ley R E, Lozupone C A, McDonald D, Muegge B D, Pirrung M, Reeder J, Sevinsky J R, Turnbaugh P J, Walters W A, Widmann J, Yatsunenko T, Zaneveld J, Knight R. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods, 2010, 7(5): 335-336. DOI:10.1038/nmeth.f.303 |
| [40] |
Schloss P D, Westcott S L, Ryabin T, Hall J R, Hartmann M, Hollister E B, Lesniewski R A, Oakley B B, Parks D H, Robinson C J, Sahl J W, Stres B, Thallinger G G, Van Horn D J, Weber C F. Introducing mothur:open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(23): 7537-7541. DOI:10.1128/AEM.01541-09 |
| [41] |
Oksanen J, Blanchet F G, Kindt R, Legendre P, Minchin P R, O'Hara R B, Simpson G L, Henry M H, Stevens P S, Wagner H. Vegan: community ecology package r package version 2.0-10. http://vegan.r-forge.r-project.org/.
|
| [42] |
Yang L, Bai J S, Zeng N H, Zhou X, Liao Y L, Lu Y H, Rees R M, Nie J, Cao W D. Diazotroph abundance and community structure are reshaped by straw return and mineral fertilizer in rice-rice-green manure rotation. Applied Soil Ecology, 2019, 136: 11-20. DOI:10.1016/j.apsoil.2018.12.015 |
| [43] |
郑棉海, 陈浩, 朱晓敏, 毛庆功, 莫江明. 矿质养分输入对森林生物固氮的影响. 生态学报, 2015, 35(24): 7941-7954. |
| [44] |
Pereira e Silva M C, Schloter-Hai B, Schloter M, van Elsas J D, Salles J F. Temporal dynamics of abundance and composition of nitrogen-fixing communities across agricultural soils. PLoS One, 2013, 8(9): e74500. DOI:10.1371/journal.pone.0074500 |
| [45] |
Wang S, Pablo G P, Ye J, Huang D F. Abundance and diversity of nitrogen-fixing bacteria in rhizosphere and bulk paddy soil under different duration of organic management. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(2): 493-503. DOI:10.1007/s11274-011-0840-1 |
| [46] |
Feng M M, Adams J M, Fan K K, Shi Y, Sun R B, Wang D Z, Guo X H, Chu H Y. Long-term fertilization influences community assembly processes of soil diazotrophs. Soil Biology and Biochemistry, 2018, 126: 151-158. DOI:10.1016/j.soilbio.2018.08.021 |
| [47] |
Orr C H, Leifert C, Cummings S P, Cooper J M. Impacts of organic and conventional crop management on diversity and activity of free-living nitrogen fixing bacteria and total bacteria are subsidiary to temporal effects. PLoS One, 2012, 7(12): e52891. DOI:10.1371/journal.pone.0052891 |
| [48] |
Limmer C, Drake H L. Non-symbiotic N2-fixation in acidic and pH-neutral forest soils:aerobic and anaerobic differentials. Soil Biology and Biochemistry, 1996, 28(2): 177-183. DOI:10.1016/0038-0717(95)00118-2 |
| [49] |
Tang Y F, Zhang M M, Chen A L, Zhang W Z, Wei W X, Sheng R. Impact of fertilization regimes on diazotroph community compositions and N2-fixation activity in paddy soil. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2017, 247: 1-8. |
| [50] |
Hsu S F, Buckley D H. Evidence for the functional significance of diazotroph community structure in soil. The ISME Journal, 2009, 3(1): 124-136. DOI:10.1038/ismej.2008.82 |
| [51] |
贾雨雷, 林标声, 廖真, 汪丽芳, 黄在兴, 宋昭昭, 梅兰, 林占熺. 典型生境巨菌草根内生固氮菌的群落多样性. 微生物学报, 2020, 60(1): 148-160. |
| [52] |
王慧颖, 徐明岗, 周宝库, 马想, 段英华. 黑土细菌及真菌群落对长期施肥响应的差异及其驱动因素. 中国农业科学, 2018, 51(5): 914-925. |
| [53] |
Fierer N, Bradford M A, Jackson R B. Toward an ecological classification of soil bacteria. Ecology, 2007, 88(6): 1354-1364. DOI:10.1890/05-1839 |
| [54] |
De P K. The role of blue-green algae in nitrogen fixation in rice-fields. Proceedings of the Royal Society B:Biological Sciences, 1939, 127(846): 121-139. |
| [55] |
Roger P A, Ladha J K. Biological N2 fixation in wetland rice fields:estimation and contribution to nitrogen balance. Plant and Soil, 1992, 141(1/2): 41-55. |
| [56] |
侯海军, 秦红灵, 陈春兰, 魏文学. 土壤氮循环微生物过程的分子生态学研究进展. 农业现代化研究, 2014, 35(5): 588-594. |
| [57] |
Jones R T, Robeson M S, Lauber C L, Hamady M, Knight R, Fierer N. A comprehensive survey of soil Acidobacterial diversity using pyrosequencing and clone library analyses. The ISME Journal, 2009, 3(4): 442-453. DOI:10.1038/ismej.2008.127 |
| [58] |
Kits K D, Sedlacek C J, Lebedeva E V, Han P, Bulaev A, Pjevac P, Daebeler A, Romano S, Albertsen M, Stein L Y, Daims H, Wagner M. Kinetic analysis of a complete nitrifier reveals an oligotrophic lifestyle. Nature, 2017, 549(7671): 269-272. DOI:10.1038/nature23679 |
| [59] |
van Kessel M A H J, Speth D R, Albertsen M, Nielsen P H, Op den Camp H J M, Kartal B, Jetten M S M, Lücker S. Complete nitrification by a single microorganism. Nature, 2015, 528(7583): 555-559. DOI:10.1038/nature16459 |
| [60] |
Garrity G M, Bell J A, Lilburn T G. Taxonomic Outline of the Prokaryotes. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. New York: Springer-Verlag, 2004: 76-77.
|
| [61] |
王小菊, 何春平, 王震, 邢传宏, 宋安东, 陈红歌. 高效硝化细菌的筛选及特性研究. 中国环境科学, 2013, 33(2): 286-292. DOI:10.3969/j.issn.1000-6923.2013.02.014 |
| [62] |
Lee D J, Wong B T, Adav S S. Azoarcus taiwanensis sp. nov., a denitrifying species isolated from a hot spring. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(3): 1301-1307. DOI:10.1007/s00253-013-4976-9 |