物种间的竞争作用对于特定群落内各物种的组成与分布有着重要的影响，进而成为改变群落结构的重要驱动力^{[1, 2, 3, 4]}。因此，物种间的竞争作用一直是群落生态学研究的一个重要内容，而由北美生态学家David Tilman提出的资源竞争理论一直是生态竞争理论的重要组成部分，并且已得到了广泛的实验验证^{[5, 6, 7, 8, 9, 10, 11]}。具体说来，Tilman的资源竞争理论是指当某一特定资源i对各物种的生长及发育起着重要的限制性作用的时候，对该资源的需求程度最低的物种将排斥那些对该资源的需求程度较高的物种，并在资源的竞争过程中占据优势地位。当采用微藻进行实验验证的时候，Tilman发现那些在单独培养的条件下能将某种限制性资源i(比如说氮素)的浓度降至很低水平且仍能 保持着稳态增长的藻类(其生长率等于死亡率，而此时该限制性资源i的浓度设定为R^*；简称为R^*法则)，当其与别的藻类在稳态条件下进行混合培养的时候会成为优势种，并且使得其它藻类因为受到竞争排斥作用影响而局部绝灭^{[12, 13]}。换言之，在稳态条件下，当某种营养元素成为限制性因子的时候，对该限制性营养元素有最低需求(最小R^*值)的藻类将竞争排斥其它藻类，使得初期的混合生长格局渐变成终期的单一生长格局。

然而，实验室条件下养分资源的稳态供给方式在自然状态下很难实现。事实上，天然湖泊中的养分资源大多表现为短时间内高幅度的脉冲供给方式^{[14, 15]}。在此期间，各微藻经历着从种群数量增加到种间竞争增强等一系列生物过程，而对应微藻群落在发展后期往往表现为几种占据绝对优势地位的藻类，同时伴生着一些个体数量较少的藻类。很显然，资源脉冲非稳态条件下所观察到的藻类竞争结果与稳态条件下竞争排斥理论所预测的结果并不一致^{[16, 17, 18, 19, 20, 21]}。然而，资源脉冲是否能够抑制稳态条件下的竞争排斥作用，从而使得具有不同竞争能力的藻类得以共存，还是区域种库作用促成了藻类的共存却不反映藻类之间的竞争关系且独立于资源脉冲作用之外，抑或空间异质性促进了藻类共存等重要的群落生态学问题在天然湖泊中难以进行严格的实验检验^{[22, 23]}。因此，在控制区域种库效应和空间异质性效应的前提下严格检验资源竞争理论在资源脉冲非稳态条件下的适用性，不但能为生态竞争理论的发展和完善提供重要的实验支撑，而且与藻类水华大规模爆发的机理机制研究和相应的预警防治研究紧密相关，从而有着较强的现实意义。

本实验的研究对象为淡水系统里常见的几种微藻。通过在稳态条件下对各微藻进行单一培养，从而获得在氮素和磷素分别为生长限制性因子情况下各微藻的生长特征参数及相应的R^*值，进而在养分资源脉冲非稳态供给的方式下对所有实验微藻进行混合培养，检测基于稳态条件下获得的单一微藻生长特征参数是否可用于预测非稳态条件下混生微藻的竞争结果及群落最终构成情况。

本实验中采用了以纤细角星鼓藻(Staurastrum gracile)，微星鼓藻(Micrasterias rotata)，小书状新月藻(Closterium libellula)和颗粒鼓藻(Cosmarium granatum)为代表的4种绿藻和以小颤藻(Oscillatoria tenuis) 为代表的一种蓝藻。选取的五种微藻均为淡水生态系统中常见的微藻种类，并且具有易于区分的外部形态特征。实验藻类均购自Carolina Biology Supply，并且在实验开展前置于不含氮素和磷素成分的WC培养液^[24]中培养10d。

