2017, Vol. 37文章信息
- 高远, 李隔萍, 施宏, 刘慧, 任安芝, 高玉葆
- GAO Yuan, LI Geping, SHI Hong, LIU Hui, REN Anzhi, GAO Yubao.
- 感染内生真菌的羽茅对大针茅的化感作用
- Allelopathic effect of endophyte-infected Achnatherum sibiricum on Stipa grandis
- 生态学报. 2017, 37(4): 1063-1073
- Acta Ecologica Sinica. 2017, 37(4): 1063-1073
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201604160704
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文章历史
- 收稿日期: 2016-04-16
- 修订日期: 2016-08-15
植物化感作用 (allelopathy) 是指活体植物通过雨雾淋溶、茎叶挥发、根系分泌以及植物残体的腐解等途径向环境中释放化感物质而影响其他有机体生长和发育的化学生态学现象[1]。化感作用广泛存在于草地生态系统中, 并已成为当前生态学研究的热点[2]。化感物质 (allelochemical) 主要来源于植物的次生代谢产物[3], 其可对邻近植物的生长发育 (如种子萌发、幼苗生长) 过程产生有利或有害的影响。在自然界中, 水溶性的化感物质主要通过雨雾淋溶的方式进入土壤发生化感作用, 因此, 研究植物浸提液中的化感物质产生的化感作用对草地植物种子萌发及幼苗生长的影响可为探究退化草地的恢复重建、植物的入侵机制提供理论依据, 并在阐明植物个体及种间的相互作用机制和构建植物群落中起重要作用[4-6]。
禾草内生真菌 (fungal endophyte) 是指能够在禾草中度过大部分或全部的生命周期, 但不使宿主植物表现明显病害症状的一大类真菌[7], 其中研究最多的是香柱菌属 (Epichloё), 其无性型被命名为Neotyphodium属[8]。大量研究表明, 感染内生真菌可使宿主禾草的竞争能力显著增强[9-16]。Vázquez-de-Aldana等[14]提出内生真菌对宿主植物竞争能力的影响可能体现在3个方面：(1) 内生真菌能够促进宿主禾草的生长发育, 进而提高宿主的竞争优势, 如Vila-Aiub等[17]发现, 与未感染内生真菌植株相比, 感染内生真菌显著提高了宿主黑麦草 (Lolium perenne) 的种子萌发、分蘖生长和生物量的积累; Malinowski和Belesky等[18]研究表明, 内生真菌的存在可以促进宿主植物的根系发育和叶片生长。(2) 内生真菌能增强宿主植物对昆虫[19]和食草动物[20]的取食、病原菌[21-22]的侵染等生物干扰, 以及干旱[23]、低养分[24]和重金属[25]等非生物胁迫的抵抗能力, 使宿主植物的竞争能力显著增加。(3) 内生真菌可引起宿主体内化学物质的变化进而改变植物的化感潜力, 但这一推测目前还缺乏足够的实验证据。
目前, 对于禾草-内生真菌共生关系的研究多集中于高羊茅 (Festuca arundinacea) 和黑麦草等栽培禾草, 而对天然禾草-内生真菌相互作用的研究较少。由于长期的定向选育, 高羊茅和黑麦草等栽培禾草通常只感染1种内生真菌, 而天然禾草可感染多种内生真菌[26]。Sullivan和Faeth[27]发现亚利桑那羊茅 (Festuca arizonica) 自然种群感染有2种内生真菌N.tembladerae和N.huerfanum; Iannone等[28]发现不同地理种群的雀麦 (Bromus auleticus) 中也感染有2种内生真菌N.pampeanum和N.tembladerae; Leuchtmann等[29]甚至在三柄麦 (Hordelymus europaeus) 中发现感染有6种不同内生真菌。那么禾草的化感潜力是否因内生真菌种类的不同而不同呢？目前尚未见报道。
