作为荒漠生态系统的“生态系统工程师”，生物土壤结皮(Biological Soil Crusts,BSCs)发挥着独特而重要的生态作用^[1-2]。然而，BSCs的生态功能不是一成不变的，其重要组成成分隐花植物对生境变化表现出极大的敏感性，随着生境变化BSCs组成和多样性发生变化，进而波及整个荒漠生态系统的健康和稳定^[3-4]。高强度的UV-B是影响隐花植物生存及其结皮形成的重要环境因子^[5]。UV-B辐射抑制了隐花植物的光生物学和光化学过程，而隐花植物则通过趋避迁移、积累吸收UV-B辐射的保护色素、修复紫外辐射所造成的DNA损伤等机制抵御紫外辐射所造成的伤害^[6]。但由于构成生物土壤结皮的隐花植物形体微小、种类鉴定困难而引起的研究技术复杂性等因素的限制，导致对最引人注意的全球现象之一——UV-B增强对生物土壤结皮层隐花植物影响的研究仅见少量报道^[7]。仅有的研究也多集中在极地、亚极地、北美热带荒漠等地区^[7]。研究表明，结皮层不同种类隐花植物对UV-B的响应不同^[8]。此外，从不同生境结皮分离得到的隐花植物对UV-B的响应也不尽相同^[9]。因此，本研究选用腾格里沙漠东南缘的沙坡头地区常见藓类结皮——真藓为研究对象，通过对增强UV-B及UV-B胁迫解除后真藓光合色素含量、类黄酮含量、抗氧化酶活性、丙二醛(MDA)含量及细胞超微结构的跟踪测定，揭示UV-B胁迫解除后真藓生理特性及细胞超微结构的恢复机制。

1 研究区概况

研究区位于中国科学院沙坡头沙漠研究试验站包兰铁路以北的人工固沙植被区(37°32′N—37°26′N,105°02′E—104°30′E)，属于阿拉善高原荒漠与荒漠草原过渡地带，海拔为1330 m。该地区多年平均气温9.6℃，年均降雨量186.2 mm，主要集中在5—9月(沙坡头1956—2010年气象资料)。土壤基质为松散贫瘠的流沙，土壤稳定含水量为2%—3%。人工植被区主要固沙灌木、半灌木为柠条(Caragana korshinskii)、花棒(Hedysarum scoparium)和油蒿(Artemisia ordosica)；草本植物主要有小画眉草(Eragrostis poaeoides)，雾冰藜(Bassia dasyphylla)等^[10]。始建于20世纪50年代中期的人工固沙植被体系，在经过50余年的演变后，区域内广泛分布着不同发育阶段的生物土壤结皮，常见的结皮类型主要有藻类、地衣及其混生结皮和藓类，其中盖度较大且发育较好的藓类结皮主要有真藓(Bryum argenteum Hedw.)、土生对齿藓(Didymodon vinealis (Brid.) Zand.)和刺叶赤藓(Syntrichia caninervis Mitt.)^[11]。

2 材料和方法 2.1 试验材料

采样于2010年9月中旬完成。在沙坡头人工植被区选取长势均匀、发育良好的真藓结皮。在所选区域上小心喷洒蒸馏水，使真藓结皮表面湿润，用内径约10 cm，高约5 cm的PVC管采集真藓结皮及其下层土壤，共24个样品。将采集的样品带回实验室，风干待用。

