木腐菌是生态系统中森林微生物的重要组成部分，其分泌的多种酶能降解木材中的纤维素、半纤维素和木质素，将木纤维分解为简单的碳水化合物，营木质有机物腐生^{[1, 2]}。按其对木纤维降解类型不同，木腐菌分为白腐菌、褐腐菌和软腐菌三类^[3]。白腐菌因腐朽木材呈白色而得名，属于担子菌门的真菌，在长期的生物进化过程中形成了一套独特的木质素降解系统，是自然界中木质素的最有效降解物^[4]。

早期木腐菌研究主要集中于形态学与分类学，侧重于从自然界中筛选和人工诱变选育高酶活菌株^[5]。随着生物化学和分离技术的发展，有关木腐菌的木质纤维素酶组分的分离和降解机制研究逐渐展开，目前对结晶纤维素的水解机制已有初步了解^{[6, 7, 8, 9]}。但由于天然木材中半纤维素和木质素与纤维素间紧密相连的特殊结构，天然木质纤维素难被降解的原因仍未被阐明^{[10, 11, 12]}。20世纪80年代初Kirk和Gold分别从白腐菌模式菌种——黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)中发现木质素过氧化物酶(简称LiP酶)和锰过氧化物酶(简称MnP酶)，提出白腐真菌在降解木质素过程中，需要纤维素或葡萄糖作为木质素的共底物，是木质素生物降解研究的突破。LiP酶、MnP酶与后来发现的漆酶(简称Lac酶)，共同构成了白腐菌的木质素降解酶系。因白腐菌具有木质纤维素降解特性，故在生物质能源利用、农业废弃物循环利用、造纸废液处理和环境保护、生物制浆、纺织印染、洗涤剂生产、食品饮料加工等领域拥有广阔的应用前景^{[13, 14, 15, 16, 17]}。

随着现代分子生物学技术的发展，白腐菌作为重要林木病原真菌，其群体遗传学的研究已进入分子水平，包括同工酶分析、氨基酸序列测定以及DNA序列变异分析等。分子标记技术为大规模进行林木病原真菌的遗传变异研究创造了有利的条件。靶位区域扩增多态性(Target Region Amplification Polymorphism，TRAP)分子标记，是由Hu和Vick在SRAP分子标记基础上提出的新型分子标记技术^{[18, 19]}。TRAP分子标记基于已知基因的cDNA或EST序列信息设计锚定引物，选择性扩增靶基因序列，随机引物富含AT或GC碱基，可与模板DNA中内含子或外显子区域配对，扩增产物可对靶基因序列进行多态性标记。该技术操作简单、多态性高、重复性好、共显性高、费用低、靶基因区域针对性强，是遗传多样性研究中较为理想的分子标记技术^{[20, 21]}。

本研究以帽儿山采集的木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)、鲍姆鲍姆木层孔菌(Phellinus baumiibaumii)和火木层孔菌(Phellinus igniarius)为对象，测定其生长速度、生物量变化以及木质纤维素相关酶活性，为木材腐朽机理研究和工业生产菌株选择提供基础数据；采用TRAP分子标记技术对3种白腐菌的木质纤维素酶相关基因多态性进行检测，为从特定基因水平上研究木腐菌遗传变异提供有用的信息。

本试验所用3种白腐菌为木蹄层孔菌、鲍姆鲍姆木层孔菌和火木层孔菌，采自黑龙江省东北林业大学帽儿山实验林场，三者均为白色腐朽菌类型^[22]，基本特征如表 1所示。

无菌条件下，以75%酒精清洗腐朽菌子实体表面，用解剖刀分离出菌种子实体内部污染较少、生长旺盛的小菌块，用75%的酒精溶液消毒1 min，无菌水清洗3次，滤纸吸干后接种于马铃薯葡萄糖固体平板培养基，23℃气候箱中避光培养，待菌丝长满培养基表面，选择无杂菌污染的菌丝连续转接2次，转接入含白桦木屑或麦麸试管内，23℃气候箱继续培养，待菌丝长满试管，4℃冰箱内保存待用^[23]。