在对微藻进行单一培养时，各培养液中其它营养元素的配方均与原WC培养液配方保持一致，而氮素和磷素的成分则进行了相应的调整。在氮素缺乏的条件下设置了一系列的硝酸根离子浓度梯度(从低到高依次为0、 0.25、 0.5、1、2、 4、8、16和32μmol/L)，而各培养液中磷酸根离子的浓度均为61.332μmol/L，从而保证了各培养液中磷素供给充足而氮素是唯一限制性因子(N : P<1)。类似的，在磷素缺乏的条件下设置了一系列的磷酸根离子浓度梯度(从低到高依次为0、0.025、 0.05、0.1、 0.2、 0.4、0.8、1.6 和3.2μmol/L)，而各培养液中硝酸根离子的浓度均为1000μmol/L，从而保证了各培养液中氮素供给充足而磷素是唯一限制性因子 (N : P>300)。此外，在对微藻进行混合培养时，根据雷德菲尔德比例和生态化学计量学原理设置了不同氮磷浓度比例的培养液^{[25, 26]}，其中N : P=16 : 1(N=8μmol/L,P=0.5μmol/L)代表了氮素和磷素供给平衡的情况，N : P=1 : 1(N=8μmol/L,P=8μmol/L) 代表了氮素缺乏的情况，而N : P=180 : 1 (N=8μmol/L,P=0.044μmol/L) 代表了磷素缺乏的情况。单培养实验每组做3个平行样，而混合培养实验每组做5个平行样。

所有的实验藻类(单培养或者混合培养方式)均置于盛有50mL培养液的总容积为125 mL的锥形瓶中进行培养。所有的实验锥形瓶均置于光照培养箱中，保持温度为20℃，光照为2500 lx和光暗比为12h : 12h的条件。每日光照生长期内每隔2 h人工摇动振荡锥形培养瓶1次以减少微藻群落结构空间异质性的形成，并随机更换锥形瓶在光照培养箱中的位置以减少位置效应。

在微藻单一培养的方式下,每天在取样前先均匀混合培养液，用移液管取出5mL培养液(占培养液总体积的10%，稀释率为0.1d^-1)，选取其中的0.25mL进行藻细胞计数并重复4次，然后在计数完毕后重新加入5mL相应的培养液，并且整个取样过程一共持续15d。在微藻混合培养的方式下，每7d进行1次取样，并且整个取样过程一共持续50d。每次取样前先均匀混合培养液，然后用移液管取出10mL培养液，选取其中的0.25mL进行藻细胞计数并重复4次，且在计数完毕后重新加入10mL相应的培养液。需要说明的是，本实验中藻类的单一培养条件属于半连续培养方式，符合Tilman竞争理论的稳态条件，因此可以通过Monod竞争方程对藻类的生长方式进行描述，从而得到各藻类的生长特征参数。而在藻类的混合培养状况下(起始各藻类的初始密度均为100细胞/mL)，则通过脉冲式资源供给的方式(在混合实验开展后的第3天开始每隔1周在各混合藻类群落中加入2mL浓度为对应培养液浓度10倍的加强培养液)来模拟混生藻类所需养分资源供给的非稳态化，进而检测基于稳态条件下获得的各藻类生长特征参数及R^*值是否可用于预测非稳态条件下混生藻类的竞争结果。

在理论建模过程中，将单培养实验条件下3组平行样采集的试验数据取平均值后,采用Monod生长模型进行非线性数据拟合,获得模拟生长曲线,并计算各藻类的生长特征参数，即半饱和常数和最大比生长速率，以及在氮素或磷素约束条件下对应的R^*值。

Monod方程 y=μ_max×s/(KS+s) (1)

式中，y为藻体的生长比速; s为限制性基质浓度; KS为半饱和常数; μ_max为藻体的最大比生长速率。

R^*=d×KS/(μ_max－d) (2)