2.2 试验设计

本研究于2011年8月在中国科学院寒区旱区环境与工程研究所成立的甘肃省逆境生理与生态重点实验室内进行。UV-B灯管由上海晨辰照明电器有限公司生产(40W,313 nm)。UV-B辐射采用可升降式的UV-B灯架，将UV-B灯管垂直置于真藓结皮上方，调节结皮顶端距灯管的高度设定2.75(对照)、3.08、3.25、3.41 W/m²等4个UV-B强度，分别相当于沙坡头地区夏天日平均UV-B辐射增强0、12%、18%和24%。UV-B灯管外用厚度为0.13 mm的乙酸纤维素膜(courtauld chemicals,Derby,UK)包被，以消除UV-C辐射的干扰，为防止乙酸纤维素膜因光解老化，每隔5 d更换1次。整个实验过程中，培养室内的光合有效辐射(PAR,400—700 nm)为150 μmol m^-2 s^-1，温度保持在25 ℃，每天给结皮补充相应的水分，以提供充足的水分。UV-B辐射强度采用紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)测量。UV-B每天9:00—17:00照射8 h，连续照射10 d后去除UV-B辐射，进行5 d的光恢复。以上各处理均设3次重复。在UV-B辐射处理和可见光修复完成后分别测定真藓的光合色素含量、类黄酮含量、抗氧化酶活性、MDA含量，并对样品进行细胞超微结构的透射电镜观察。

2.3 测定指标及方法 2.3.1 光合色素的测定

叶绿素、类胡萝卜素含量的测定采用兰书斌等^[12]的分光光度法。用UV/VIS-752N紫外可见分光光度计(上海黄河仪器仪表厂有限公司)测量665、649 nm和470 nm波长下的光吸收值，并按照公式计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量^[13]。

2.3.2 类黄酮的测定方法

类黄酮含量的测定采用NaNO₂-Al(NO₃)₃比色法^[14]。于紫外可见分光光度计波长510 nm下测定光吸收值。

2.3.3 抗氧化酶活性的测定

取一定面积的真藓，称重。用5 mL提取液(50 mmol/L磷酸缓冲液，pH7.8含1%PVP、1%PMSF、1%ASA及1%Triton X-100)在冰浴条件下研磨提取，15000r/min离心20 min，上清液用于测定超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性。SOD活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光化学反应法^[15]，以每单位时间内抑制NBT光氧化还原50%的酶量为1个酶活性单位。用紫外可见分光光度计测定560 nm下的光吸收值。CAT活性测定采用紫外吸收法^[16]，以每分钟OD₂₄₀减少0.01为1个酶活性单位，用紫外可见分光光度计在240 nm下作时间扫描。

2.3.4 MDA含量的测定

MDA含量测定采用三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)显色法^[17]。用紫外可见分光光度计在532 nm和600 nm处测定光吸收值。

2.3.5 细胞超微结构观察

超薄切片制作的方法参照王钧等^[18]的方法。选取不同处理的真藓新鲜样品(每个样品从上往下取1—2个长约0.5 cm的个体)，依次经过3%戊二醛溶液固定(4℃)、磷酸缓冲液漂洗(pH 7.0)、锇酸固定(4℃)、乙醇梯度脱水、冷冻断裂法分割样品等，环氧树脂对样品进行包埋渗透。用LKB4800超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，在JEM-1230透射电子显微镜下观察、照相。

2.4 统计分析

采用SPSS 16.0(SPSS，Chicago，IL，USA)软件进行数据处理和统计分析，并用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验同一测定参数不同处理间差异显著性，采用Independent Sample T-test分析UV-B辐射处理与可见光处理之间的差异显著性。差异显著水平用P ＜0.05表示。统计分析前，将光合色素、类黄酮、抗氧化酶、MDA进行对数转换，使数据服从正态分布。

3 结果 3.1 增强UV-B辐射及可见光修复后真藓光合色素含量的变化

从图 1可以看出，UV-B辐射处理后，真藓叶绿素含量和类胡萝卜素含量均表现出相似的趋势。其中3.41 W/m² UV-B处理下真藓Chl a含量、Chl b含量、Chla/b、类胡萝卜素含量分别降低74.87%、60.91%、35.29%、67.05%，并且差异达显著水平(图 1,P ＜0.05)。去除UV-B辐射后，在可见光下生长一段时间后发现，真藓光合色素含量有所升高。与3.41 W/m² UV-B辐射处理相比，去除UV-B辐射后，真藓Chl a含量、Chl b含量、Chla/b、类胡萝卜素含量分别升高7.14%、2.33%、5.21%、17.45%(图 1)。T检验结果表明，通过可见光处理，3.08、3.25 W/m² UV-B辐射处理组叶绿素a含量，色素比和类胡萝卜素含量显著增加(图 1,P ＜0.05)。

