香蕉是世界上最重要的作物之一，在许多发展中国家作为一种主要的食物和经济来源^[1]。香蕉在拉丁美洲、非洲和亚洲的农业基础经济中是一种稳定的出口商品，是世界贸易中的第五大重要农产品^[2]。同时，香蕉是我国南方的五大名优果品之一，是国内市场和出口创汇的重要资源^[3]。在全球香蕉产业快速发展的同时，一种对香蕉具有毁灭性危害的病害——香蕉枯萎病也正不断地在香蕉种植区蔓延，个别香蕉园区甚至无法再种植香蕉，出现丢荒现象，导致香蕉种植面积逐渐减少，香蕉产业受到了严重的打击^[4]。

香蕉枯萎病又名香蕉巴拿马病、黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型 (Fusarium oxysporum f. sp. cubense,FOC)侵染而引起维管束坏死的一种毁灭性真菌病害。香蕉枯萎病的致病菌—FOC属于半知菌类、从梗孢目、瘤座孢科、镰刀菌属。目前，FOC属国际检疫对象^[3]。大量的研究表明，在环境条件相对不变条件下，随着土壤病原菌数量的增加，作物土传病害的发生呈上升趋势^{[4, 5]}。因此能否有效的降低土壤中病原菌的数量是防控土传病害取得成功的关键因素。

在没有寄主存在的情况下，FOC产生厚垣孢子，可以在土壤里存活数年至数十年之久^{[6, 7]}，该病菌可通过土壤、水、农具和人等媒介传播，致病力强，感染率高，死亡率也高，防治难度极大^{[8, 9]}。目前生产上主要通过化学防治、生物防治、培育抗病品种和一些农业防治措施来减缓香蕉枯萎病的发生。根据香蕉生产者多年的实践，应用农药和对种植土壤的处理都没能有效地防止香蕉枯萎病的发生和扩展^{[3, 6, 10]}。使用无病组培苗和抗病品种也不能达到理想的防治效果^[11]。近年来，生物防治由于具有环保、无污染等特点日益受到人们的重视，但是单纯生防菌防病速度慢，且效果不稳定，原因可能是生防菌作为外来菌受土壤条件影响大，不易在土壤中繁殖和发挥效果^[12]，所有对于香蕉枯萎病的防治目前尚未找到理想的防治方法^{[13, 14, 15, 16]}。本试验采用一种土壤快速强烈还原的方法，使得短时间内土壤中的FOC数量下降从而达到防治香蕉枯萎病的目的。

供试土壤 试验地块位于海南省乐东县万钟公司香蕉种植园内，此地块前几年所种植的香蕉发病严重，枯萎病发病率高达40%—50%，因为较高的发病率，此地块已被撂荒1a。供试有机物料：秸秆、新鲜猪粪和甘蔗渣分别在当地水稻田、养殖场和糖厂所获得，充分晾干。供试培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基和高氏一号培养基配方参照文献^[17]。FOC选择性培养基(K2培养基)^[18]：K₂HPO₄ 1 g、KCl 0.5 g、MgSO₄·7H₂O 0.5 g、Fe-Na-EDTA 0.01 g、L-天门冬酰胺 2 g、半乳糖10 g、琼脂16 g，去离子水定容至900 mL，高压灭菌后冷却至60 ℃，加入100 mL盐溶液(五氯硝基苯 75% WP，0.9 g、Oxgall 0.45 g、Na₂B₄O₇·10H₂O 0.5 g、硫酸链霉素0.3 g，用10%磷酸调pH值至3.8±0.2)。

在上述地块里挖出直径0.65 m、深0.5 m的坑，坑内土壤重量为209 kg，在坑内垫上塑料薄膜，然后将土壤与有机物料混匀后加入坑中，处理期间保持土壤淹水状态。试验分为10个处理：原位土壤(CK1)、扰动不淹水(CK2)、扰动淹水(CK3)、低量秸秆(LS)、高量秸秆(HS)、高量秸秆+石灰(HSL)、猪粪(PM)、甘蔗渣(BA)、甘蔗渣+石灰(BAL)和石灰(LI)。低量秸秆用量(质量分数)为0.6%；高量秸秆和甘蔗渣用量为1.2%；猪粪用量为1.6%；石灰用量为0.3%。秸秆、甘蔗渣和猪粪的C/N分别为46.0、129.6和12.83。每个处理3个重复。处理周期为15 d天，处理完成后排水，土壤自然落干。分别于处理前、处理第5天、第10天和第15天采集5—20 cm土层的土样；土壤落干后采集5—20 cm和20—40 cm土层的土样。处理期间土壤温度为25—40 ℃。