内蒙古草原是我国重要的畜牧业生产基地, 也是我国北方重要的生态防线[30]。魏宇昆等[31]对内蒙古草原天然禾草内生真菌感染状况调查发现, 所调查的21属43种禾本科植物中, 27种感染有内生真菌。其中, 羽茅 (Achnatherum sibiricum) 的内生真菌感染率最高 (86%-100%), 分布范围最为广泛。羽茅为禾本科芨芨草属的一种多年生草本植物, 在我国东北、华北等多个地区均广泛分布, 多为伴生植物[32], 而丛生禾草大针茅 (Stipa grandis) 是其所在群落的优势种。本课题组前期的研究发现, 同一地理种群的羽茅通常感染有2种Epichloë属内生真菌：即Epichloë sibiricum和Epichloë gansuence[33], 其中E. sibiricum只发现有无性型Neotyphodium sibiricum(Ns), 而E. gansuensis既有无性型N.gansuensis(Ng) 也有有性型E. gansuence(Eg)[34], 因此, 羽茅是研究不同种类内生真菌对宿主禾草影响的理想材料。本实验以羽茅为材料, 探讨感染不同内生真菌的羽茅对其所在群落优势种大针茅的化感效应, 并采用气相色谱-质谱 (GC-MS) 联用技术对羽茅浸提液中的化学成分进行了分析, 为进一步预测内蒙古草原的植被群落动态变化及草地生态系统的保护提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 种子的采集羽茅种子于2012年采集自中国农业科学院呼伦贝尔草原生态系统国家野外科学观测研究站 (119.67°E, 49.100°N), 海拔629m, 年平均降雨量约为367mm, 年均温为-2℃, 土壤为暗栗钙土。对获得的种子使用苯胺蓝染色法进行内生真菌的检测[35], 结果表明采集地的羽茅种子中内生真菌感染率为100%。对羽茅种子进行内生真菌的分离纯化[36], 首先从采自同一穗的种子中选择5粒饱满的种子放入7mL离心管中, 先在50%硫酸中浸泡20min, 将硫酸倒出后用无菌蒸馏水冲洗3次, 然后在3%次氯酸钠中浸泡20min, 将次氯酸钠倒出并用无菌蒸馏水冲洗3次, 最后将种子保存在无菌蒸馏水中。在无菌超净工作台内将表面灭菌后的羽茅种子接种到PDA培养基 (200g/L土豆, 15g/L琼脂, 20g/L葡萄糖) 上。之后使用封口膜将培养皿封好并将其置于25℃恒温培养箱中黑暗培养。待白色菌丝从种子表面或边缘长出时, 挑取菌丝进行3次单胞纯化以获得单胞菌落。以每个菌株的tub B和tef A序列作为靶序列, 用GenBank中的BLAST程序搜索同源序列一起进行系统发育分析, 并结合形态学方法鉴定获得如下内生真菌：N.sibiricum、N.gansuensis和E.gansuensis。采自同一穗的种子通常感染同种内生真菌, 将感染不同内生真菌羽茅的种子分为两份, 一份置于4℃冰箱保存, 另一份在60℃下高温处理30d, 以获得不染菌种子。这种高温处理的方法能够使羽茅种子所感染的内生真菌失活, 并且对种子发芽、幼苗及成株生长均无显著不利影响[37]。
大针茅为多年生密丛型旱生草本植物, 是亚洲中部草原亚区最具代表性的建群植物之一, 也是划分草原植被的指示植物[38]。实验所使用的大针茅种子于2012年采集, 由内蒙古大学梁存柱教授惠赠。
1.2 不同内生真菌感染状况的羽茅种群构建选取不同内生真菌感染状况的羽茅种子浸泡过夜后播种到直径20cm高20cm, 装满蛭石的塑料花盆中, 置于南开大学网室 (允许透过80%以上的自然光, 不透水) 培养, 光照每天8h左右, 温度10-30℃。待植株生长一个月后, 选取长势一致且生长良好的幼苗, 每盆定株到10株用于实验。每周浇灌1次Hoagland完全营养液, 每次500mL/盆, 从2015年4月5日至6月29日共持续85d。不同内生真菌感染状况的羽茅各种植5盆, 收获后将同种内生真菌感染状况的羽茅绿叶混合备用。
1.3 羽茅浸提液的制备称取不同内生真菌感染状况的羽茅绿叶各20g, 将其剪成2cm长的小段, 用200mL蒸馏水浸泡48h后, 双重过滤。第一重用定量滤纸过滤, 第二重用0.45μm的滤膜过滤, 制备得到不含微生物的浓度为0.1 g/mL的羽茅浸提液原液, 将原液稀释得到0.01、0.03 g/mL和0.05 g/mL的浸提液, 置于4℃冰箱中冷藏备用。
