遗传多样性为物种涵盖的种群间和种群内个体间遗传变异的总和, 包括表型、细胞学、生化和分子等多层次遗传变异^[1]。其中表型是各种形态特征的组合, 是生物受制于生态环境条件的遗传变异的表征^[2], 其表型变异是遗传多样性研究的重要内容^[3-4]。同时, 利用表型性状研究遗传多样性也最为简便、快速和经济, 可以直观的揭示种群的遗传结构与变异大小, 是遗传育种工作的基础^[5-6]。国内外学者利用表型性状对思茅松^[7]、五角枫^[8]、云南松^[9]、闽楠^[10]、拟南芥^[11]等植物种群进行了遗传多样性分析与评价, 阐明了种群变异结构、来源和规律, 为相关树种的资源收集、保护或遗传改良奠定了基础。

红松(Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.)隶属于松科(Pinaceae)松属(Pinus), 是我国东北珍贵而稀少的常绿乔木^[12]。近百年来, 由于过量采伐红松天然林, 致使红松资源锐减^[13], 已被国家二级保护植物^[14]。因此, 为保护红松种质资源, 国家从20世纪80年代中期开始在东北地区不同区域建立红松种子园(例如露水河红松种子园)^[15], 然而, 这批种子园的建园材料是只经过表型性状初选的优树, 其选育的遗传基础鲜有报道。以往有人利用分子技术从遗传多样性方面进行了这方面的研究^[16-18], 但从表型性状方面还未开展过相关研究。因此, 本研究采用表型性状, 针对种子园收集的不同区域红松的遗传多样性进行评估, 为以后红松种子园资源收集和育种策略提供基础资料。

1 材料和方法 1.1 实验地概况

吉林省露水河红松种子园, 位于东经127°47′, 北纬42°28′, 海拔760—800 m, 属季风性中温带气候类型。该红松种子园于1988年定植, 种子园内红松由小兴安岭、完达山、张广才岭和长白山地区共17个种源地的优良无性系组成。采用完全随机排列设计, 株行距3 m×3 m, 建成红松无性系种子园1个大区, 17个小区, 共660个无性系, 面积16.33 hm²。

1.2 材料来源和样品采集

于2017年8月和10月对种子园内6个种群红松的完整叶片和成熟球果进行采集和形态数据测定工作。采样种群的原产地分别为：吉林省露水河和黄泥河; 黑龙江省大海林、东方红、带岭和丰林, 该6个种群代表了我国红松不同的自然分布区, 而且能反映出分布区的特点(图 1)。每种群选取30个单株进行调查和采样, 单株间距50 m以上, 保证取样均匀性, 最大限度降低母树间的亲缘关系。

1.3 表型性状的测定

从采样单株上随机采集并测量无病虫害、生长旺盛、完整的两年生针叶10束和成熟的球果10个, 选择了15个易于获取和测定的遗传上相对稳定的表型性状, 用游标卡尺(精确到0.01 mm)分别测定并记录红松的针叶长(NL)、针叶粗(NW)、针叶束粗(FW)、球果长(CL)、球果宽(CD)、种子长(SL)、种子宽(SD), 用电子天平(精确到0.01g)分别称量单个球果重量(CW)、单果产种量(CSY)和百粒重(HSW), 其中百粒重随机3次重复测量100粒种子, 然后计算出针叶长/针叶粗(NL/NW)、针叶束粗/针叶粗(FW/NW)、球果长/球果宽(CL/CD)、产种率(CSY/CW)和种子长/种子宽(SL/SD), 精确到0.01。

1.4 数据处理与分析

红松种群的表型变异特征采用巢式设计方差分析^{[1, 3]}, 线形模型为: Y_ijk=μ+S_i+T_(i)j+ε(ij)k, 式中Y_ijk为第i个种群第j个个体第k个观测值, μ为总均值, S_i为种群效应(固定), T_(i)j为种群内个体效应(随机), ε(ij)k为试验误差。同时进行多重比较和差异性检验, 分别计算6个种群各个性状的平均值(X)、标准偏差(SD)、和变异系数(CV), CV=SD/X。为了与基因分化系数(Gst)相对应, 按下式计算出了反映种群间表型分化的值定义：Vst=(δ²t/s)/ (δ²t/s+δ²s), 式中δ²t/s为种群间方差分量、δ²s为种群内方差分量, Vst为表型分化系数, 表示种群间变异占遗传总变异的百分比, 表明表型变异在种群间贡献的大小^[19]。基于15个性状数据, 对6个红松种群进行非加权组平均法(UPGMA)聚类分析^[20]。

