温度是影响植物光合作用的重要因素^[1]，植物处于高温或低温的环境中其光合作用会受到明显的影响。低温胁迫会引起植物叶绿素合成受到阻碍^[2]，叶绿体结构遭到破坏^[3]，光合电子传递活性下降^[4]，光合作用过程中酶的活性降低，CO₂的同化受阻^[5]，导致植物光合作用效率降低。

Rubisco(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶)是高等植物光合碳代谢过程中的关键酶，处于光合碳还原和光合碳氧化这两个方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着光合作用和光呼吸的代谢比例，其活性大小对净光合速率起着决定性作用^[6]。Rubisco由8个大亚基(RbcL)和8个小亚基(Rbcs)组成，大亚基由叶绿体基因组编码，小亚基是由细胞核基因组编码。小亚基Rbcs mRNAs表达水平与Rubisco含量是高度相关的，二者之间有很好的协同表达，小亚基对大亚基的表达具有调控作用^{[7, 8]}。Rubisco的活性中心位于大亚基上，行使主要功能，但其多个小亚基编码基因的功能还不是很清楚。Spreitzer^[9]认为，小亚基可能在进化过程中扮演聚集大亚基活性位点的角色，并且小亚基可能有更多特异性功能，小亚基能促进CO₂与Mg²⁺对Rubisco的活化，维持和稳定Rubisco的活化构象。Miao和Li^[10]通过烟草和水稻大、小亚基的异源分子杂交发现，杂合酶的羧化和氧化比值与小亚基的来源有很大的关系。Du Y C等^[11]利用蓝藻的实验结果也揭示小亚基在调控Rubisco羧化/氧化比值方面的重要作用。为此，人们希望用不同植物的大、小亚基组成全酶来提高羧化活性和降低加氧活性^[12]。但是，到目前为止，还没有成功的报道。澳大利亚的Badger认为Rubisco的羧化和氧化的比值与酶反应速率有某种相关，羧化和氧化的比值越高，反应速率越慢^[13]。因此推测提高Rubisco羧化和氧化的比值的定点修饰有可能会导致酶反应速率的下降。

大豆Rbcs基因含有3个不同拷贝，对许多外界因子如水杨酸、盐胁迫和干旱处理具有明显的应答反应。但不同浓度的水杨酸和NaCl对Rbcs基因的转录有不同程度的诱导^[14]。说明Rbcs基因表达调控与植物抗逆性有一定的关联。新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.Exmaxim)，主要生长在海拔2400—5800 m的高山流石坡以及雪线附近的碎石间。那里气候奇寒、终年积雪不化，最高月平均温3—5 ℃，最低月平均温-19—-21 ℃，无霜期仅有50d左右^[15]。经过长期极端环境条件的自然选择，新疆雪莲自身形成了独特的光合保护机制，研究其Rbcs基因在低温光保护机制中的作用具有重要的意义。

烟草作为植物分子生物学研究的模式植物，原产于亚热带，生长最适温度为25—28 ℃，低于10 ℃时生长受阻，低温对烟草的生长发育、产量和品质都有明显的影响^[16]。本试验前期从新疆雪莲cDNA文库中克隆了1个Rubisco的小亚基基因(sikRbcs2)cDNA全长序列，该基因与向日葵氨基酸序列的同源性最高，只有57.54%。构建了诱导表达载体RD29A: sikRbcs2和过表达载体35S: sikRbcs2，通过农杆菌介导转化NC-89烟草，获得了T0代的转基因烟草种子。组成型表达的转基因烟草植株能够明显的提高烟草的抗寒能力，并且在低温条件保持较高的光化学效率。在此基础上本试验采用低温胁迫法对非转基因型烟草和转sikRbcs2基因的烟草进行处理，测定叶绿体色素含量、叶绿素荧光参数、光合参数以及生物量，分析在不同低温胁迫下sikRbcs2对叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素，净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度以及叶绿素荧光参数的影响，为进一步研究新疆雪莲sikRbcs2基因在低温光合中的作用机制奠定基础。