1.4 化感活性生物测定试验采用室内生物测定法。取直径9cm的培养皿洗净、烘干后铺入两层灭菌滤纸, 将消毒后的大针茅种子均匀放入培养皿中, 每皿50粒, 然后向培养皿中分别倒入6mL 3种不同浓度的羽茅浸提液。用蒸馏水处理作为对照 (CK), 每个处理设6次重复。
将培养皿置于人工智能培养箱中恒温25℃下暗培养3d, 从第4天起在温度25℃、光照12h条件下培养。试验期间适量补充浸提液以保持滤纸湿润。种子开始发芽后, 每天观察并记录发芽种子数目 (胚根或胚轴突破种皮1-2mm为萌发), 直至连续2d无种子萌发为止, 从2015年7月16日至8月1日共历时17d。计算大针茅种子的发芽率及发芽势, 计算公式[39]如下：
发芽率=(发芽种子数/供试种子总数)×100%
发芽势=(前10d内正常发芽的种子数/供试种子总数)×100%
在培养期末, 于每个培养皿中挑选10株健壮幼苗, 用吸水纸吸干水分, 用直尺测定每株幼苗的苗高和根长, 并用电子天平称量这10株幼苗的干重 (105℃杀青0.5h后, 70℃烘干至恒重)。
1.5 羽茅浸提液化学成分分析选取化感活性较强的未染菌 (E-) 羽茅浸提液和活性较弱的感染Eg的羽茅浸提液进行气相色谱-质谱 (GC-MS) 物质测定。各取10mL羽茅浸提液母液, 加入等量的石油醚萃取得到石油醚萃取物, 用旋转蒸发仪在40℃下浓缩至干, 再用1mL石油醚溶解, 进样GC-MS分析。
GC条件：色谱柱为HP-5MS; 石英毛细管柱 (30m×250μm×0.25μm); 升温程序为初始温度70℃, 以15℃/min的速率升至180℃, 保持5min, 再以10℃/min升至220℃, 保持15min; 载气为He (99.99%), 柱流速为1mL/min, 不分流; 进样口温度为280℃。
MS条件：EI离子源, 离子源温度为230℃; 电子能量为70eV; 扫描范围为39-450amu; 采集方式为全扫描。
采用Agilent数据分析软件和NIST11谱库兼顾色谱保留时间定性, 采用峰面积表示物质含量。根据“80%原则”[40], 采用谱库匹配系数大于等于80%的化合物进行分析。
1.6 潜在化感物质的验证试验参考周宝利[41]等的方法。将2, 4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸、邻苯二甲酸二丁酯和硬脂酸甲酯先用无水乙醇溶解, 再逐渐加入蒸馏水, 配制得到0.01、0.05mmol/L和0.10mmol/L的溶液, 乙醇最终浓度为1.5%, 以1.5%乙醇作为对照 (CK), 设置6个重复。取不同浓度的溶液6mL分别加入铺有两层灭菌滤纸的干燥培养皿中进行大针茅种子萌发和幼苗生长试验, 具体方法同1.4。
1.7 数据处理试验数据用Excel 2010软件录入, 采用SPSS 21.0软件进行数据的分析处理, 文中数据均以“均值±标准误”表示。
2 结果与分析 2.1 羽茅浸提液对大针茅种子萌发的影响大针茅种子的发芽率受羽茅浸提液浓度的显著影响, 且4种不同内生真菌感染状况的羽茅浸提液均表现出“剂量效应”, 即随浸提液浓度的增大, 对大针茅种子发芽率的抑制作用逐渐增强 (表 1, 图 1)。大针茅种子的发芽率也受内生真菌的显著影响, 具体表现在：3种浸提液浓度条件下, 未染菌 (E-) 羽茅浸提液对大针茅种子发芽率的抑制作用均最强, 内生真菌感染可缓解宿主羽茅对大针茅发芽率的抑制作用, 且这种抑制效应与内生真菌种类有关, 相比于未染菌羽茅, 感染Eg可显著缓解宿主羽茅对大针茅的抑制作用, 而感染Ns、Ng有缓解羽茅对大针茅化感作用的趋势, 但同E-羽茅相比未达到显著差异 (表 1, 图 1)。
| df | 发芽率/% Germination rate | 发芽势/% Germination potential | 苗高/cm Seedling height | 根长/cm Root length | 苗干重/mg Shoot weight | 根干重/mg Radicle weight | |||||||
| F | p | F | p | F | p | F | p | F | p | F | p | ||
| C | 2 | 45.149 | ＜0.001 | 82.104 | ＜0.001 | 131.436 | ＜0.001 | 37.680 | ＜0.001 | 165.479 | ＜0.001 | 19.671 | ＜0.001 |