数据经Excel 2016整理后, 巢式方差分析、表型性状的平均值、标准差和变异系数、差异性检验和多重比较和表型分化系数均在R 3.2.5中完成, 聚类分析在SPSS19.0中完成。

2 结果与分析 2.1 种群间和种群内的表型变异

对种子园红松6个种群15个表型性状进行巢式设计方差分析(表 1), 红松15个表型性状在种群间和种群内均差异显著(P < 0.01), 表明红松的表型性状在种群间和种群内存在广泛的变异。对各种群均值进行Turkey ′s多重比较, 发现红松15个表型性状在种群间存在广泛的变异, 但不同性状在各种群间变异式样不同(表 2)。针叶性状中NL、NW和FW在种群间差异显著, 露水河种群最大, 分别为12.65 mm、0.99 mm、2.02 mm；东方红种群NL最小, 仅为11.1 mm；带岭种群的NW和FW最小。NL/NW和FW/NW代表针叶的叶型指数, 这两种性状最大的是带岭种群, 分别为14.24和2.08。6个球果性状中CL、CD和CL/CD在种群间的差异都较小, 变异的范围分别为14.27—15.35 cm、9.46—10.04 cm和1.42—1.56；然而CW和CSY这两个球果的质量性状在种群间的差异较大, 露水河种群最大, 分别为298.33 g和89.13 g；带岭种群最小, 分别为235.99 g和68.9 g。CSY/CW变异范围为28.77—34.03。同时, 红松4个种子性状在种群间的差异也较小, SL、SD和HSW均值最大的是露水河种群(17.29 mm、11.29 mm和69.93 g)。

从各种群的地理分布来看, 不同性状在种群间多表现为显著性差异。在所测的15个表型性状中, 露水河种群在其中10个表型性状均值上表现出最高值, 其位置为最南端, 即纬度最低；而在6个种群中出现低值的种群则比较分散。

2.2 表型性状的分化

根据巢式方差分析结果, 各性状方差分量和表型分化系数分析见表 3, 15个表型性状种群间的方差分量占总变异的百分比波动于0.62%—29.95%, 平均为9.28%；种群内的方差分量占总变异的百分比为31.81%—89.07%, 平均为65.11%；随机误差的方差分量百分比为9.03%—67.57%, 平均为25.61%。各性状种群内的方差分量均大于种群间的方差分量, 说明种群内的变异是红松表型总变异的主要部分。

同时, 针叶、球果和种子性状Vst的变异幅度为0.95%—35.67%, 15个表型性状的平均表型分化系数为12.39%, 说明红松种子园种群表型变异在种群间的贡献占12.39%, 种群内贡献占87.61%, 种群内多样性大于种群间多样性。其中表型分化系数最大的性状为FW, 为35.67%；其次为NW, 为33.27%, 最小的为FW/NW, 为0.95%, 15个表型性状均表现为种群间的表型分化系数低于50%, 说明红松种子园种群表型变异主要存在于种群内。

2.3 表型性状的变异特征

不同性状在6个种群中的变异情况有显著差别(表 4), 各性状在种群内的总平均变异系数为13.28%, 变幅为6.16%—31.48%, 在15个表型性状中球果单果产种量的变异系数最大(CV=31.48%), 其次为单果的球果重和出种率, 变异系数分布为27.46%和20.42%, 这3个性状变异程度明显高于其他性状, 表明球果性状的质量性状变异较其他性状变异大, 较其他性状的稳定性差。此外, 分别计算红松种群内针叶、球果和种子3个生物学性状的平均变异系数, 得出球果的平均变异系数最大(CV=17.86%)、其次为针叶性状(CV=11.19%), 种子性状的变异系数最小(CV=9.87%), 进一步说明种子性状较其他性状的稳定性高, 而球果性状的稳定性最差。

