工业革命以来人类大量使用化石燃料造成大气中二氧化碳浓度上升，大气二氧化碳浓度已从工业革命前期的280μL/L上升至380μL/L，海水吸收过量的二氧化碳降低了碳酸盐矿物平衡体系，使海水pH值不断下降。目前表层海水pH值平均值比工业革命前下降了至少0.1个单位，预计至2100年，海水pH值将下降0.3—0.5个单位，至2300年可能下降0.77个单位^{[1, 2]}。海水pH值是海洋化学环境的关键因子，即使细微变化都可能对海洋生态系统产生深刻影响。

目前，对海洋酸化的研究主要集中在钙化生物生长、发育等生理特征影响的研究。Widdicombe 和 Spicer 综述了海洋酸化对海洋生物的生理特征的影响效应并指出海洋酸化可能通过影响海洋生物生理、发育、行为和生活方式等多种途径危害海洋生物的多样性^[3]。Zeebe等人的研究表明海水pH 值每下降0.2—0.3 单位会延缓许多海洋生物包括珊瑚在内的钙化^[4]。何盛毅等人研究了海洋酸化对马氏珠母贝胚胎和早期幼虫发育的影响^[5]。然而海洋酸化不仅会直接影响海洋生物，而且可能加剧其他环境胁迫(如重金属)对海洋生物和生态系统的影响效应。如 Breitbarth研究表明随着海水二氧化碳浓度的增加以及海水酸度的降低，海水中铁离子浓度随之增大从而加剧对海洋生物的毒性影响^[6]。Pascal等研究了海洋酸化与重金属的联合作用对两种猛水蚤Schizopera knabeni 和Amphiascoides atopus的毒性试验，结果表明海洋酸化增强了重金属对这两种猛水蚤的毒性效应^[7]。但是当前海洋酸化与重金属等环境胁迫联合作用的相关研究还非常薄弱，不利于全面了解海洋酸化对海洋生物和生态系统的可能带来危害，亟待开展进一步研究。

日本虎斑猛水蚤被国内外广泛应用于毒性污染物(如内分泌干扰物、防污杀菌剂以及金属污染物) 的检测^{[8, 9]},并被OECD列入毒物测试候选标准生物名单。但目前还未见海洋酸化条件下重金属对其影响的研究报道。本研究利用CO₂气体调节天然海水pH值,研究海洋酸化条件下铜、镉对日本虎斑猛水蚤的96 h急性毒性效应，探讨海洋酸化和重金属联合作用对其存活的影响，为海洋环境保护提供依据。

实验所使用的日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)成体，用人工网捕法采集于青岛市鲁迅公园附近高潮带岩礁水洼中。采集后于温度(20±2)℃、0.45 μm过滤的自然海水(pH值7.9—8.1)以及光暗周期L∶D为16 h ∶ 8 h的条件下以三角褐指藻与酵母等比混合物作为饵料进行驯化培养。

实验所用的两种重金属盐分别为氯化铜和氯化镉，均购自美国Sigma公司，Cu(CuCl₂,sigma,USA,99.999%)；Cd(CdCl₂,sigma,USA,99.99+%)，预先用三蒸水制为1 g/L的母液，于4 ℃保存。实验时进行稀释。

实验用水采集于青岛鲁迅公园附近的海域，用0.45μm的微孔滤膜过滤。实验前1—2 h，把高纯度CO₂和空气的混合气体冲入过滤保温海水,调配实验所需酸化海水(pH值7.70、7.30、6.50),然后密封且保温,1—2 h后再测定pH值和溶解氧浓度(DO),若无明显变化(pH值变化＜0.1个单位,溶解氧饱和度＞90%),作为酸化组用水。只充空气的海水作为对照组用水,pH测量值为8.00—8.10。使用梅特勒DELTA320 pH测定仪测量pH值,JPBJ-608溶解氧测定仪测DO，手持式折光仪测定盐度,滴定法测定总碱度^[10]。用盐度、总碱度和pH(取最小值和最大值),使用软件SWCO₂(http:/ /neon.otago.ac.nz/research/mfc/people/keith_hunter/software/software.htm)计算得出试验中海水的二氧化碳分压p(CO₂)(表 1)。

实验容器为密封性好的带内塞聚乙烯瓶，以保证实验前后海水pH值等条件不变，实验水体270 mL。pH值梯度设置为自然海水(pH值8.00—8.10)、7.70、7.30、6.50。根据预实验结果设置各重金属浓度梯度 Cu： 0(对照)、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/L；Cd：0(对照)、2.50、5.00、10.00、15.00、20.00 mg/L。各处理组和对照组分别设3个平行。每瓶放入游动活泼的日本虎斑猛水蚤成熟个体20只,置于温度(20±2)℃的培养箱中,光暗周期16 h ∶ 8 h。试验过程中不投饵。培养96 h后统计各实验组受试生物的死亡率。不游泳、轻敲烧杯壁或用大口滴管轻触不活动者认为死亡。

试验终止后，统计各实验组日本虎斑猛水蚤的死亡个数，求死亡率。使用软件SPSS13.0统计分析实验数据，得出各pH值条件下铜和镉的概率单位模型回归方程，96h LC₅₀值，和相应的95%置信区间。

海水酸化96 h急性毒性试验中，pH值8.0、7.7 7.3和6.5条件下，日本虎斑猛水蚤的死亡率分别为4.2%、0.8%、5.0%和2.5%。相关分析结果表明，死亡率和pH值之间没有显著相关性(Person R=0.34，P=0.873>0.05)。one-way ANOVA分析结果表明4个pH值梯度对日本虎斑猛水蚤的死亡率均属于同一齐次性子集，无显著差异(P>0.05)。因此在96 h急性试验中，单一的海水酸化对日本虎斑猛水蚤的急性毒性效应影响并不显著。