| E | 3 | 6.418 | 0.001 | 6.340 | 0.001 | 2.609 | 0.059 | 0.646 | 0.589 | 10.348 | ＜0.001 | 3.415 | 0.023 |
| C×E | 6 | 1.669 | 0.144 | 2.417 | 0.037 | 0.432 | 0.855 | 0.642 | 0.696 | 1.288 | 0.276 | 1.533 | 0.183 |
| 误差 | 62 | ||||||||||||
| C:浸提液浓度extract concentration, E:内生真菌感染状态endophyte infection status; 表中黑色字体表示差异显著 (P＜0.05) | |||||||||||||
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| 图 1 不同浸提液浓度和染菌状态对大针茅种子发芽率的影响 Fig. 1 Effects of different extract concentration and endophyte infection status on the germination rate of Stipa grandis |
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| 图 2 不同浸提液浓度下, 不同内生真菌感染状态对大针茅种子发芽势的影响 Fig. 2 Effects of different endophyte infection status on the germination potential of Stipa grandis under various extract concentration Eg: Epichloë gansuence; Ng: Neotyphodium gansuensis; Ns: Neotyphodium sibiricum; E-: endophyte-free |
大针茅种子发芽势受羽茅浸提液浓度和内生真菌的交互影响 (表 1, 图 2)。0.01 g/mL浸提液处理下E-羽茅对受体发芽势的抑制作用显著高于感染Eg的羽茅。而0.03 g/mL浓度水平下, 感染Ng和未染菌 (E-) 的羽茅浸提液对大针茅发芽势的化感作用强度显著高于感染Eg的羽茅。0.05 g/mL浸提液处理对大针茅种子发芽势的抑制作用最强, 但此浓度下内生真菌的感染状况对受体发芽势的影响无显著差异。
2.2 羽茅浸提液对大针茅幼苗生长的影响 2.2.1 羽茅浸提液对大针茅幼苗苗高和根长的影响大针茅幼苗的苗高受羽茅浸提液浓度的显著影响, 4种不同内生真菌感染状况的羽茅浸提液均表现出“低浓度无影响, 高浓度抑制”的浓度效应趋势 (表 1, 图 3)。与对照相比, 0.05 g/mL浓度水平的浸提液显著抑制受体的苗高, 而0.03 g/mL和0.01 g/mL浸提液水平对大针茅的苗高无显著影响。而内生真菌的感染状况对大针茅苗高的影响无显著差异 (表 1)。
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| 图 3 不同浸提液浓度对大针茅幼苗苗高和根长的影响 Fig. 3 Effects of different extract concentration on the seedling height and root length of Stipa grandis |
大针茅幼苗的根长也受羽茅浸提液浓度的显著影响, 且不同内生真菌感染状况的羽茅浸提液的作用趋势均表现为低浓度促进, 高浓度抑制 (表 1, 图 3)。与对照相比, 高浓度的0.05 g/mL浸提液处理显著抑制受体的根长生长, 而0.01 g/mL浓度水平可显著促进受体根的生长。但内生真菌的感染状况对受体大针茅根长的生长无显著影响 (表 1)。