式中，d为稳态条件下的稀释率。

以上所有分析计算过程均通过使用R软件中的nlme package进行。

对各藻类进行单一培养时，在氮素或磷素约束条件下各藻类的模拟生长曲线如图 1—图 2所示。具体说来，在氮素缺乏的条件下，各藻类的半饱和常数值从大到小依次为小书状新月藻>微星鼓藻>颗粒鼓藻>小颤藻>纤细角星鼓藻，各藻类的最大比生长速率从大到小依次为纤细角星鼓藻>小书状新月藻>颗粒鼓藻>微星鼓藻>小颤藻，而根据R^*值的大小对各藻类的竞争力排序从大到小依次为：纤细角星鼓藻>小颤藻>颗粒鼓藻>小书状新月藻>微星鼓藻(表 1)。相应的，在磷素缺乏的条件下，各藻类的半饱和常数值从大到小依次为小书状新月藻>微星鼓藻>颗粒鼓藻>小颤藻>纤细角星鼓藻，各藻类的最大比生长速率从大到小依次为纤细角星鼓藻>微星鼓藻>小书状新月藻>颗粒鼓藻>小颤藻，而根据R^*值的大小对各藻类的竞争力排序从大到小依次为纤细角星鼓藻>颗粒鼓藻>微星鼓藻>小书状新月藻>小颤藻(表 2)。

图1 实验微藻在氮素缺乏条件下的生长曲线 Fig. 1 The growth curve of experimental algal species under nitrogen limiting conditions

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图2 实验微藻在磷素缺乏条件下的生长曲线 Fig. 2 The growth curve of experimental algal species under phosphorous limiting conditions

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X 养分资源脉冲供给条件下对各藻类进行混合培养的实验末期，在无论氮素缺乏(N : P=1 : 1)、磷素缺乏(N : P=180 : 1)或者氮磷素供给相对平衡(N : P=16 : 1)的条件下纤细角星鼓藻均为优势种。然而，纤细角星鼓藻的强竞争作用并没有导致其它藻种的绝灭。在氮素缺乏的条件下，纤细角星鼓藻能够与小书状新月藻、颗粒鼓藻和小颤藻共存；在磷素缺乏的条件下，纤细角星鼓藻能够与微星鼓藻、颗粒鼓藻和小颤藻共存；而在氮磷素供给相对平衡的条件下，所有藻类均可共存(图 3)。

图3 脉冲资源作用下混合藻类竞争结果 (基于第43天和第50天测定结果的平均值) Fig. 3 The effect of resource pulses on the competitive outcome of mixed algal species (the analysis is based on the average measured values on day 43 and 50 of the experiment)

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在单一培养的稳态条件下，无论是氮素或者磷素缺乏时纤细角星鼓藻均具有最小的R^*值。根据Tilman提出的资源竞争理论进行预测，稳态条件下纤细角星鼓藻将通过种间竞争作用排斥其它藻类。当对各藻类进行混合培养且养分资源以脉冲非稳态方式进行供给的时候，在氮素缺乏(N : P=1 : 1)或者磷素缺乏(N : P=180 : 1)的条件下纤细角星鼓藻均为优势种且有着最高的种群密度，这与资源竞争理论中的R^*法则相一致。然而，资源脉冲作用下其它藻类仍然能够与纤细角星鼓藻共存。考虑到实验中的各个锥形瓶都是相互独立的个体，藻类在各锥形瓶之间随意散播的方式并不存在(区别于集合群落metacommunity)，同时在实验中也严格控制了区域种库和空间异质性的影响作用，因此各锥形瓶内的最终群落结构主要是由藻类之间的竞争关系所决定。在资源脉冲式供给的非稳态条件下，优势种纤细角星鼓藻并没有完全竞争排斥其它藻类，这是因为当养分资源以脉冲式供给的方式进入藻类生活的水体环境的时候，短时间内充足的养分资源可以减缓各藻类间的竞争压力。此外，具有强竞争力的藻类在资源脉冲条件下可以快速生长(如较高的生长速率和较多的种群数量)，而那些竞争力较弱的藻类则可能采取了另外一种竞争策略，即增加其细胞对养分资源的储存能力而得以在外界养分资源受限的情况下得以生存，并在下一次养分资源进入水体环境的时候对这些脉冲资源进行快速有效地利用和存储^{[27, 28, 29]}。