采用菌落直径法和菌丝干重法比较3种白腐菌的生物学特性^[24]。分别将3种白腐菌纯菌丝点种在马铃薯葡萄糖固体培养基(90 mm径培养皿)平板中央位置，28℃气候箱避光倒置培养；每12 h测量菌落直径变化，直至菌丝长满平板。分别将3种白腐菌菌饼(直径90 mm)接种于100 mL三角瓶内的40 mL马铃署葡萄糖液体培养基中，28℃ 150 r/min恒温振荡培养；每48 h取菌丝体，滤纸过滤得到粗菌丝体，用蒸馏水冲洗3次，100℃干燥箱中烘干至恒重，称量干重，比较3种白腐菌菌丝体生物量变化。每处理3次重复。

木质素降解酶粗酶液制备：无菌操作条件下，将3种白腐菌菌饼接种于100 mL三角瓶内40 mL 马铃薯葡萄糖液体培养基中，每个菌种2个处理，处理样中加白桦木屑，对照样无木屑；28℃ 150 r/min恒温振荡培养，定期取菌样培养液，4℃ 15000 r/min离心10 min取上清液，得木质素降解相关酶粗酶液^[25]。每3d取1次菌样测定酶活，连续取7次测定，每次测定每个处理取3个重复菌样。每个处理中分别测定3种酶活，锰过氧化物酶(MnP酶)活性测量见参考文献^[26]、漆酶(Lac酶)的活性测量见参考文献^[27]、木质素过氧化物酶(LiP酶)活性测量见参考文献^[28]。

产纤维素酶固体培养基配置：向50 mL三角瓶中加入1 g碳源物质和10 mL培养液，每个菌种2个处理，其碳源物质分别为白桦木屑和麦麸；培养液中各种无机盐的质量百分含量分别为：2% (NH₄)₂SO₄、0.1% KH₂PO₄、0.5% MgSO₄·7H₂O、0.01% CaCl₂、0.01% NaCl、0.005% FeSO₄·7H₂O、0.0016% MnSO₄·H₂O、0.0014% ZnSO₄·7H₂O、0.002% CoCl₂。纤维素降解酶粗酶液制备：无菌操作条件下，将3种白腐菌接种于产纤维素酶固体培养基，28℃气候箱中培养，定期取菌样制备粗酶液，向培养瓶中加入5倍质量的蒸馏水浸泡12h，双层纱布过滤得滤液，4℃ 15000 r/min离心10 min取上清液，所得为纤维素降解相关酶粗酶液。每隔4d取1次菌样测定酶活，连续取7次测定，每次测定每个处理取3个重复菌样。每个处理中分别测定2种酶活，葡聚糖内切酶(EG酶)和葡聚糖外切酶(EC酶)，活性测定见参考文献^[29]。

采用改良的CTAB法提取3种白腐菌的总DNA^[30]。以来自NCBI数据库的木质纤维素降解相关酶基因为靶标基因序列，设计固定引物，引物信息如表 2所示。筛选具有较好扩增条带多态性的引物对，用于3菌种TRAP-PCR分子标记检测，每个处理3次重复。PCR最佳反应条件：反应体系20 μL,模板DNA 100 ng、固定引物(10 μmol/L) 2.0 μL、随机引物(10 μmol/L) 2.0 μL、dNTP (2 mmol/L) 2.0 μL、MgCl₂ (25mmol/L) 2.0 μL、1×Buffer (含K⁺，不含Mg²⁺) 2.0 μL、Taq DNA聚合酶0.15 μL、ddH2O 7.85 μL,PCR程序为：94℃ 5 min；94℃ 1min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，5个循环；94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 90 s，35个循环；72℃ 7 min。PCR扩增产物经1×TAE缓冲液，1.8%琼脂糖凝胶，100 V缓冲电压电泳，UPS凝胶成像系统 (Universal HoodⅡ,BioRad) 检测电泳结果。

采用SPSS17.0统计学软件，对3种白腐菌的几种主要木质纤维素酶活性进行种间和处理间方差及显著性分析。

多态性百分率是描述群体遗传变异量的参数，是指群体内多态性基因座的比例:

P=k/n ×100%

马铃薯葡萄糖固体培养基中，在16d培养过程中,3种白腐菌菌落直径变化如图 1所示。3菌种菌丝生长速度均匀，木蹄层孔菌和火木层孔菌的生长速度较快，菌丝的平均生长速度分别是7.5 mm/d和6.9 mm/d，鲍姆鲍姆木层孔菌生长速度相对较慢，菌丝的平均生长速度是5.6 mm/d，三者之间生长速度差异不明显，均属于快速生长的类型。

图1 3种白腐菌菌落生长速度和菌丝生物量变化曲线 Figure 1 The mycelium growth and biomass changes of 3 white-rot fungi.