将土壤分别与水和2 mol/L KCl 溶液(质量分数)以1 ∶ 5的比例混匀，200 r/min振荡1 h后过滤。水溶液分别用pH计(Mettler S220K,Switzerland)和离子色谱(Thermo Dionex ICS 1100,USA)测定土壤的pH值和硫酸根的浓度；KCl溶液用流动分析仪(Skalar San++,Holland)测定土壤中的铵态氮和硝态氮的浓度。

称取土壤样品10 g，加入到90 mL无菌水中，170 r/min振荡20 min，进行系列梯度稀释后分别于牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马丁氏培养基和K2培养基上涂布，30 ℃培养2 d后计取土壤样品中可培养细菌数量，4 d后计取放线菌、真菌和FOC的数量。

土壤DNA的提取使用Power Soil^TM DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc.,USA)，具体方法参照文献^[19]。土壤DNA的浓度测定使用NanoDrop 2000微量紫外分光光度计(Thermo Scientific Inc.,USA)。

试验数据处理使用Excel 2003和SPSS 13.0(SPSS Inc.,Chicago,USA)统计分析软件。并采用Duncan氏新复极差法检验差异显著性(P＜0.05)。

在所有淹水的处理中(处理3—10)，土壤的pH值在第5天都有增高的趋势，其中除了BA处理以外，与处理前pH值相比差异均显著，其中第5天LI处理的pH值与处理前相比增加了3.39。随着处理时间的增加，淹水的处理中土壤pH值逐渐下降，土壤落干后，淹水但未加石灰的处理(CK3、LS、HS、PM和BA)中土壤的pH值下降到处理前的水平，而添加石灰的处理(HSL、BAL和LI)中土壤的pH值还显著大于处理前土壤中的pH值。CK1和CK2处理中不同时期的土壤pH值差异并不显著(图 1)。

图 1 不同处理中pH值的变化 Fig. 1 The range of pH values in soils of different treatments CK1：原位土壤Untreated soil; CK2：扰动不淹水Disturbed soil without flooding; CK3：扰动淹水Flooding disturbed soil; LS：低量秸秆Flooding soil incorporated with rice straw at low rate; HS：高量秸秆Flooding soil incorporated with rice straw at high rate; HSL：高量秸秆+石灰HS plus lime; PM：猪粪Flooding soil incorporated with pig manure; BA：甘蔗渣Flooding soil incorporated with bagasse; BAL：甘蔗渣+石灰BA plus lime; LI：石灰Flooding soil incorporated with lime；低量秸秆用量为0.6%质量分数；高量秸秆和甘蔗渣用量为1.2%；猪粪用量为1.6%；石灰用量为0.3%

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在所有淹水的处理中(处理3—10)，随着处理时间的增加，土壤中的SO^2-₄的浓度均有下降的趋势，土壤落干后添加有机物料的处理(LS、HS、HSL、PM、BA和BAL)土壤SO^2-₄的浓度显著低于处理前的水平，CK1和CK2处理土壤中SO^2-₄的浓度随着处理时间的增加并无显著差异(图 2)。与SO^2-₄的浓度变化趋势相似，所有淹水处理土壤中的NO^-₃的浓度在处理第5天均有下降，差异显著；处理第10天时，NO^-₃的浓度接近零；土壤落干后，所有淹水处理土壤中的NO^-₃的浓度有较小的增加，但与处理前相比差异仍显著(图 3)。处理LS、HS、HSL、PM和LI的土壤中NH⁺₄的浓度，随着处理时间的增加，均有 上升趋势；土壤落干后，上述处理的土壤中NH⁺₄的浓度较处理前相比差异均显著，其中，PM处理土壤中NH⁺₄的浓度增加最大，是处理前NH⁺₄浓度的21.4倍；CK1、CK2、CK3、BA和BAL处理的土壤NH⁺₄的浓度随着处理时间的增加并无显著差异(图 4)。

