鸟纲啄木鸟目(Piciformes)啄木鸟科(Picidae)现生共33个属254种^[1], 因其通常啄木取食而通称啄木鸟。除取食外, 啄木鸟通常在乔木树干上凿洞栖息, 抚育幼鸟, 这些树洞最终被其他的小型鸟兽占用, 因此, 啄木鸟对森林生态系统生物多样性的维持具有重要意义^[2-4]。另外, 由于其取食行为的特殊性, 啄木鸟对于生境变化非常敏感, 使其成为森林生态系统健康的重要指示物种^[5], 具有重要的保护与监测意义。

啄木鸟广泛分布于除南极洲, 澳大利亚, 新几内亚以及马达加斯加以外的各个大陆^[6]。几乎有森林覆盖的区域就有啄木鸟存在, 甚至有少数物种如Melanerpes uropygialis和Melanerpes hypopolius, 利用仙人掌在荒漠地区定居^[7], 最终形成分布热点位于赤道附近的东南亚地区和南美的分布模式(图 1)。对于这种分布模式的成因, 目前还不清楚, 但分布模式在一定程度上反映的是进化历史, 而分类系统是对进化历史的一种科学认知方式。遗憾的是啄木鸟的分类系统争议不断, 如Nesoctites早期被认为属姬啄木亚科, 现在被划分到啄木鸟亚科, 且Hemicircus属和Nesoctites属彼此的关系以及与啄木鸟亚科其他物种的关系目前还不清楚。此外, 早期分类学研究认为形态性状的相似性反映了进化关系的远近, 研究方法也多采用形态学、解剖学、行为学、发声方式等方法^[8-10]。但研究发现, 在啄木鸟群体中存在趋同进化、平行进化和拟态等由环境因素引起的外形相似现象^[11], 这导致啄木鸟形态上的相似性不能代表其进化关系, 使形态分类的可靠性大打折扣。事实上属于不同支系而具有相似外形的状况在啄木鸟中时常发现, 例如Dinopium属和Chrysocolaptes属。Dinopium属和Chrysocolaptes属啄木鸟羽毛图案非常相似, 但研究发现造成这种相似性的原因是趋同进化, 而非共同的血统^[6]。近年来, 分子方法被大量用于啄木鸟分类研究, 从而解决了许多问题。但针对部分啄木鸟, 不同研究得到的结果各不相同, 甚至互有矛盾, 至今啄木鸟的分类还存在争议。模糊不清的分类系统意味着对进化历史的不同理解, 由此推测出各不相同的啄木鸟拓殖历史。啄木鸟的迁移拓殖历史是其地理分布格局的形成过程, 因此对啄木鸟分布格局的解释也是各不相同。啄木鸟在旧大陆分布117种, 新大陆分布138种, 并且在新旧大陆上成对地分布着啄木鸟的一些姐妹群体(sister taxon), 即在同一进化树中亲缘关系最近的两个特定类群^[12]。特别是Picumnus属、Dryobates属和Picoides属, 在同一属内既包含新大陆物种, 又存在旧大陆物种, 且Picumnus属新旧大陆物种分离时间比后两属分离要早很多。这些特殊的群体能为研究啄木鸟的迁移拓殖历史提供证据, 通过其拓殖历史可以推测啄木鸟分布格局的成因。

啄木鸟群体庞大, 对整个群体进行研究相对困难, 但经过多年的遗传数据累积, 在GenBank数据库内现已有大量的啄木鸟基因数据, 因此大数据或许会成为解决啄木鸟分类问题的重要助力。基于此, 我们希望通过从GenBank数据库获取啄木鸟科各物种基因序列数据进行其科内物种进化关系研究。由于一些啄木鸟数量稀少而导致数据缺失如Hylatomus galeatus和Picoides ramsayi在IUCN的濒危等级均为易危, 全球数量较少, 在数据库内缺乏数据。此外, 在挑选时因数据质量而舍弃一些数据, 如Campephilus principalis最长ND2序列片段为158bp因太短而剔除。最终, 本研究共获取179种啄木鸟可用ND2基因序列数据, 覆盖近70%啄木鸟科物种, 以此对啄木鸟科的系统发生关系进行研究。