3.2 增强UV-B辐射及可见光修复后真藓类黄酮含量的变化

不同处理下真藓类黄酮含量变化如图 2所示，从图中可以看出相比于对照组，增强UV-B辐射处理下的真藓类黄酮含量均显著降低，且下降幅度与辐射强度成正比(图 2,P ＜0.05)。除2.75 W/m² UV-B处理后再用可见光照射，未能引起类黄酮含量升高，其余强度UV-B辐射后经过可见光辐照，均能提高真藓类黄酮含量，类黄酮含量分别提高0.49%、16.62%和7.84%，但与UV-B辐照处理相比无显著性差异(图 2)。

3.3 增强UV-B辐射及可见光修复后真藓抗氧化酶活性的变化

如图 3所示，UV-B辐射处理下真藓SOD和CAT活性呈降低趋势，差异显著。在3.41 W/m² UV-B 辐射处理后SOD和CAT活性降至最低，分别低于对照组的34.32%和35.98%(图 3,P ＜0.05)。然而去除UV-B辐照后，培养在可见光下的真藓SOD和CAT活性均有所升高，经3.41W/m² UV-B处理后，在可见光下生长的真藓SOD和CAT活性分别升高3.55%和4.43%(图 3)。T检验结果表明，通过可见光处理，3.08 W/m² UV-B辐射处理组SOD和CAT酶活性显著增加(图 3,P ＜0.05)，其余均无显著性差异。

3.4 增强UV-B辐射及可见光修复后真藓MDA含量的变化

从图 4可以看出，UV-B增强条件下真藓MDA含量显著升高(P ＜0.05)，其MDA含量随辐射强度的增强而逐渐升高，加重了真藓膜脂过氧化程度。真藓MDA含量分别达到0.047、0.103、0.122 μmol/g鲜重，与对照相比，显著增加17.5%、157.5%和205%(图 4)。从图中也可以看出，可见光降低了UV-B增强下真藓MDA的含量，缓解了UV-B带来的膜伤害，MDA含量分别降低6.38%、19.42%和4.92%(图 4)。T检验结果表明，通过可见光处理，3.25 W/m² UV-B辐射处理组MDA含量显著降低(图 4,P ＜0.05)，其余均无显著性差异。

3.5 增强UV-B辐射及可见光修复后真藓细胞超微结构的变化

增强UV-B辐射及可见光修复后真藓细胞超微结构的变化如图 5所示。UV-B辐射处理10 d后，对照组真藓叶绿体呈椭圆形，形态饱满；类囊体片层结构垛叠整齐，片层结构排列紧密；细胞核膜结构清晰，核质均匀，有1个明显的核仁区；细胞壁厚度较为均匀，细胞膜与细胞壁紧紧黏在一起，无间隙(图 5A)。随UV-B辐射强度的增加，真藓细胞超微结构发生不同的变化，叶绿体肿胀变圆，呈球形；叶绿体膜系统受到不同程度的破坏，基质类囊体片层变得松散，类囊体膜也受到不同程度的破坏；细胞膜与细胞壁交界的地方变得模糊不清，细胞壁内侧变得凹凸不平；细胞器溶解，细胞内出现大量淀粉粒(图 5C,E,G)。尤其在3.41 W/m² UV-B辐射强度下，真藓细胞受损严重，细胞结构仅剩残留细胞壁、淀粉粒等。去除3.08 W/m² UV-B辐射后，培养在可见光下的真藓细胞超微结构能够恢复正常状态，但也有部分类囊体仍然肿胀，排列不整齐、不紧致(图 5D)；受3.25和3.41 W/m² UV-B辐射处理的真藓光修复后叶绿体膨胀、片层结构凌乱(图 5F,5H)。