植物材料 植物材料为‘NC98’烟草、转RD29A: sikRbcs2和35S: sikRbcs2基因的‘NC98’烟草由本实验保存。

将经卡那霉素筛选获得的转基因型烟草幼苗(RD29A: sikRbcs2和35S: sikRbcs2)和空白对照烟草移栽于装有营养土(草炭∶蛭石∶珍珠岩3∶1∶1)的营养钵(内径为8 cm，高度为10 cm杯底有孔)中，置于植物生长室中培养。定期浇水，每天光照12 h，昼夜温度为25 ℃ / 18℃。当苗生长3月龄时，将长势一致的对照烟草和2种转基因烟草移入人工气候箱中(光照强度70 μmol m^-2 s^-1，温度25 ℃/25 ℃，光周期为12 h/12 h，相对湿度为60%—70%)适应两天后，进行持续低温胁迫处理，温度梯度为16、10、6、4 ℃，每个温度处理72 h。实验重复3次，每次重复非转基因型和转基因型烟草(RD29A∶ sikRbcs2和35S∶ sikRbcs2)各20株苗。

选择并标记植株倒四叶，各温度处理72h后，用GFS-3000便携式光合系统测定仪测定气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、净光合速率(Pn)、胞间CO₂浓度(Ci)。将待测植株暗处理20 min后，用Mini-PAM光量子分析仪测定荧光参数：初始荧光强度(Fo)、最大荧光强度(Fm)、PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(qN)、电子传递速率(ETR)。每叶测定3个值，取平均值。

在各温度处理后，取非转基因型烟草和转基因型烟草植株倒四叶中部叶片，选取的叶片要求无黑斑、无病变、无腐烂，颜色均匀一致。剪成约1 mm宽的细丝，准确称取0.1 g放至试管，加入15 mL丙酮乙醇混合液(体积分数为1∶1)，在室温下避光提取至细丝完全变白后，混匀取上清液用分光光度计测定470、645 nm和663 nm处的吸光度值。计算叶绿素a(Chla)，叶绿素b(Chlb)和类胡萝卜素(Car)含量。

叶片生长指数(PI) 根据Coleman和Grcyson^[18]的测定方法，计算公式为PI =n + (In n－In R) / (In Ln－In Ln + 1),式中参比叶长R为180 mm，n 为叶片长度长于参比叶长的叶片数，In Ln 和In Ln + 1分别为第n 及n + 1片叶的长度。株高用直尺测量，茎的直径用游标卡尺测量，叶长和叶宽用直尺测量，鲜重和干重用电子天平测量，分别在处理前、低温梯度持续处理12d后和恢复14d测定。

采用SPSS17.0软件进行数据处理分析，以LSD法进行差异显著性分析，显著性水平设定为P＜0.05(显著水平)和P < 0.01(极显著水平)，采用Excel软件作图。

Fo为初始荧光，表示已经暗适应的光合机构PSⅡ反应中心完全开放时的荧光强度，即原初电子受体QA完全氧化时的荧光产量。Fo值的上升表明PSⅡ反应中心发生可逆失活或破坏^[19]。由图1可知，随着胁迫温度的降低，非转基因型烟草的Fo值呈逐渐上升的趋势，转基因型烟草的Fo值先下降后上升，在4℃胁迫处理后，转基因型烟草Fo值极显著低于非转基因型烟草，说明转基因型烟草PSⅡ反应中心遭到的破坏程度要小于非转基因型烟草。Fm为最大荧光产量，指已经暗适应的光合机构PSⅡ反应中心完全关闭时的荧光强度。随着胁迫温度的降低，非转基因型烟草的Fm值降幅较大，组成型表达sikRbcs2基因的烟草Fm值在10 ℃胁迫后，极显著高于非转基因型烟草的Fm值，但是诱导型表达sikRbcs2基因的烟草Fm值一直保持较低的水平，并且随着胁迫温度的降低其降幅也较小。Fv/Fm是PSⅡ最大光化学效率，能反映PSⅡ反应中心光能转化效率，其值的降低表明植物发生了光抑制^[20]。低温胁迫下非转基因型烟草和转基因型烟草叶片的Fv/Fm下降与胁迫程度呈正相关，到4 ℃胁迫处理后非转基因型烟草Fv/Fm值下降20%，组成型表达sikRbcs2烟草Fv/Fm值下降11%，诱导型表达sikRbcs2烟草Fv/Fm值下降14%，由此说明转35S∶sikRbcs2型烟草发生光抑制程度小于转Rd29A∶sikRbcs2型烟草且都小于非转基因型烟草。