1 材料与方法 1.1 数据获取

由于啄木鸟的分类系统此前曾有多次修改, 在数据库中命名也存在差异, 本次研究采取鸟盟(BirdLife International)使用的分类系统进行检索^[1]。在搜索序列数据时, 需要逐条核对序列是否为目标物种的基因序列, 若存在分类信息不明确或是来源不明确的情况则弃之^[13]。在数据库内许多物种的同一基因存在多条序列数据, 但针对啄木鸟科, 由于进行种间分子进化树的构建, 种内序列差异较小, 因此每个物种选取一个样本进行分析。而在进行新旧大陆同属姐妹群体的分子进化树重建时, 则选取尽量多的数据排除个体差异。基因序列选取的原则包括：1.人工选择基因序列完整度高的序列；2.软件对比, 选择同源性更好的序列以保证其可比性。

由于GenBank库中尚未包含所有啄木鸟的DNA序列, 部分数据也存在诸如序列片段太短、无法确定来源等问题, 本研究最终从数据库获得啄木鸟科179个物种线粒体ND2基因序列共183条。其中包括179个物种各1条, 为了探讨新旧大陆同属姐妹群体系统发生关系, 针对Picumnus属内唯一的旧大陆种P. innominatus又额外多获取4条该物种的ND2基因序列用于本属内分子进化研究, 详细信息见表S1。

对另外两个包含新旧大陆姐妹群的属, 即Dryobates属和Picoides属, 由于选择尽量多的数据以排除个体的差异干扰, 但数据库内, 此两属ND2基因序列数据有限, 因此选择使用数量相对更多的cytb基因序列。对Dryobates属中D. scalaris、D. nutttallii、D. pubescens、D. cathpharius以及D. minor 5个物种共获取12条cytb基因序列。Picoides属的P. canicapillus、P. moluccensis、P. maculatus、P. kizuki、P. arcticus以及P. tridactylus 6个物种共获取9条cytb基因序列。详细信息见表S2。

响蜜鴷科(Indicatoridae)与啄木鸟科成姐妹群, 因此从GenBank库中获取黑喉响蜜鴷(Indicator indicator)和小响蜜鴷(Indicator minor)ND2基因序列各1条^[14], 用于构建啄木鸟科进化树时的外群序列。获取红胸蚁鴷(Jynx ruficollis)cytb基因序列1条用作构建Dryobates和Picoides两属进化树时的外群序列。

目标序列使用Bioedit7.2.5软件默认参数进行对齐, 以备后续分析。

1.2 分子进化树重建

使用jmodeltest2.1.10软件对序列进行最佳碱基替换模型选择, 通过赤池信息准则(Akaike Information Criterion, AIC)选取最佳模型为GTR+I+G(AIC= 176657.1846)。使用MEGA7.0^[15]软件分别用NJ(neighbour joining)法、MP (maximum parsimony)法以及ML(maximum likelihood)法对啄木鸟科179个物种进行进化树重建。进化树节点稳健性通过自举检验(bootstrap)评估^[16]。针对NJ法和MP法采用1000次自举检验, ML法采用100次自举检验^[17]。用NJ法进行对Picumnus属21个物种、Dryobates属5个物种和Picoides属6个物种分别进行进化树构建时, 同样采用1000次自举检验。

2 结果 2.1 啄木鸟科179种啄木鸟的系统发生关系

对啄木鸟科179个物种用ND2基因序列构建的NJ树、ML树和MP树都将三个亚科识别出来, 各亚科内包含的属也相同, 但在亚科内各分支之间的亲缘关系上三种树的结果存在差异。