增强UV-B辐射及可见光修复对真藓叶绿体超微结构的影响如图 6所示。UV-B辐射处理下，真藓叶绿体超微结构发生了较为明显的变化。在对照处理下，细胞内叶绿体的形状表现为形态饱满、结构完整的长椭圆形；基粒片层整齐有序平行排列，同时类囊体片层垛叠整齐；嗜锇颗粒较少；整个叶绿体膜系统结构完整，双层膜结构清晰(图 6A)。在增强UV-B辐射处理下，叶绿体明显肿胀变大，呈近球形；叶绿体类囊体片层结构松散，部分类囊体结构模糊，类囊体膜结构受到一定程度的破坏；嗜锇颗粒增多(图 6C,E,G)。在3.41 W/m² UV-B辐射处理下，叶绿体膜系统结构降解；类囊体膜系统降解，基粒片层变得模糊不清，只剩下边缘极度糊化的淀粉粒(图 6G)。去除3.08 W/m² UV-B在可见光下培养，真藓叶绿体有一个修复过程，叶绿体外形恢复到近椭圆形，基粒片层恢复清晰，排列有序(图 6D)。然而，受3.25和3.41 W/m²处理的真藓在可见光下生长，其叶绿体超微结构受损严重，不能恢复至对照。

4 讨论

光合色素含量是影响光合作用的重要因素，是评价光合作用强度的指标之一。作为判断活力与胁迫状况的指标，光合色素在藓类植物研究中得到广泛应用^[19-20]。光合色素含量的变化，既可反映植物光合作用功能的强弱，也可表征逆境胁迫下植物组织、器官的衰老状况^[21]。本实验中，UV-B辐射导致真藓结皮光合色素降低，其中叶绿素a含量下降剧烈(图 1)。相似的研究结果表明UV-B辐射胁迫下，锈色泥炭藓和大金发藓叶绿素a和类胡萝卜素浓度降低^[8]。UV-B辐射造成叶绿素含量降低的原因可能是UV-B导致叶绿素结构破坏，引起叶绿素分解^[22]。类胡萝卜素不仅是重要的光合辅助色素，而且对叶绿素具有重要的保护作用，在抗UV-B辐射中可能起到重要的作用^[23]。随UV-B辐射强度的增强，真藓类胡萝卜素含量逐渐降低。当去除UV-B辐射，培养在可见光下的真藓结皮叶绿素和类胡萝卜素含量呈现逐渐上升的趋势(图 1)，说明真藓光合色素在去除UV-B辐射后有修复能力。

类黄酮积累是植物对UV-B辐射的适应和保护，即形成天然屏障，吸收和阻挡UV-B辐射^[24]。大量的研究表明，适量增强的UV-B辐射能激发类黄酮物质的积累^[25]。而本研究结果表明增强UV-B辐射导致真藓类黄酮含量持续降低，与对照相比差异显著(图 2)，这可能是由于UV-B辐射剂量较大或时间较长，真藓类黄酮合成困难，失去对植物的保护作用。Hui等^[26]的研究表明，随着UV-B辐射的增强土生对齿藓类黄酮含量呈先增加后降低的趋势。董新纯等^[27]则发现增强UV-B辐射诱导苦荞类黄酮含量升高，但随着UV-B辐射剂量增大或时间延长，类黄酮含量反而降低。发现当去除UV-B辐射后，真藓类黄酮含量呈现增加趋势(图 2)。由于类黄酮是一种自由基清除剂类物质，能够消除UV-B辐射产生的自由基，对植物抵御UV-B辐射的伤害有利^[28]，故以此可说明可见光条件对UV-B辐射处理后的真藓具有修复作用。