图 2 不同处理中SO2-4的浓度 Fig. 2 The concentrations of SO2-4 in soils of different treatments

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图 3 不同处理土壤中NO-3的浓度 Fig. 3 The concentrations of NO-3 in soils of different treatments

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图 4 不同处理土壤中NH+4的浓度 Fig. 4 The concentrations of NH+4 in soils of different treatments

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所有处理土壤中的可培养细菌数量在处理的不同时期，并无明显的变化趋势，细菌的数量均在每克土10⁷—10⁸ CFU之间(图 5)。随着处理时间的增加，除了PM处理之外，所有淹水处理土壤中的可培养放线菌呈下降趋势；土壤落干后，CK3、LS、HS、HSL、BA、BAL和LI处理土壤中放线菌的数量较处理前相比差异显著，由处理前的每克土10⁶ CFU下降到10⁵ CFU；CK1、CK2和PM处理放线菌数量并无较大变化(图 6)。

图 5 不同处理土壤中细菌的数量 Fig. 5 The populations of bacteria in soils of different treatments

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图 6 不同处理土壤中放线菌的数量 Fig. 6 The populations of actinomyces in soils of different treatments

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在处理第5天，PM、BA和BAL处理土壤中的可培养真菌数量有明显的增加，这是由于猪粪和甘蔗渣中本身含有较多的真菌；随着处理时间的增加，LS、HS、HSL、BA、BAL和LI处理土壤中真菌数量呈下降趋势；土壤落干后，LS、HS、HSL和LI处理土壤中真菌数量较处理前相比显著下降，由处理前的每克土10⁴ CFU下降到10³ CFU；PM处理土壤中真菌数量增加到每克土10⁵ CFU，CK1、CK2和CK3处理土壤中真菌数量无显著变化(图 7)。与真菌数量变化趋势相似，随着处理时间的增加，LS、HS、HSL、PM、BA、BAL和LI处理土壤中FOC的数量呈下降趋势；土壤落干后，除PM之外的上述处理土壤中FOC的数量较处理前相比均显著下降，其中HS处理中FOC的数量下降最多，仅为处理前土壤中FOC数量的2.88%；PM处理土壤中FOC数量在第5天有较小的增加，因为新鲜猪粪中含有FOC；CK1、CK2和CK3处理中FOC的数量并无显著变化(图 8)。

图 7 不同处理土壤中真菌的数量 Fig. 7 The populations of fungi in soils of different treatments

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图 8 不同处理土壤中尖孢镰刀菌古巴专化型的数量 Fig. 8 The populations of Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FOC) in soils of different treatments

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多种指标可反映土壤微生物总量，本试验采用测定土壤总DNA的方法(图 9)。随着处理时间的增加，除LI处理之外所有淹水处理土壤DNA的含量呈上升趋势；土壤落干后，LS、HS、PM和BA处理上层土壤DNA的含量显著高于处理前土壤DNA含量，其中PM处理土壤DNA含量增加最大，是处理前的2.6倍，其余处理土壤DNA变化差异不显著，主要原因可能是猪粪里含有大量的微生物。结果表明：土壤淹水及添加有机物料所造成的强烈还原条件并没有降低土壤中总的微生物含量，有些处理中总的土壤微生物含量反而增高。

图 9 不同处理土壤中DNA的含量 Fig. 9 The amounts of soil DNA in different treatments

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目前已有一些通过物理方法和改进栽培措施来防控土壤病原微生物的报道，具体方法主要有：土壤加热、微波法、作物轮作、合理灌溉、调整种植日期和种植密度、土壤淹水、焚烧植物残体、土壤深翻、暴晒以及一些种植设备，如温室大棚等^[20]。土壤淹水的方法很早就被人们提出，土壤淹水对土传病原菌具有不利影响的原因可能有：形成土壤的厌氧环境^[21]、CO₂浓度增高^[22]和许多微生物在厌氧环境中产生的对病原菌具有毒害作用的代谢产物，如氨、甲烷、有机酸和硫化氢等^[23]。