三种树都显示蚁亚科Jynx属是最先分化出的一个支系, 并且与剩下的所有啄木鸟构成姐妹群, Jynx属内两种啄木鸟互为姐妹种(图 2)。

对于姬啄木鸟亚科, 三种算法得出的结果有所不同, MP树显示Verreauxia和Sasia构成一支, 并且与Picumnus属以及啄木鸟亚科为同时分离。ML树显示Picumnus属与啄木鸟亚科构成姐妹群, 又一起与Verreauxia和Sasia的支系构成姐妹群。在Picumnus属内, 唯一的旧大陆种P. innominatus最先分离出来, 与属内其他啄木鸟形成姐妹群, 此后又分离出P. nebulosus, Picumnus属剩下的啄木鸟构成一个单系群(monophyly group), 内部分成两个支系彼此构成姐妹群(图 2)。

关于啄木鸟亚科, 除NJ树显示其为并系群(paraphyletic group)外, ML树与MP树都显示啄木鸟亚科是单系群。啄木鸟亚科内首先分离出来的是Melanerpini族, 与其他啄木鸟形成姐妹群, 紧接着, Hemicircus属和Nesoctites属构成一支, 分离出来；Campephilini族分离出来, 余下的啄木鸟组成Picini族。值得指出的是在我们的结果中Hemicircus属和Nesoctites属形成姐妹群结构, Geocolaptes olivaceus则插入了Campethera属的支系中形成巢式的结构(图 2)。

2.2 Picumnus属、Dryobates属和Picoides属系统发生关系

Picumnus属内21个物种的NJ树结果显示, P. innominatus的五个样本与本属其他种构成姐妹群, 其中DQ479155与DQ188173组成一支, 与其他三个样本构成姐妹群。该属内新大陆物种中, P. nebulosus最先分离出来, 余下的物种则分成两个支系(图 3)。

Dryobates属5个物种cytb基因NJ树显示, D. minor与D. cathpharius为姐妹种, 一起与其他三种构成姐妹群, D. scalaris与D. nuttallii为姐妹种, 并且一起与D. pubescens形成姐妹群(图 4)。

Picoides属6个物种cytb基因序列NJ树显示, P. tridactylus与P. arcticus为姐妹种, 一起与其他四种构成姐妹群, 四种啄木鸟的分离顺序依次为P. kizuki、P. maculatus、P. moluccensis和P. canicapillus(图 5)。

3 结论

此前, Winkler等(2014)利用ML法和贝叶斯推论对旧大陆啄木鸟进行系统发育研究, 他们的结果被广泛接受, 成为啄木鸟现行分类系统的基础^[6]。遗憾的是他们只对旧大陆的啄木鸟进行了研究。后来有人通过超级矩阵使用了25个基因位点对179种啄木鸟进行系统发育分析, 研究比较系统地对啄木鸟群体的关系进行了探讨, 但这项研究从GenBank收集的数据截止于2014年7月^[13]。一来数据陈旧, 二来, 其数据缺失严重^[12]。最近的研究利用ML法和贝叶斯推论对啄木鸟科进行进化树构建, 此研究采用6个基因位点涉及203种啄木鸟^[12]。但此研究采用的基础分类系统中共包含217种啄木鸟, 但目前认为啄木鸟现生为254种, 因此这个系统是有缺失的^{[18, 19]}。三项研究的结果很大程度上是相同的, 在部分物种的关系上结果不同, 这些差异与他们采用的基础分类系统和使用的基因位点有关。结合三者的研究成果, 如啄木鸟亚科应为单系群, Hemicircus属和Nesoctites属分别与啄木鸟亚科多有报道的姐妹关系, 对比三种树的自举检验支持度, 我们认为ML树的拓扑结构更为合理(图 2)^{[6, 12-13]}。研究结果支持了大量已有的啄木鸟分类研究成果^{[6, 12, 20-21]}, 同时也发现了一些新的问题。