2.2.2 羽茅浸提液对大针茅幼苗苗重和根重的影响大针茅的幼苗苗重受浸提液浓度的显著影响, 4种不同内生真菌感染状况的羽茅浸提液均表现出“低浓度无明显作用, 高浓度抑制”的效应趋势 (表 1, 图 4)。与对照相比, 0.05 g/mL浓度的浸提液对受体苗重表现出显著的抑制作用, 而0.01 g/mL和0.03 g/mL浓度水平的羽茅浸提液对幼苗苗重无显著影响。与苗高类似, 大针茅的幼苗苗重还受内生真菌的显著影响 (表 1, 图 4), 表现为3种浸提液浓度条件下, E-羽茅浸提液对大针茅幼苗苗重的抑制作用均最强, 感染Eg可显著缓解羽茅对大针茅幼苗苗重的抑制作用, 而感染Ns、Ng有缓解宿主羽茅对大针茅苗重化感作用的趋势, 但同E-羽茅的抑制作用相比未达到显著差异。
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| 图 4 不同浸提液浓度和内生真菌感染状态对大针茅幼苗苗重和根重的影响 Fig. 4 Effects of different extract concentration and endophyte infection status on the shoot weight and radicle weight of Stipa grandis |
大针茅幼苗的根重也受羽茅浸提液浓度的显著影响, 不同内生真菌感染状况的羽茅浸提液的作用趋势均表现为“剂量效应”, 即随浸提液浓度的增加, 大针茅幼苗根重受到的抑制作用逐渐增强 (表 1, 图 4)。另外, 受体大针茅的幼苗根重受内生真菌的显著影响 (表 1, 图 4), 表现在：3种浸提液浓度条件下, E-羽茅浸提液对大针茅幼苗的根重均具有最强的抑制作用。与未染菌羽茅相比, 感染Eg可显著缓解羽茅对大针茅幼苗根重的化感作用, 而感染Ns、Ng的羽茅对大针茅根重的抑制作用同E-羽茅相比未达到显著差异。
2.3 羽茅浸提液化学成分分析对化感活性较强的未染菌 (E-) 羽茅和化感活性较弱的感染Eg的羽茅浸提液样品经石油醚萃取后进行气相色谱-质谱联用仪分析, 并通过标准质谱数据库NIST11进行计算机检索, 鉴定出E-羽茅浸提液中含有19种物质, 而感染Eg的羽茅浸提液含有17种物质 (表 2), 其中, E-羽茅浸提液中主要有烷烃类化合物 (18.39%)、酯类 (5.07%)、有机酸 (2.93%)、对二甲苯 (2.68%)、萘 (2.61%)、醇类 (1.74%) 和酚类 (1.37%); 而感染Eg的羽茅浸提液中的主要成分是烷烃类化合物 (18.47%)、酯类 (2.60%)、对二甲苯 (2.36%)、萘 (1.94%)、有机酸 (1.89%)、醇类 (1.27%) 和酚类 (0.65%)。两种化感活性不同的浸提液中均含有2, 4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸、邻苯二甲酸二丁酯和硬脂酸甲酯, 只是化感活性较强的E-羽茅浸提液中的上述4种物质含量均高于Eg羽茅。
| 编号 No. | 化合物名称 Name of the chemical | 分子式Molecular formula | E--羽茅峰面积 Area of E--A.sibiricum/% | Eg-羽茅峰面积 Area of Eg-A.sibiricum/% |
| 1 | 对二甲苯p-Xylene | C8H10 | 2.68 | 2.36 |
| 2 | 二十八烷Octacosane | C28H58 | 0.26 | 0.34 |
| 3 | 十氢化-2, 3-二甲基萘烷Naphthalene, decahydro-2, 3-dimethyl- | C12H22 | 3.61 | 2.82 |
| 4 | 萘Naphthalene | C10H8 | 2.61 | 1.94 |
| 5 | 十四烷Tetradecane | C14H30 | 4.21 | 5.14 |
| 6 | 二十烷Eicosane | C20H42 | 4.33 | 2.39 |
| 7 | 9-甲基-二十六烷Hexacosane, 9-methyl- | C27H56 | 2.21 | |
| 8 | 十八烷Octadecane | C18H38 | 0.46 | 1.02 |
| 9 | 2, 4-二叔丁基苯酚Phenol, 2, 4-bis (1, 1-dimethylethyl) | C14H22O | 1.37 | 0.65 |