图选项

马铃薯葡萄糖液体培养条件下，3种白腐菌的菌丝生物量变化如图 1所示。生长14 d后，木蹄层孔菌生物量最高，达到6.14 g/L，其次为鲍姆鲍姆木层孔菌，达到5.02 g/L，为同期木蹄层孔菌的81.75%，火木层孔菌生物量最低，为2.31 g/L，仅为同期木蹄层孔菌的37.62%。木蹄层孔菌和鲍姆鲍姆木层孔菌的生长调整期相对较短，时间为6 d，对数期的生长速度相对较快。火木层孔菌的生长调整期相对较长，时间为10d，对数期的生长速度相对较慢。

火木层孔菌在液体培养基中的生长速度比鲍姆鲍姆木层孔菌快，而在固体培养基中的生物量却比鲍姆鲍姆木层孔菌小，由此可见火木层孔菌可能更适合在液体培养基中生长。

不同培养条件下3种白腐菌产木质素降解相关酶活性变化如图 2所示。培养初期3种菌产LiP酶、MnP酶、Lac酶量低，经6—9 d调整期后进入对数生长期，酶的表达量开始增加，18—21 d后进入衰退期，产酶量逐渐下降。

图2 不同培养条件下3种白腐菌木质素降相关解酶活性变化 Figure 2 The activities of three main lignin degradation enzymes in 3 white-rot fungi in different culturing conditions. FA:木蹄层孔菌木屑培养F. fomentarius in sawdust medium； FB:木蹄层孔菌麦麸培养 F. fomentarius in wheat bran； PA:鲍姆鲍姆木层孔菌木屑培养P. baumiibaumii in sawdust medium； PB:鲍姆鲍姆木层孔菌麦麸培养 P. baumiibaumii in wheat bran； IA:火木层孔菌木屑培养P. igniarius in sawdust medium； IB:火木层孔菌麦麸培养 P. igniarius in wheat bran

图选项

木蹄层孔菌产MnP酶、Lac酶量高于鲍姆鲍姆木层孔菌和火木层孔菌，并随着诱导时间的延长而增高；鲍姆鲍姆木层孔菌和火木层孔菌产LiP酶量高于木蹄层孔菌；3种白腐菌MnP酶、Lac酶、LiP酶的表达量种间差异显著(F=3.75^*、5.20^**、3.01^*)。

3菌种的MnP酶、Lac酶、LiP酶的表达量在处理与对照间差异显著(F=3.84^*、4.19^*、5.28^*)。图 2显示木蹄层孔菌的MnP酶和Lac酶活性木屑诱导组略高于对照组；鲍姆鲍姆木层孔菌表达Lac酶活性极低，处理间差异不明显；火木层孔菌屑诱导组的MnP酶、Lac酶活性木高于对照组，白桦木屑对MnP酶、Lac酶诱导作用的种间差异显著(F=3.85^*、5.27^**)。木蹄层孔菌白桦诱导组LiP酶活性高于对照组，鲍姆鲍姆木层孔菌和火木层孔菌的对照组LiP酶活性高于白桦诱导组，白桦木屑诱导促进木蹄层孔菌LiP酶表达，抑制鲍姆鲍姆木层孔菌和火木层孔菌LiP酶表达，白桦木屑对LiP酶表达诱导作用的种间差异显著(F=4.16^*)(图 2)。

不同培养底物诱导下，3种白腐菌产纤维素降解相关酶活性变化如图 3所示。3菌种在培养初期均开始产葡聚糖内切酶(EG)和葡聚糖外切酶(EC)，酶的表达量逐渐增加，对数生长期达到峰值后逐渐下降，但麦麸培养基中火木层孔菌的EC酶活性，在测量后期仍继续增长。麦麸作为碳源的培养基中3种白腐菌的酶活峰值出现时间晚于木屑做碳源的培养基。