如果不考虑广泛存在的纤细角星鼓藻，不同锥形瓶中各藻类群落的构成在氮素或者磷素缺乏的条件下有所不同。在氮素缺乏的条件下，其它的藻类主要包括小书状新月藻、颗粒鼓藻和小颤藻，其中小颤藻的相对比重最高；而在磷素缺乏的条件下，其它的藻类主要包括微星鼓藻、颗粒鼓藻和小颤藻，其中颗粒鼓藻类的相对比重最高。由于小颤藻对氮素的竞争力仅次于纤细角星鼓藻而优于其它藻类(表 1)，而颗粒鼓藻对磷素的竞争力仅次于纤细角星鼓藻而优于其它藻类(表 2)，这就解释了在不考虑纤细角星鼓藻的前提下这两种藻类分别在氮素或者磷素缺乏的条件下占有较高比重的原因。值得一提的是，以颤藻为代表的许多蓝藻种类均具有一定的固氮能力，故而在水体氮素浓度较低的情况下仍能够正常生长，而磷素往往成为其生长发育的重要限制性因子^{[30, 31]}。在本实验中，小颤藻的种群数量在磷素限制的条件下十分有限，而在氮素限制的条件下明显增加。因此，通过减少水体环境氮素浓度来控制自身有着固氮能力的蓝藻的方法可能并不是行之有效的科学手段。事实上，一些研究显示，控制水体磷素含量及磷素来源才是蓝藻水华防控的重要手段^{[32, 33]}。此外，尽管本实验中多数微藻的种间竞争力随水体环境中氮素和磷素的供给比例而发生变化，在其它环境因子(如水体温度和光照程度)改变的情况下微藻的种间竞争关系和对应的微藻群落结构也可能会发生相应的变化。因此，未来的研究应全面考虑这些不同的环境因子对微藻种间竞争力的综合影响作用。

在氮素和磷素同时起限制性作用的时候(N : P=16 : 1),根据资源竞争理论，有且最多仅有两种藻类可以共存。本实验结果显示，所有藻类在氮素和磷素同时起限制性作用的时候可以共存。一种可能的解释是，以脉冲方式供给的养分资源促使藻类采取快速生长或者增加细胞储存能力等不同的策略方式来充分利用养分资源且得以共存。另外一种解释是，资源脉冲作用下的负密度制约效应可能参与调节多藻类的共存^[34]。虽然无法对这些机制作进一步的研究探索，但是本实验资源脉冲作用下多种藻类的共存现象与自然水体中的观测现象相一致，显示了资源脉冲可能是维持生物多样性水平的一个重要机制。

水体富营养化是当今世界面临的最主要的水污染问题。特别是水体富营养化促成的蓝绿藻水华大规模爆发事件，已经对人类健康和生态系统安全造成了严重的威胁。目前普遍被接收的一个观点是，氮素和磷素的大量释放是导致水体富营养化和水华形成的重要原因^{[32, 33, 35, 36]}。一些研究还显示，养分资源的脉冲式释放可以促进外来物种的入侵，并且水华的负面影响效果在全球变暖的情况下还将加剧^{[29, 37]}。因此，深入了解水体环境富营养化过程中氮素与磷素的化学构成、供给比例及其对藻体群落结构与功能的影响，特别是资源脉冲式释放过程中微藻群落的发展轨迹及密度制约效应的改变，将为蓝绿藻水华的有效控制与治理提供重要的理论指导和科学依据。

致谢: 感谢何淑嫱和柯珍恋对写作的帮助和云南生物多样性研究院相关人员的支持。