抗氧化酶系统作为植物体内重要的活性氧自由基消除系统，在植物抵抗氧化胁迫中起重要作用^[29]。但该抵抗能力是在一定范围内的，当环境胁迫达到一定程度后，抗氧化酶系统失去保护能力。在本研究中，增强UV-B条件下，真藓SOD和CAT活性呈现降低趋势(图 3)，这可能是由于真藓接受UV-B辐射强度过强或时间过长，真藓已经损伤严重，失去自身调节能力，使其不能修复生理代谢^[30]。Wang等^[31]对UV-B增强条件下玉米(Zea mays L.)花粉SOD和CAT活性的研究证实了我们的结论。当将受UV-B辐射处理的真藓处于可见光下，细胞抗氧化酶活性得以增强(图 3)，用以消除过量的活性氧自由基，使UV-B胁迫带来的氧化伤害保持在较低的水平^[32]。

MDA含量的高低表示细胞膜的过氧化程度，是评价胁迫程度的生理指标之一^[33]。本试验结果表明，增强UV-B使真藓MDA含量显著上升，且随着辐射强度的增加而逐渐升高(图 4)，即真藓膜脂过氧化程度加深，通透性增加，细胞受到了较大程度的伤害。这与郝文芳等^[34]对胡枝子的研究结果一致。去除UV-B辐射后，真藓MDA含量呈降低趋势，而在3.41 W/m² UV-B辐射处理时，MDA含量降低幅度减小(图 4)，说明高强度UV-B辐射处理后，真藓损伤严重，MDA修复能力降低。MDA含量变化与叶绿素含量变化呈负相关，这与蒋明义等^[35]提出的叶绿素漂白与MDA产生同时发生的观点一致，说明植物叶绿素的降解与膜脂过氧化的增强密切相关。

完整的细胞结构是植物体完成各项生命活动的基础。大量研究表明，叶绿体是重要的光合器官，也是最易受到UV-B辐射损伤的亚细胞结构^[36]。本研究发现，UV-B辐射对真藓结皮细胞超微结构造成了一定程度的破坏，表现为叶绿体肿胀变圆，细胞器溶解消失，膜系统降解等(图 5,图 6)。表明在UV-B辐射胁迫下，真藓叶绿体超微结构受到一定程度的损伤。俞泓伶^[37]采用透射电镜技术研究了海洋微藻——小球藻叶绿体超微结构对UV-B辐射的响应变化，结果表明UV-B辐射处理导致小球藻叶绿体呈球形皱缩，基粒片层稀疏，类囊体膜系统排列不清，膜系统溃解。Buchanan等^[38]的研究表明，在增强UV-B辐射处理下，叶绿体膜结构的损伤导致叶绿体蛋白的稳定性降低，加速叶绿素的降解，从而引起叶绿体结构的损伤，这与本文对真藓光合色素的测定结果一致。去除UV-B辐射后，培养在可见光下的真藓细胞超微结构部分能够恢复正常状态(图 5,图 6)，有利于提高真藓光合作用能力。

研究结果表明可见光可以部分修复增强UV-B对真藓生理特性及细胞超微结构引起的损伤。可见光对真藓UV-B损伤修复机制可能与DNA损伤修复机制有关。UV-B辐射在DNA中形成损伤产物嘧啶二聚体(CPDs)，而CPDs的积累导致DNA损伤增加^[39]，从而影响植物的生理生化特性。对于三洋藓(Warnstorfia sarmentosa)、针叶离齿藓(Chorisodontium aciphyllum)等的研究表明在UV-B辐射条件下，CPDs的积累没有明显增加，DNA没有明显的损伤，说明这些藓类植物对紫外辐射有较强的抗性^[40-41]。关于UV-B增强和可见光对真藓DNA分子机制的影响及修复机理还有待进一步深入研究。

5 结论

综上所述，增强UV-B辐射对真藓光合色素、类黄酮含量、抗氧化酶活性、MDA含量及细胞超微结构均造成不同程度的伤害。其伤害程度随UV-B辐射强度的增加而增大。当去除UV-B辐射后，培养在可见光下的真藓生理特性及细胞超微结构均有所恢复，说明可见光可修复UV-B增强对真藓的损伤。这对进一步理解真藓对UV-B辐射的耐受机理具有重要理论意义。