此外, 种子园红松同一性状在不同种群间的变异系数也有一定差异, 平均变异系数范围为11.79%—15.77%, 带岭和丰林种群的性状平均变异系数要高于其他种群, 说明带岭和丰林种群的表型多样性程度高于其他种群。由于种子园地处相同的环境, 因此可以说明的是种子园不同种群的基因型不同, 从而导致了种群表型变异的差异。因此, 可以推断出带岭和丰林地区的红松基因型的多样性也高于其他种群。

2.4 表型性状的聚类分析

采用欧式平均距离UPGMA聚类方法对6个种群的15个表型性状数据进行聚类分析(图 2), 当欧式平均距离的阈值为2时, 6个种群明显分化为4类, 第一类为露水河种群, 第二类为东方红种群, 第三类为黄泥河种群和大海林种群, 第四类为带岭和丰林种群。聚类结果与种子园6个种群的地理距离相一致, 聚类出4大类群与我国东北地区地形有一定程度的契合, 露水河种群隶属长白山山脉, 东方红种群为完达山山脉, 黄泥河和大海林种群属于张广才岭山脉, 而带岭和丰林种群坐落于小兴安岭山脉, 当从而验证了山脉形成地理隔离, 从而导致物种遗传变异和分化的理论。

3 结论与讨论 3.1 红松不同种群表型变异来源

通过对露水河种子园的6个种群的针叶、球果和种子的15个表型性状的研究发现, 红松的表型性状在种群间和种群内都存在极显著的差异。这种变异在松树中广泛存在, 如海岸松^[21]、欧洲赤松^[22]、思茅松^[7]等, 显著的表型差异暗示红松存在丰富的遗传变异。表型变异的结论与诸多遗传多样性的分析结论一致, 即红松种群遗传多样性比较丰富^[23-25], 李斌等对松属植物遗传分化进展的研究得出了相似的结果^[4]。

红松15个表型性状的平均分化系数Vst=12.39%, 说明种群内变异(87.61%)显著高于种群间变异(12.39%), 种群内变异是红松的主要变异来源, 这反映了种群G×E的复杂性及其适应特殊环境选择压的广泛程度, 由于种子园6个红松种群地处相同的生态环境, 故其表型性状之间的变异主要是来源于遗传方面所造成。与其他针叶树种的分化比较, 红松表型性状的分化处于中等水平, 高于西特喀云杉(10.1%)^[26]、花旗松(11.1%)^[27]和马尾松(6.44%)^[19], 却低于油松(38.97%)^[28]、云南松(25.27%)^[9]和白皮松(22.86%)^[3]等。有研究表明, 红松的繁育系统可能是红松种群内变异的主要来源, 繁育系统是影响物种种群遗传结构的关键因素, 尤其是交配系统和基因流^[29]。例如, 针叶树花粉的迁移距离很大, 外部花粉(基因)的迁入减少了种群间的差异^[30]；典型的异花授粉植物的交配系统可以促进种群间的基因交流, 增加有效种群大小, 减少基因漂变对遗传结构的影响^[29]；红松为风媒异花授粉的裸子植物, 具备远距离扩散种子的可能, 可以促进基因流的流动, 从而减少种群间的差异^[31]。尽管种群内的变异远远大于种群间的变异, 但种群间变异的意义却大于种群内变异, 因为存在于种群间的变异反映了地理、生殖隔离上的变异, 种群间的多样性变异是种内多样性的重要组成部分^[32]。