图3 不同碳源培养条件下3种白腐菌的纤维素降相关解酶活性变化 Figure 3 The activities of two cellulase degradation enzymes in 3 white-rot fungi measured in different carbon source culture media FA：木蹄层孔菌对照 F. fomentarius control； FB：木蹄层孔菌木屑培养 F. fomentarius in sawdust medium； PA：鲍姆鲍姆木层孔菌对照 P. baumiibaumii control； PB：鲍姆鲍姆木层孔菌木屑培养 P. baumiibaumii in sawdust medium； IA：火木层孔菌对照 P. igniarius control； IB：火木层孔菌木屑培养 P. igniarius in sawdust medium

图选项

3菌种的EG酶、EC酶表达量的种间差异不明显(F=1.63、1.65，P < 0.05)。碳源影响纤维素降解相关酶的表达量，白桦木屑作为碳源的培养基中，3菌种表达的EG酶和EC酶活性较低，活性变化较小，菌种长势一般；麦麸作为碳源的培养基中，3菌种表达的两种酶活性较高，活性变化较大，菌种长势旺盛，EG酶、EC酶活性处理间差异显著(F=3.99^*、4.04^*)。

根据来自NCBI数据库的木质纤维素降解相关酶基因设计固定引物，通过TRAP-PCR预实验筛选针对7个木质纤维素酶基因的引物对，结果从64对引物中筛选出扩增条带清晰、多态性较好的引物对29对。其中以木质素降解酶基因为靶基因的引物对有15对，可标记MnP基因的1对，标记Lac基因的6对，LiP基因的8对；以纤维素降解酶基因为靶基因的引物对有14对，可标记CBH基因的引物10对，标记CDH基因的3对，标记EG基因的1对。所筛选引物对如表 3所示。

图 4为3菌种木质纤维素相关酶基因TRAP-PCR扩增产物的部分电泳结果，表 4为各酶基因的扩增条带的多态性统计。以3菌种的LiP酶基因为靶基因的8对引物扩增共产生94个条带，多态性条带为67条，木蹄层孔菌多态性比率为74.29%，鲍姆鲍姆木层孔菌多态性比率为73.53%，火木层孔菌多态性比率为64.00%，该基因总多态性条带比率为为71.27%；以MnP酶基因为靶基因的1个引物对共扩增3个条带，多态性条带为2条，该基因总多态性条带比率为66.67%； 以Lac酶基因为靶基因的6个引物对共扩增80个条带，多态性条带为62条，木蹄层孔菌多态性比率为72.73%，鲍姆鲍姆木层孔菌多态性比率为79.31%，火木层孔菌多态性比率为79.31%，该基因总多态性条带比率为77.50%； 以CBHⅠ酶基因为靶基因的4个引物对共扩增58个条带，多态性条带为40条，木蹄层孔菌多态性比率为66.67%，鲍姆鲍姆木层孔菌多态性比率为71.43%，火木层孔菌多态性比率为68.42%，该基因总多态性条带比率为68.97%； 以CBHⅡ酶基因为靶基因的6个引物对共扩增65个条带，多态性条带为47条，木蹄层孔菌多态性比率为66.67%，鲍姆鲍姆木层孔菌多态性比率为75.00%，火木层孔菌多态性比率为73.91%，该基因总多态性条带比率为72.31%； 以CDHⅠ酶基因为靶基因的3个引物对共扩增40个条带，多态性条带为25条，木蹄层孔菌多态性比率为58.33%，鲍姆鲍姆木层孔菌多态性比率为70.59%，火木层孔菌多态性比率为54.55%，该基因总多态性条带比率为62.5%； 以EG2酶基因为靶基因的1个引物对共扩增11个条带，多态性条带为8条，木蹄层孔菌多态性比率为80.00%，鲍姆鲍姆木层孔菌多态性比率为66.67%，火木层孔菌多态性比率为66.67%，该基因总多态性条带比率为72.73%；由此可见，除MnP酶基因外，3种白腐菌的木质纤维素降解酶基因在种间均存在较高的遗传差异。