3.1 啄木鸟科179种系统发生关系

首先, 蚁亚科是最古老的啄木鸟类群, 并且与剩下的其他啄木鸟形成姐妹群目前是被广泛接受的。对于姬啄木亚科, 利用超级矩阵对179种啄木鸟进行的系统发育分析结果认为, 姬啄木亚科为单系群, Picumnus与(Verreauxia, Sasia)共同构成的支系形成姐妹群^[13]。但Shakya等和Winkler等分别利用ML法和贝叶斯推论对啄木鸟科进行的系统发生研究认为姬啄木亚科是并系群, 而我们的结果支持后者^{[12, 6]}。针对Picumnus属, P. innominatus与属内其他啄木鸟形成姐妹群, 此后又分离出与剩下的啄木鸟构成姐妹群的P. nebulosus。虽然目前认为这些物种的亲缘关系目前并不明确^[12], 但结果显示Picumnus属剩下的啄木鸟为单系群, 并且分成两个彼此构成姐妹群的支系。

此外, 在Picumnus属中, P. innominatus作为一种古老的啄木鸟, 其分化时间大约在1300万年之前^[12], 谭耀匡等根据形态学差异(主要是羽毛颜色图案)将P. innominatus分为5个亚种^[22]。P. innominatus广泛分布于亚洲南部的喜马拉雅山脉地区, 山脉的隔离作用和漫长的进化时间为多样化提供了条件。因此, 利用5个P. innominatus个体ND2序列与本属其他物种ND2序列进行属内分子进化树的重建。发现与同属各物种相比, 5个同种个体间遗传差异并没有被掩盖(图 3)。这意味着一直以来, P. innominatus种内遗传差异确实被低估了。

相对前两亚科, 啄木鸟亚科的情况更为复杂。结果显示啄木鸟亚科为单系群, 虽然bootstrap支持度低, 但此前曾有人利用贝叶斯法得出相同的结果^{[12, 13]}。总体上, 亚科内各族形成一个支系, 亲缘关系基本与我们采用的分类系统吻合, 但有两点与传统认识有所不同。

首先Hemicircus属和Nesoctites属的系统发生地位还需要进一步探讨。在过去相当长一段时间内, Nesoctites一直被认为是姬啄木亚科的一个属。Goodge发现Nesoctites micromegas虽然与姬啄木亚科的其他物种非常相似, 但它与啄木鸟亚科的物种也共享许多特征^[8]；Winkler和Christie认为其与姬啄木亚科其他物种关系较远, 建议将其提升为姬啄木亚科的一个族^[23]；Benz和Winkler都认为Nesoctites与啄木鸟亚科为姐妹群, 建议将其独立为一个亚科, 但他们都没有讨论Hemicircus属的地位^{[6, 20]}。此后又有研究认为Hemicircus属与啄木鸟亚科构成姐妹群^[24]。三种方法构建的树所得结果并不一致, ML树显示这两个属互为姐妹群, 虽然自举检验的支持度不高, 但此前曾有过研究得出过相同的结论^{[12, 13]}。Hemicircus属、Hemicircus属与啄木鸟亚科彼此之间显现出与谱系分析结果不相称的形态学差异, 且三者的关系不甚清楚, 这可能由于三者之间的关系很近而导致算法不能正确识别^[13]。Hemicircus属和Hemicircus属, 其分布地距离遥远, 两属物种形态差异巨大, 但考虑到趋同进化和适应性进化在啄木鸟亚科物种中时有发现, 这或许是对不同分布地环境适应性进化的结果。