| 10 | 十六烷Hexadecane | C16H34 | 0.36 | 0.28 |
| 11 | 7, 9-二甲基十六烷Hexadecane, 7, 9-dimethyl- | C18H38 | 2.36 | |
| 12 | 二十一烷Hexadecane | C21H44 | 0.44 | 0.66 |
| 13 | 二十五烷Pentacosane | C25H52 | 1.21 | |
| 14 | 芳樟醇Linalool | C10H18O | 1.74 | 1.27 |
| 15 | 9-甲基-十九烷Nonadecane, 9-methyl- | C20H42 | 0.18 | 0.46 |
| 16 | 邻苯二甲酸Phthalic acid | C8H6O4 | 2.93 | 1.89 |
| 17 | 二十七烷Heptacosane | C27H56 | 0.48 | 3.00 |
| 18 | 3-甲基-十七烷Heptadecane, 9-methyl- | C18H38 | 0.64 | - |
| 19 | 邻苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalate | C16H22O4 | 3.79 | 2.07 |
| 20 | 硬脂酸甲酯Methyl stearate | C19H38O2 | 1.28 | 0.53 |
如表 3所示, 2, 4-二叔丁基苯酚对大针茅的化感作用基本表现为“低浓度无影响, 高浓度抑制”的现象。与对照相比, 当浓度为0.01 mmol/L时, 2, 4-二叔丁基苯酚除显著促进了大针茅幼苗的苗高生长外, 对其余指标均无显著影响; 当浓度为0.05 mmol/L时, 2, 4-二叔丁基苯酚显著抑制了大针茅种子的发芽率、发芽势及幼苗的根长生长; 当浓度为0.10 mmol/L时, 除苗干重外, 大针茅的发芽率、发芽势、苗高、根长和根干重等指标均受到显著抑制。
| 处理 Treatment | 浓度 Concentration/ (mmol/L) | 发芽率 Germination rate/% | 发芽势 Germination potential/% | 苗高 Seedling height/cm | 根长 Root length/cm | 苗干重 Shoot weight/mg | 根干重 Radicle weight/mg |
| 2, 4-二叔丁基苯酚 | CK | 81.24±2.18a | 75.64±3.36a | 8.26±0.42b | 5.74±0.34a | 23.43±1.02ab | 7.66±1.27a |
| 0.01 | 73.40±3.42ab | 62.38±2.81ab | 10.21±0.37a | 4.21±0.17ab | 27.26±2.17a | 7.48±0.69a | |
| 0.05 | 59.76±2.77b | 57.42±3.16b | 7.62±0.33b | 3.76±0.26b | 18.39±0.87ab | 6.71±0.55ab | |
| 0.10 | 42.16±1.86c | 35.67±1.38c | 4.25±0.52c | 3.92±0.38b | 17.65±0.42b | 6.28±0.31b | |
| 邻苯二甲酸 | CK | 81.24±2.18a | 75.64±3.36a | 8.26±0.42a | 5.74±0.34a | 23.43±1.02a | 7.66±1.27a |
| 0.01 | 62.16±2.16b | 57.68±2.45b | 6.78±0.47ab | 4.36±0.57a | 19.35±2.31a | 6.39±0.73b | |
| 0.05 | 46.26±3.21c | 42.37±1.79c | 6.46±0.39ab | 4.57±0.24a | 17.87±1.69ab | 6.56±0.37b | |
| 0.10 | 35.65±1.75c | 30.54±2.17c | 4.57±0.29b | 4.13±0.31a | 15.42±1.37b | 5.84±0.52b | |