图 1 低温胁迫对CK型和sikRbcs2型烟草初始荧光、最大荧光和PSⅡ最大光化学效率的影响 Fig. 1 Effect of low temperature stress on Fo,Fm and Fv/Fm in CK and sikRbcs2 tobacco CK： 非转基因型烟草， 35S∶sikRbcs2表示转35S∶sikRbcs2型烟草， RD29A∶sikRbcs2表示转RD29A∶sikRbcs2型烟草； Fo: 初始荧光Minimal fluorescence, Fm: 最大荧光Maximal fluorescence, Fv/Fm: PSⅡ最大光化学效率The maximal photochemical efficient of PSⅡ； * 同一温度胁迫处理下sikRbcs2型烟草与CK型烟草相比差异达到显著水平(P < 0.05)； ** 同一温度胁迫处理下sikRbcs2型烟草与CK型烟草相比差异达到极显著水平(P < 0.01)

图选项

qP为光化学猝灭系数，反映了PSⅡ原初电子受体QA的还原状态和PSⅡ开放中心的数目，其值下降说明QA-QB的电子传递受到抑制^[19]。其值越低说明PSⅡ反应中心开放部分的比例越小，能够传递的电子数量也较少，在单位时间内光合电子传递的速度较慢^[21]。由图2可知，随着胁迫温度的降低，非转基因型烟草的qP值有明显的下降趋势，4 ℃胁迫后其值下降50.15%，组成型表达sikRbcs2烟草qP值下降26.39%，诱导型表达sikRbcs2烟草qP值下降10.29%，由此说明，低温胁迫下，非转基因型烟草QA-QB的电子传递发生了较大程度的抑制，而转基因型烟草QA-QB的电子传递受到的抑制程度较小。

图 2 低温胁迫对CK型和sikRbcs2型烟草光化学猝灭系数和非光化学猝灭猝系数的影响 Fig. 2 Effect of low temperature stress on qP and qN in CK and sikRbcs2 tobacco qP: 光化学猝灭系数Photochemical quenching, qN: 非光化学猝灭系数Non- photochemical quenching； * 同一温度胁迫处理下sikRbcs2型烟草与CK型烟草相比差异达到显著水平(P < 0.05)； ** 同一温度胁迫处理下sikRbcs2型烟草与CK型烟草相比差异达到极显著水平(P < 0.01)

图选项

qN为非光化学淬灭，反映了PSⅡ天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而是以热的形式耗散的部分，当PSⅡ反应中心天线色素吸收了过量的光能时，如不能及时地耗散掉，将对光合机构造成失活或破坏，所以非光化学淬灭是植物体的一种自我保护机制，对光合机构起一定的保护作用^[22]。由图2所示，随着低温胁迫程度的加剧，非转基因型烟草的qN基本没有变化，但转基因型烟草qN呈上升趋势，诱导型表达sikRbcs2基因的烟草在16 ℃处理后有明显的上升趋势，说明转基因型烟草受到低温胁迫后能够以热的形式耗散过多的光能，对光合机构起到一定的保护作用，在低温胁迫下有更好的适应性和耐受性。