Stover利用土壤淹水的方法在大尺度范围内控制FOC引起香蕉巴拿马枯萎病，土壤淹水3—4个月甚至更长时间，结果表明：当土壤中病原菌浓度较高或者存在对病原菌有利的未知因素时，淹水处理时不能够有效抑制病原菌的数量^[7]。本试验结果表明，单纯淹水在短期内对于FOC并无明显的抑制作用，而采用土壤淹水和添加有机物料产生强烈还原条件的方法能在短期内迅速杀灭土壤中的FOC，HS处理中FOC的数量由每克土1.18×10⁴ CFU下降到3.40×10² CFU。何欣等报道指出每克土10³ CFU的FOC就是香蕉枯萎病的致病浓度^[4]。因此，预计土壤淹水及添加秸秆对于香蕉枯萎病的防治将具有很好的效果。此外，夏季土壤长时间淹水处理对于防控棉花黄萎病具有较好的效果，而在冬天处理效果则不理想^[24]。本试验在亚热带地区进行，处理期间土壤温度为25—40 ℃，这可能是取得对FOC较好的抑制效果的原因。

还有报道指出，土壤中添加有机物、粪便和堆肥可以抑制植物病原菌和线虫，其机理主要有以下几个方面^{[25, 26]}：(1)有机物料储存阶段产生了对病原微生物具有毒害作用的异种化合物；(2)有机物料加入到土壤中后被土壤中的微生物分解而形成的化合物，如氨和脂肪酸等；(3)有机物料增加了土壤中病原微生物拮抗菌的活性；(4)增强了植物的抗性；(5)改变了土壤的性质，使其不适合病原微生物的生存。同时，这种抑制作用还与有机物料的种类有关^{[23, 25]}。本试验结果表明，添加秸秆与添加甘蔗渣和新鲜猪粪相比，对于FOC的抑制效果更好。此外，当地农民常采用石灰来进行土壤的消毒，本试验结果在表明淹水条件下石灰对于FOC的杀灭作用要低于添加秸秆。

土壤淹水和添加有机物料可以降低土壤的氧化还原电位^[27]，而有报道指出氧化还原电位与pH值呈负相关^[28]，本试验结果表明所有淹水处理的pH值在第5天都有不同程度的提高，但随着处理时间的增加，未添加石灰的处理pH值逐渐下降至初始水平。出现此种结果的可能原因是，土壤淹水并添加有机物料导致土壤的强烈还原状态，使得土壤pH值在短期内增高，同时厌氧条件下厌氧菌分解有机物不彻底，产生大量有机酸，这可能是随着处理时间的增加，土壤pH值逐渐下降的原因。大量的有机酸可能是本实验中病原菌被杀灭的重要原因。此外，在强烈还原条件下，土壤中的SO^2-₄和NO^-₃被逐渐还原，可能产生H₂S等气体产物；同时土壤和有机物料里的氮素被还原成NH⁺₄，从而使得土壤中的NH⁺₄大量增加，挥发出来的氨也会相应增加，这可能也是抑制植物病原菌原因。对于强还原方法抑制植物病原菌的机理还需要进一步研究。

有报道指出有些细菌和放线菌可以引起植物的病害，但更多的细菌，如芽孢杆菌和假单胞菌，可以促进植物的生长^{[29, 30]}，土壤中还有一些细菌对病原菌具有潜在的抑制能力^[31]。由于植物的高C/N比的特性，更多的植物病害是由于真菌引起的^[32]。本试验结果表明，土壤淹水及添加有机物料对于土壤细菌的数量无明显影响，但可以减少土壤中的可培养真菌和放线菌的数量，然而这些处理并没有降低土壤总的微生物量，由此可以推断这些处理土壤中不可培养微生物，例如一些严格厌氧菌的数量可能增加了。

农田秸秆及其他有机废弃物的处理一直是我国农业面临的一个重大的问题^[33]，目前对于秸秆的处理主要的焚烧，不仅造成了严重的环境污染，还造成了能源的浪费^[34]。本试验在国内首次提出采用土壤淹水同时添加有机物料快速创造土壤强烈还原条件的方法，不仅在短期内有效的抑制了土壤中的病原菌FOC，而且还能解决农田废弃物污染问题，由于具有高效和环保的优点，本方法在实践生产上将具有广阔的应用前景。