| 邻苯二甲酸二丁酯 | CK | 81.24±2.18b | 75.64±3.36a | 8.26±0.42b | 5.74±0.34a | 23.43±1.02b | 7.66±1.27a |
| 0.01 | 92.35±2.62a | 68.47±3.25a | 12.46±0.57a | 5.86±0.35a | 31.37±1.56a | 7.86±0.75a | |
| 0.05 | 77.51±2.47b | 71.36±2.37a | 6.45±0.36c | 4.36±0.25a | 23.56±0.95b | 6.35±0.54a | |
| 0.10 | 56.94±1.82c | 52.82±2.46b | 5.16±0.42c | 4.57±0.36a | 18.74±0.77c | 6.51±0.28a | |
| 硬脂酸甲酯 | CK | 81.24±2.18a | 75.64±3.36a | 8.26±0.42a | 5.74±0.34a | 23.43±1.02a | 7.66±1.27a |
| 0.01 | 58.26±2.47b | 52.65±3.17b | 6.37±0.25b | 4.36±0.25ab | 19.47±1.56ab | 7.39±0.46a | |
| 0.05 | 45.85±3.12bc | 43.26±2.37b | 5.67±0.41b | 4.15±0.27ab | 16.59±1.08b | 7.57±0.35a | |
| 0.10 | 31.46±1.57c | 27.35±2.75c | 5.26±0.35b | 3.26±0.41b | 15.86±1.37b | 6.38±0.26a |
邻苯二甲酸对大针茅的化感作用表现为“剂量效应”的浓度效应趋势。与对照相比, 当浓度为0.01 mmol/L和0.05 mmol/L时, 邻苯二甲酸均显著抑制了大针茅种子的发芽率、发芽势和根干重, 但0.05 mmol/L的邻苯二甲酸对大针茅种子发芽率、发芽势的抑制效应达到极显著水平; 当浓度为0.10 mmol/L时, 除幼苗根长外, 大针茅的发芽率、发芽势、苗高、苗干重和根干重等指标均受到邻苯二甲酸的显著抑制。
邻苯二甲酸二丁酯对大针茅的化感作用表现为“低促高抑”的效应趋势。与对照相比, 0.01 mmol/L浓度的邻苯二甲酸二丁酯显著促进了大针茅种子的发芽率、苗高和苗干重; 当浓度为0.05 mmol/L时, 邻苯二甲酸二丁酯对大针茅幼苗的苗高有显著抑制作用, 对其余指标无显著影响; 而当浓度为0.10 mmol/L时, 除根长和根干重外, 大针茅的发芽率、发芽势、苗高和苗干重等指标均受到显著抑制。
与邻苯二甲酸类似, 硬脂酸甲酯对大针茅的化感效应趋势也表现为“剂量效应”。与对照相比, 当浓度为0.01mmol/L时, 硬脂酸甲酯显著抑制了大针茅种子的发芽率、发芽势和苗高; 而0.05 mmol/L浓度的硬脂酸甲酯抑制作用更强, 对大针茅种子的发芽率、发芽势、苗高和苗干重均有显著抑制; 当浓度为0.10 mmol/L时, 除根干重外, 大针茅的发芽率、发芽势、苗高、苗干重和根长等指标均受到硬脂酸甲酯的显著抑制。
3 讨论关于内生真菌感染对宿主植物化感潜力的影响目前只在高羊茅和黑麦草等栽培禾草中有研究报道, 而且内生真菌对宿主化感作用影响的结论也不一致。如Sutherland等[42]发现感染内生真菌的多年生黑麦草对白三叶草 (Trifolium repens) 的化感效应显著强于未染菌植物; Vázquez-de-Aldana等[43]的研究也表明相比于未染菌宿主植物, 染菌高羊茅的根部浸提液能显著抑制百脉根 (Lotus corniculatus) 和车前草 (Plantago lanceolata) 等目标植物的幼苗生长。但Springer等[44]的结果却发现, 高羊茅对5种豆科植物的种子萌发、幼苗生长的化感作用与内生真菌无显著相关性。Renne等[45]也发现, 高羊茅对南美本地草原植物种子萌发和幼苗生长的抑制效应并不受到内生真菌感染与否的影响。本研究以群落伴生种羽茅和群落优势种大针茅为实验材料, 发现未染菌羽茅的化感作用最强, 感染内生真菌可缓解宿主羽茅对群落优势种大针茅的化感作用, 本实验结果一方面说明内生真菌感染没有提高宿主植物的干扰性竞争能力, 另一方面也为解释自然生境中感染内生真菌的羽茅和大针茅长期共存的现象提供了实验依据。