图4 3种白腐菌木质纤维素降解相关酶基因TRAP-PCR扩增产物电泳图 Figure 4 Agarose gel electrophoresis of TRAP-PCR amplification result of 3 white-rot fungi with chosen anchor primers A-H的扩增引物分别为LiP1-em3,MnP2-em2,Lac1-me1,CBHⅠ2-me1,CBHⅡ1-em2,CBHⅡ2-me2,CDHⅠ-me1,EG2-me2. 泳道1-3, 10-12, 19-21, 28-30, 37-39, 46-48, 55-57, 64-66为木蹄层孔菌; 泳道4-6, 13-15, 22-24, 31-33, 40-42, 49-51, 58-60, 67-69为鲍姆鲍姆木层孔菌; 泳道7-9, 16-18, 25-27, 34-36, 43-45, 52-54, 61-63,70-72为火木层孔菌, M为marker

图选项

白腐菌既可以表达木质素酶也可以表达纤维素酶，用于木质纤维素的降解。但不同的菌种间各种酶的表达存在很大差异，差异主要表现在表达量和表达时间上。

本研究的3种白腐菌分泌的3种主要木质素酶在表达量和表达时间上，种间存在很大差异。从表达量上看，木蹄层孔菌的Lac酶表达量很高，而鲍姆鲍姆木层孔菌的Lac酶表达量极低，不论是木屑诱导还是对照都几乎不表达；木蹄层孔菌偏好产MnP酶、Lac酶，鲍姆鲍姆木层孔菌和火木层孔菌偏好产LiP酶。白桦木屑对3种白腐菌中MnP酶、Lac酶表达有诱导促进作用，对鲍姆鲍姆木层孔菌和火木层孔菌产LiP酶有诱导抑制作用，诱导作用种间差异显著。从表达时间上看，白桦木屑诱导作用在种间差异显著，白桦木屑诱导作用在不同菌种的不同酶中出现或早或晚，到达产酶峰值出现时间或促进或延迟，种间差异显著。原因可能是不同菌种间的遗传差异以及对诱导物的响应各不相同所致。

本研究的3种白腐菌产纤维素降解酶能力的种间差异不明显，但酶的表达量和表达时间受碳源影响明显，不同处理间差异显著。原因可能在于纤维素降解酶系是多组分酶系，与其他的酶促反应有很大的区别，各组分之间存在复杂的协同反应关系，进而影响了EG酶和EC酶的表达量和活性变化。

以来自NCBI数据库的木质纤维素降解相关酶基因为靶标基因序列，设计固定引物，通过TRAP-PCR筛选能产生多态性条带的引物以用于菌种间遗传变异研究。针对7个木质纤维素酶相关基因使用筛选出的29对引物，对3种白腐菌进行TRAP-PCR扩增，产生总条带数为357条，多态性条带数为255条，平均每对引物扩增出的条带数为12.31条，条带的大小范围在100—2000 bp之间。其中以木质素降解相关酶基因为靶基因的15个引物对，共扩增183个条带，135条为多态性条带，木蹄层孔菌多态性比率为73.33%，鲍姆鲍姆木层孔菌多态性比率为75.76%，火木层孔菌多态性比率为71.93%，木质素降解酶基因总多态位点比率为73.77%；以纤维素降解相关酶基因为靶基因的14个引物对共扩增174个条带，120条为多态性条带，木蹄层孔菌多态性比率为66.04%，鲍姆鲍姆木层孔菌多态性比率为72.31%，火木层孔菌多态性比率为67.86%，纤维素降解酶基因总多态位点比率为68.97%。本研究表明3种白腐菌均显示较高的木质素和纤维素降解酶基因的遗传多态性。因此，特异基因的TRAP分子标记方法可用于木材腐朽菌种间遗传变异研究。

从形态分类学角度看，火木层孔菌和鲍姆鲍姆木层孔菌均为锈革菌科木层孔菌属菌种，而木蹄层孔菌为多孔菌科层孔菌属菌种。但从它们木质纤维素酶的胞外表达量和表达趋势，以及7个木质纤维素酶靶基因扩增产物电泳结果上看，火木层孔菌与木蹄层孔菌多态性条相似度高，木蹄层孔菌与鲍姆鲍姆木层孔菌的条带相似程度低；而鲍姆鲍姆木层孔菌的特异性条带多，火木层孔菌与木蹄层孔菌特异性条带少。原因可能与火木层孔菌与木蹄层孔菌具有相同的寄主有关；同时，从基因进化关系上，木蹄层孔菌与火木层孔菌可能更近，与鲍姆鲍姆木层孔菌进化关系较远。