此外, Geocolaptes olivaceus的系统发生地位也与传统认识有所不同。Geocolaptes olivaceus与Campethera属的姐妹关系曾多有报道^{[20, 25-27]}, 但值得注意的是, 在这些报道中多以一个物种代表Campethera属进行分析。此前曾有研究显示出不同的结果, 但没有得到科学家的关注^{[12, 13]}。而在本结果中, Geocolaptes olivaceus插入了Campethera属的支系中(图 2), 这与传统认为的姐妹群关系并不相符。虽然数据量有限, 但结果也否定了Geocolaptes olivaceus与Campethera属的姐妹关系。Geocolaptes olivaceus与Campethera属物种共同分布于非洲南部, 但在形态特征与习性上差异巨大。Geocolaptes olivaceus体棕褐色, 腹部红色, 是少数营地巢的啄木鸟之一, 好贫瘠有巨石的山坡, 食物主要是蚂蚁及其幼虫, 以及昆虫的蛹和卵。它们从死树或者岩石缝隙里寻找食物, 也会在地上觅食^[7]。Campethera属共13种啄木鸟, 体为绿色, 头红色, 营树巢, 凿树取食^[7]。推测这种形态和行为上的巨大差异因为同域分布的强烈竞争而产生, 实际上, 它们在系统发育上的差异并没有表型表现的这么大。

3.2 地理分布

在结果中能观察到姐妹群分别分布于新大陆和旧大陆的分布模式, 根据分离时间可将其分为两组(图 2)。第一组包括四对分别是(1)Picumnus属同一属内包含新旧大陆姐妹群体；(2)(Dryocopus, Mulleripicus)两属构成的支系和(Celeus, Piculus, Colaptes)构成的支系；(3)Chrysocolaptes属和Campephilus属；(4)Nesoctites属和Hemicircus属。第二组包括2对, (1)Dryobates属和(2)Picoides属, 两属属内分别包含新旧大陆姐妹群体。不同的是, 之前有研究认为Dryocopus属和Leiopicus属也在此列^[12], 但根据国际鸟盟公布的啄木鸟分布数据, 其分布地并未跨越新旧大陆。第一组姐妹群体新旧大陆物种隔离时间比第二组更早(图 2), 其迁移时间大约在1000万年前, 而第二类在大概在500至700万年前^[12]。

从系统发生来看, 旧大陆物种相对新大陆物种更为古老, 说明旧大陆物种曾向新大陆迁移, 迁移途径很可能是白令海峡(图 4, 图 5)。由于啄木鸟个体迁徙能力并不强, 除Picoides tridactylus的分布地横跨亚欧以及北美之外, 其他啄木鸟不存在跨板块分布。啄木鸟群体这种跨越板块的复杂格局显然是经历多次复杂的区域扩张和缩小事件, 而这很可能发生在第四纪冰川期^[12]。第一类啄木鸟群体在第四纪冰川前由欧亚大陆迁入北美, 并且向南扩张占领了南部地区。第二类啄木鸟迁入新大陆后主要分布于北部, 在当时由于气候更为温暖潮湿, 北部的分布范围比现在更广。冰川期到来之后, 啄木鸟分布分范围由高纬度地区向低纬度地区退缩, 新旧大陆完全隔离。在第四纪冰期与间冰期的循环中, 啄木鸟的分布范围跟随冰川范围发生变化, 冰期范围缩小, 间冰期范围扩张^[28]。一般认为物种形成需要三个步骤即:区域扩张, 领域分割和生殖隔离, 这三个步骤循环进行, 从而物种得以形成^[29]。在第四纪冰川期, 这种分布上的扩张和退缩在温带地区循环发生, 因此, 在成种能力方面, 热带地区低于温带地区, 但热带地区积累物种的有效时间是大于温带的。由于分离时间相对更短一些, 第二类物种的分化程度不如第一类明显。此外, 随着第四纪的到来, 气候由第三纪时的温暖潮湿到更加寒冷而干燥, 全球的森林覆盖范围萎缩, 而草地面积扩张^[30-32], 啄木鸟随森林覆盖范围的变动而迁移^[33]。

因此, 啄木鸟呈现分布热点位于赤道附近的东南亚地区和南美的分布模式的原因, 除了热带地区丰富的物质基础外, 也与物种累积时间有关。此外, 由于啄木鸟的特性, 森林覆盖是影响啄木鸟分布的重要因素, 这也是同属热带地区, 非洲大陆啄木鸟种类低于南美和东南亚的一个原因。

致谢: 东北林业大学野生动物资源学院周瑜博士对本研究给予帮助，特此致谢。