ETR为表观光合电子传递速率，是光合作用中光能转化最大效率的一种度量，可以反映光合机构机能的变化^{[3, 23]}。如图3所示，在低温胁迫后，非转基因型烟草的电子传递效率极显著低于转基因型烟草的ETR值(P < 0.01)并且降幅较大。在正常生长条件下，组成型表达sikRbcs2基因的烟草电子传递效率显著高于非转基因型烟草，16 ℃胁迫处理后转基因烟草的电子传递效率显著高于非转基因型烟草(P < 0.05)，随着胁迫温度的降低，转基因烟草的电子传递效率极显著高于非转基因型。在4 ℃胁迫处理后，非转基因型烟草电子传递效率下降50%，组成型表达sikRbcs2基因的烟草电子传递效率下降30%，诱导型表达sikRbcs2基因的烟草电子传递效率下降16%，说明在低温胁迫期间，转基因型烟草与非转基因型烟草相比，一定程度上改善了低温胁迫对烟草叶片表观光合量子传递效率的抑制。

图 3 低温胁迫对CK型和sikRbcs2型烟草电子传递效率的影响 Fig. 3 Effect of low temperature stress on ETR in CK and sikRbcs2 tobacco ETR: 电子传递效率Rate of electronic transmission； * 同一温度胁迫处理下sikRbcs2型烟草与CK型烟草相比差异达到显著水平(P < 0.05)； ** 同一温度胁迫处理下sikRbcs2型烟草与CK型烟草相比差异达到极显著水平(P < 0.01)

图选项

通过对转基因型和非转基因型烟草的植物学性状比较发现，转基因型烟草和非转基因型烟草有较大的区别(表1)。如叶色，非转基因型烟草叶色呈绿色，组成型表达sikRbcs2基因的烟草叶色呈浓绿色，诱导型表达sikRbcs2基因的烟草叶色呈深绿。其次叶片厚度有明显的差异，厚度依次为35S∶sikRbcs2>Rd29A∶sikRbcs2>CK。由此推断转基因烟草叶片叶绿素含量可能高于非转基因型烟草，进一步对叶绿体色素含量进行测定，结果如图4所示，组成型表达sikRbcs2基因的烟草在正常生长条件下和低温处理处理期间，叶绿素含量都显著高于非转基因型烟草，而诱导型表达sikRbcs2基因的烟草在在正常生长条件下低于非转基因型烟草，但随着胁迫程度的加剧，叶绿素含量缓慢上升，非转基因型烟草则呈下降趋势。叶绿素a/b的比值在16℃胁迫后低于非转基因型烟草，随后缓慢上升。组成型表达sikRbcs2基因的烟草在胁迫处理前后，叶绿素a和叶绿素b含量显著高于非转基因型烟草，而诱导型表达sikRbcs2基因的烟草与非转基因型烟草相比变化不显著，但随着胁迫温度的降低，其值有一定的波动。与叶绿素含量相似，类胡萝卜素(Car)含量的变化是转基因烟草随胁迫温度的降低有一个动态变化的过程，而非转基因型烟草呈下降趋势。

图 4 低温胁迫对CK型和sikRbcs2型烟草叶绿体色素含量的影响 Fig. 4 Effect of low temperature stress on the chlorophyll contents in CK and sikRbcs2 tobacco Chl a： 叶绿素a Chlorophyll a, Chl b： 叶绿素b Chlorophyll b, Car： 类胡萝卜素 Carotenoids； * 同一温度胁迫处理下sikRbcs2型烟草与CK型烟草相比差异达到显著水平(P < 0.05)； ** 同一温度胁迫处理下sikRbcs2型烟草与CK型烟草相比差异达到极显著水平(P < 0.01)