本实验室前期的研究中, 人们发现内生真菌对宿主羽茅的生长发育和抗性方面具有正效应, 如李夏[36]研究发现, 与未染菌羽茅相比, 内生真菌感染显著增加了宿主羽茅的绿叶生物量和地上部分总生物量的积累, 从而促进了宿主的生长发育; 秦俊华等[46]发现, 内生真菌可显著提高宿主羽茅对东亚飞蝗的抗性; 而谢凤行等[47]的研究结果表明, 内生真菌对宿主植物羽茅在抗病原菌侵染方面具有一定的增益作用。因此, 对于羽茅而言, 内生真菌感染是通过促进宿主植物的生长和增强其抗逆性而增强宿主植物的竞争力的。
相比于内生真菌种类较为单一的栽培禾草, 天然禾草通常感染有多种内生真菌, 而内生真菌种类对宿主影响的研究主要集中植物的生长和抗性方面, 在生长方面, Iannone等[28]发现2种内生真菌N. pampeanum和N. tembladerae对宿主雀麦属植物生物量的影响有显著差异, N. pampeanum对宿主生物量的贡献显著高于N. tembladerae。Hamilton等[48]的研究也表明, 不同的内生真菌N. tembladerae和N. huerfanum对宿主生物量的有益影响在所有处理下均有显著差异。但Oberhofer等[49]发现不同种类的内生真菌E. hordelymi、E. sylvatica ssp. Pollinensis和E. bromicola对宿主三柄麦属植物营养生长的影响均无显著差异。抗性方面, Brem等[50]发现, 感染无性型菌株对宿主禾草抗虫性的增益作用显著强于有性型菌株。而李夏[36]发现, 不同内生真菌对宿主羽茅生长的影响不同, 感染Ng的羽茅绿叶生物量显著高于Ns-羽茅共生体, 而感染Eg的羽茅绿叶生物量同感染Ng和Ns的羽茅无显著差异。本研究也表明, 不同种类内生真菌感染的羽茅对受体大针茅种子萌发和幼苗生长的化感效应有显著差异, 与未染菌羽茅相比, 感染Eg可显著缓解宿主羽茅对大针茅的抑制作用, 而感染Ns、Ng有缓解羽茅对大针茅化感作用的趋势, 但未达到显著影响。
植物体内的化感物质往往是微量的, 提取、分离和鉴定具有一定的难度。现代化学鉴定手段的进步为植物化感物质的分离鉴定提供了有力的技术支持, 气相色谱-质谱仪 (GC-MS) 是常用的鉴定化感物质的仪器[51]。刘成等[52]利用GC-MS方法分离鉴定出芦苇中含有的化感物质有棕榈酸甲酯、2-甲基烯丙醇等。邬彩霞等[53]用GC-MS技术鉴定出香豆素可能是黄花草木樨浸提液中的主效化感物质。董晓宁等[54]采用GC-MS技术分离鉴定了多花黑麦草的化感物质有草酸、邻苯二甲酸及其衍生物等。本研究通过GC-MS技术从化感活性较强的未染菌羽茅浸提液中鉴定得到了19种物质成分, 其中2, 4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸、邻苯二甲酸二丁酯和硬脂酸甲酯已分别在茄子[55]、萝卜[56]、莴苣[57]、南美蟛蜞菊[58]中被证实具有化感活性, 对化感活性较弱的感染Eg的羽茅浸提液运用GC-MS技术分离得到17种化学成分, 其浸提液中也含有2, 4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸、邻苯二甲酸二丁酯和硬脂酸甲酯, 但感染Eg的宿主羽茅体内这4种化感物质的含量低于未染菌羽茅, 这可能是两种羽茅浸提液化感活性具有显著差异的原因。对羽茅浸提液中4种潜在化感物质的化感作用进行验证试验, 结果表明, 2, 4-二叔丁基苯酚对大针茅的化感作用表现为低浓度无影响, 高浓度抑制, 邻苯二甲酸二丁酯的化感作用表现为“低促高抑”的效应趋势, 而邻苯二甲酸和硬脂酸甲酯对大针茅表现出“剂量效应”的化感作用趋势, 4种潜在化感物质在高浓度时均可显著抑制大针茅的种子萌发和幼苗生长, 这与GC-MS测定得到的结果一致。当然, 由于GC-MS不能对植物中的热不稳定性和一些大分子代谢产物进行分析[59], 本研究不排除羽茅中还存在其他种类的化感物质, 因此进一步研究羽茅中潜在的化感物质, 并分析其化感成分的作用和转化机理将成为以后研究的方向。
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