3.2 红松不同种群表型变异特征

植物种群中变异系数是衡量各观测值离散程度的统计量, 变异系数的大小可间接反映出种群的表型多样性丰富程度, 即变异系数大说明该种群的性状变异幅度高, 表型多样性丰富, 可能存在的遗传变异越丰富, 种群内多种基因型所对应的表型范围越广, 可以使种群整体更加适应环境的变化^[33]。本研究中红松15个表型性状中的变异系数幅度为6.16%—31.48%, 平均13.28%, 变化范围较大, 说明红松种群内表型性状遗传变异较丰富。其中球果变异系数(17.86%) >针叶变异系数(11.19%) >种子变异系数(9.87%), 可以看出营养性状的变异水平大于繁殖性状的变异水平, 营养性状变异更丰富。研究表明, 环境变化容易引起植株的高矮、叶片的长短等营养性状的变化, 而繁殖器官的变异则经历了较为复杂的发育分化后改变较少, 环境的不同是导致营养器官变异的主要原因^[8]。红松种子的稳定性最大, 在一定程度上可以反映红松遗传变异的程度越小, 红松种子是传递遗传物质的载体, 变异较小, 稳定性较高, 受到环境影响较小。同时, 单个球果重量、单果产种量和百粒重的变异幅度明显大于其他表型性状, 这3个表型性状有可能主导红松发生表型变异的方向, 球果质量和千粒重对植物的成功定居有重要的影响^[34]。

3.3 红松不同种群表型分化的地理变异规律

种群的分布以及UPGMA聚类结果表明, 红松表型按照地理距离而聚类, 聚类出的4四大类群与我国东北地区地形有一定程度的契合, 带岭和丰林种群、黄泥河和大海林种群分布区域距离较近, 且分别属于小兴安岭山脉和张广才岭山脉, 东方红种群属于完达山山脉, 露水河种群属于长白山山脉, 因而利用地理区划对红松表型进行划分是可行的。一般来说植物表型性状的地理变异规律比较复杂, 几乎都是由环境和基因型共同决定的, 因物种的不同而异, 如野生玫瑰表型性状主要依地理位置而聚类^[35], 而五角枫性状的表型特征没有依地理距离而聚类^[8]；川西云杉表现出以经度和纬度并存的变异模式^[36], 而浙江楠却呈现出以海拔变异为主的梯度规律性^[5]。但本研究所选的6个种群已经排除了环境因素的干扰, 其山脉划分的依据主要是遗传方面即基因型不同导致的原因。种子园6个红松种群的产地中, 地处相同山脉的水热条件极为相似, 基因交流还能正常进行；而在不同山脉间已经产生地理隔离, 造成基因交流障碍, 突变成不同的基因型, 因此红松表型性状表现出以山脉变异的规律性。另外, 本研究结果在利用分子手段研究红松的遗传变异方面得到了验证, 如红松各种源在遗传多样性方面的差异与其地理分布明显相关, 其中小兴安岭种群的遗传多样性较高, 且与张广才岭种群遗传距离较近, 而与长白山种群和老爷岭种群遗传距离较远^{[24, 37]}。但也有研究认为红松不同种源的遗传距离和地理距离相关性不明显, 造成这一现象的原因是与红松不同种群分布区特定的地理、气候等因子有关, 地理距离相近的种群之间可能存在某种特定的隔离机制, 阻碍基因交流；此外, 还可能与种群之间不同的形成机制和演化历史有关^{[17, 25]}。因此, 有待进一步验证。

3.4 红松保护对策与建议

红松为我国二级保护珍贵用材树种, 通过长期的地理隔离、自然选择和人工选择, 产生了极其丰富的表型变异, 这些表型性状的变异都是基因型和环境因子共同作用的结果, 表型变异越大, 可能存在的遗传变异就越大。目前, 由于红松天然林面积不断减少, 破坏极为严重, 因此就红松的保护和发展提出如下建议：(1)本文结论之一就是红松种群遗变异比较丰富, 在松属植物中属于中等水平。因此加强现有天然林的保护, 禁止采伐天然林保留林木, 同时保护其生境, 对维持红松遗传多样性水平至关重要；(2)根据本文中红松15个表型性状在种群间和种群内均存在着极显著的差异, 并且遗传变异主要存在于种群内的结论, 应以种群为单位, 开展红松种群生态遗传学研究, 分析红松种群的遗传多样性, 结合分子生物学分析红松濒危的关键因子和濒危过程；(3)带岭和丰林种群表型性状遗传多样性要高于其他种群, 因此可选择一定数量的林分优先进行原地保存, 同时利用与异地保存相结合的手段, 营建红松母树林、种子园和收集圃等, 从而对红松基因库保存提供有利保障。