图选项

由图5可知，低温对于烟草植物的净光合速率，气孔导度，蒸腾速率影响很大，不论是转基因烟草还是非转基因型烟草，在16 ℃处理72h后，净光合速率，气孔导度，蒸腾速率急剧下降，并在持续的低温处理期间，一直处于较低的水平。转基因烟草和非转基因型烟草胞间CO₂浓度随着温度梯度的呈下降趋势，转基因烟草下降趋势趋缓，并在16—4 ℃区间维持相对较高的水平。通常认为植物在受到逆境胁迫时，净光合速率的下降是由以下两种因素引起，一种是气孔因素，另一种是非气孔因素^{[24, 25]}。当净光合速率下降是由于气孔关闭导致细胞间隙CO₂浓度降低从而降低了光合能力说明是由气孔因素引起的。当净光合速率和气孔导度下降的同时胞间CO₂浓度却上升，即净光合速率的降低是由非气孔因素引起的。本试验结果表明在低温胁迫下非转基因型烟草和转基因型烟草的净光合速率下降主要是由气孔关闭引起的。

图 5 低温胁迫对CK型和sikRbcs2型烟草净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度蒸腾速率的影响 Fig. 5 Effect of low temperature stress on Pn、Gs、Ci、and Tr in CK and sikRbcs2 tobacco Pn: 净光合速率Net photosynthetic rate, Gs: 气孔导度Stomatal conductance, Ci: 胞间CO2浓度Intercellular CO2 concentration, Tr: 蒸腾速率Traspiration ratio； * 同一温度胁迫处理下sikRbcs2型烟草与CK型烟草相比差异达到显著水平(P < 0.05)； ** 同一温度胁迫处理下sikRbcs2型烟草与CK型烟草相比差异达到极显著水平(P < 0.01)

图选项

如图6所示，在低温胁迫处理12d后，非转基因型烟草叶片生长指数PI基本不变，表明其生长基本停止，转基因型烟草叶片生长指数与处理前相比有一定的增加，其中组成型表达sikRbcs2基因的烟草增加12.18%,诱导型表达sikRbcs2基因的烟草增加10.55%。恢复处理14d后，非转基因型烟草PI值增加9.1%，组成型表达sikRbcs2基因的烟草增加36.81%,诱导型表达sikRbcs2基因的烟草增加22.68%。由此可见，在低温胁迫解除后，转基因型烟草能够迅速恢复生长而非转基因型烟草恢复较慢。株高、直径是对温度十分敏感的主要农艺性状之一^[26]。低温处理期间，非转基因型烟草的株高和直径基本不变，生长被抑制，转基因型烟草在低温处理后及恢复后株高和直径都高于非转基因型烟草，其中株高极极显著高于非转基因型烟草。

图 6 低温胁迫对CK型和sikRbcs2型烟草叶片生长指数、株高和直径的影响 Fig. 6 Effect of low temperature stress on PI 、shoot lenght and stem diameter in CK and sikRbcs2 tobacco 处理后指从持续低温16—4 ℃的12d后；恢复后指从低温处理后放置正常生条件下14d后； * 同一温度胁迫处理下sikRbcs2型烟草与CK型烟草相比差异达到显著水平(P < 0.05)； ** 同一温度胁迫处理下sikRbcs2型烟草与CK型烟草相比差异达到极显著水平(P < 0.01)

图选项

低温处理对生长量的影响如表2所示，经持续低温处理后非转基因型烟草地上部分鲜重下降，而转基因型烟草地上部分鲜重有比较明显的增加，其中组成型表达sikRbcs2基因的烟草增加74.49%，诱导型表达sikRbcs2基因的烟草增加 19.53%。恢复14d后转基因型烟草和非转基因型烟草生长量都呈增加趋势，其中组成型表达sikRbcs2基因的烟草增加43.1%，诱导型表达sikRbcs2基因的烟草增加 55.5%，非转基因型烟草增加22.55%。对于地下部分而言，转基因型烟草根系比较发达，经低温处理后均导致了非转基因型烟草和转基因型烟草鲜重的降低，在恢复处理后均有所升高。通过干重的比较可以发现，经低温处理后，非转基因型烟草的地上部分干重下降，而转基因型烟草地上部分干重有一定程度的增加，恢复14d后地上部分干重的增幅为35S：sikRbcs2(50.26%)>Rd29A∶sikRbcs2(38.4%)>CK(26.88%)。低温处理后地下部分干重并未下降，在恢复过程中都有一定程度的升高，增幅变化为Rd29A∶sikRbcs2(58.95%)> 35S∶sikRbcs2(41.34%)>CK(32.14%)。

当前，对于Rubisco小亚基在抗逆方面尤其是光保护机制的研究几乎是空白。本研究发现，表达新疆雪莲Rubisco小亚基sikRbcs2基因的烟草，不仅对光合系统具有良好的低温光保护作用，而且能够使转基因植物在低温条件下具有良好的生长特性。在正常的生长条件下，转基因型烟草在形态上与非转基因型烟草表现出明显的区别。转基因型烟草叶色深，叶片厚，叶面皱折，长宽比减小，根系发达，生长快。这与高山植物叶绿体小而多，叶片厚，栅栏组织发达相类似。诱导型表达sikRbcs2基因烟草和组成型表达sikRbcs2烟草与非转基因型烟草相比表现出明显的高山植物光合机构特点的趋向性，这说明sikRbcs2基因对于植物生态适应性的表型发育可能具有一定调节作用。

植物在受到逆境胁迫时，叶绿体色素的含量和组成会发生相应的变化，能够反映植物光合能力的强弱^[27]。转基因烟草在正常和低温胁条件下，叶绿素的含量显著高于非转基因型烟草，保持了较高的光能捕获能力。在低温胁迫条件下，转基因烟草的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)显著高于非转基因型烟草，而且转基因型烟草的qP下降缓慢，电子传递效率ETR值也显著高于非转基因型烟草，说明转基因型烟草能够保持较高的光合电子传递效率，产生较多的同化力以满足暗反应过程的需求。生物量的测定也证明：在持续的低温胁迫条件下，转基因型烟草鲜重，干重都远高于非转基因型烟草。

转基因烟草的净光合速率对低温处理更敏感，虽然随着低温处理强度增加和时间的延长，转基因烟草的净光合速率有缓慢增高的趋势，但总体上净光合速率的水平与非转基因型烟草相差不大。那为什么非转基因型烟草在低温处理期间，净同化产物为负增长，而转基因植物却产生较多的净同化产物呢？在光周期12 h/12 h处理期间，非转基因型烟草全天的呼吸消耗大于净光合速率，而转基因烟草植株一方面可能由于处理前期的生长量大，用于光合作用的叶面积较多，另一种方面转基因植物电子传递效率较好，产生的同化力积累较多，可能在非光照条件下，能够重新利用呼吸作用产生的CO₂用于暗反应中的碳同化。

较高的电子传递效率，能够产生更多的ATP和NADPH,这对于低温条件生长的植物可能是重要的。非转基因型烟草在低温胁迫下，光化学猝灭系数qN处在一个较低的水平，Fo上升，Fv/Fm下降，有效电子传递效率ETR降低，表明PSⅡ反应中心发生部分失活或伤害，降低了反应中心对激发能的捕获能力和光合电子由PSⅡ反应中心向质体醌(QA，QB，PQ)库传递。而转基因烟草Chla／Chlb比值较高，而较高的叶绿素a/b 也是高山植物对低温和强光辐射等多变环境的适应^{[19, 20]}，Chla／chlb比值的变化可以反映出两个光系统核心复合物与外周天线组分对低温的敏感性和损伤程度^[28]。同时，转基因烟草还含有较高水平的类胡萝卜素，它与热能的耗散密切相关，能够帮助植物耗散过多的光能来抵御光造成的损伤^[29]。这说明转基因烟草具有较好的光合保护力，在低温条件下维持较高的线性电子传递能力。

RD29A的启动子具有冷诱导的特点，由它驱动的sikRbcs2基因在烟草中的表达，在低温条件下，表现出与组成型表达sikRbcs2基因烟草相似的Fv/Fm、ETR、qP、qN和净干物积累较多的光合特性，说明sikRbcs2基因在提高烟草植物的低温光合中起到了重要作用，这种作用是否是由于改变了Rubisco羧化酶／加氧酶特性还不清楚，有待深入研究。