不同pH值条件下，铜对日本虎斑猛水蚤的96 h急性毒性试验结果见表 2，图 1。在各pH值水平，死亡率都随铜浓度的升高呈上升趋势；96 h LC₅₀随着海水酸度的增加而呈降低趋势，依次为pH值8.0>7.7>7.3>6.5。对海水pH值和96h LC₅₀进行相关分析，两者之间具有显著的相关性(Kendall′s R=1.00，P=0.04＜0.05)。two-way ANOVA分析表明，不同 pH 值对铜急性毒性有显著影响(P=0.002＜0.05)。由图 1所示：在对照组和0.25 mg/L浓度组,最高死亡率都出现在pH值=7.3,随着铜浓度升高，在0.5、1、2和3.5 mg/L浓度组，最高死亡率都出现在pH值=6.5。尤其是在3.5 mg/L浓度组，随着pH值的下降，死亡率呈现阶梯型的上升趋势。因此，随海水酸化程度增高，铜对日本虎斑猛水蚤的急性毒性效应显著增强。

图 1 不同铜浓度、不同pH值条件下日本虎斑猛水蚤的致死率 Fig.1 The mortality of T. japonicus exposed to different Cu concentrations at different pH levels

图选项

不同pH条件下，镉对日本虎斑猛水蚤的急性毒性试验结果见表 3，图 2。镉对日本虎斑猛水蚤的96h LC₅₀随着海水酸度的增加依次下降。但two-way ANOVA分析表明，不同海水pH值条件下镉对日本虎斑猛水蚤的死亡率无显著差异(P=0.109＞0.05)。且由图 2所示，Cd各浓度组间，pH值对死亡率的影响没有呈现规律性的变化。因此，尽管海水酸化使镉对日本虎斑猛水蚤的96h LC₅₀呈下降趋势，但实验组间死亡率未呈现规律性变化，差异不显著。

图 2 不同镉浓度、不同pH值条件下日本虎斑猛水蚤的致死率 Fig.2 The mortality of T. japonicus exposed to different Cd concentrations at different pH levels

图选项

本研究结果显示，目前预测的未来300年海洋酸化程度的短期暴露本身对日本虎斑猛水蚤存活影响不大。Pascal等报道了海洋酸化对两种猛水蚤Schizopera knabeni 和Amphiascoides atopus的96h急性毒性试验，这两个种类的LC₁₀分别为pH值6.06和pH值6.41，LC₅₀更分别低至pH值5.00和5.75^[6]。张达娟等比较了二氧化碳酸化和盐酸酸化对7种桡足类的急性毒性，其中日本虎斑猛水蚤对酸化的耐受性明显高于其他营浮游生活的种类，其24 h和48 h LC₅₀分别为5.85和5.93，认为桡足类对海水酸化的耐受性具有一定的种类特异性^[11]。日本虎斑猛水蚤多生活于高潮带水洼，其生境受季节、昼夜和潮汐影响环境因子波动极大，抵御环境变化能力较强，0.4—0.7个单位的pH值下降对其成体存活的影响较小，对酸化短期胁迫表现出了较强的耐性。而一些生境长期稳定，运动能力较弱的猛水蚤则对海水酸化表现出较弱的耐性^[12]，因此来自不同生境类型的生物对酸化的响应机制可能不同，不同类群和种类的生物对酸化胁迫的耐性也可能表现出差异，不同暴露时间对实验结果也具有一定程度的影响，在综合评价海洋酸化对生物的影响时应充分考虑这一点。

重金属对桡足类的急性毒性效应一般以半致死浓度LC₅₀作为效应终端，暴露时间相同情况下LC₅₀越小，说明该重金属毒性越强。本研究实验结果表明铜对日本虎斑猛水蚤的急性毒性效应大于镉，pH值8.0条件下，铜的96h LC₅₀为1.98 mg/L，镉的96h LC₅₀为7.63 mg/L，分别在历史报道铜和镉对该种的96h LC₅₀结果范围之内^[13]。随着海水pH值降低，铜和镉对日本虎斑猛水蚤的96h LC₅₀都呈下降趋势，根据美国国家科学院与工程院NAS /NAE应用金属对受试动物的96h LC₅₀浓度乘以0. 01的应用系数获得海水环境安全浓度标准的方法^[14],本研究所获得的铜和镉的安全浓度阈值及其见表 4，与我国环保部制定的海水水质标准(GB3097—1997)比较发现，在pH值为8.0时，铜的安全浓度高于海水水质一类标准，在pH值为7.7和7.3时，铜的安全浓度就很接近二类水质标准，在pH值为6.5条件下，铜的安全浓度高于海水水质二类标准，低于一类标准。对于镉，在pH值8.0、7.7、7.3和6.5条件下，其安全浓度都远远高于海水水质一类标准。据2010年国家环境部中国环境状况公报报告的近岸海域水质类别调查结果，我国近海海域二类和二类水质占接近70%，因此，随着海洋酸化程度加剧，重金属铜将更加成为威胁我国近岸海水水体安全的污染物。

本实验结果表明海水酸化对铜和镉毒性的影响效应有所差异。铜虽然是生命活动必须的微量元素，但其浓度过高也会引起生物中毒，而镉是一种生物非必需的毒副作用很强的有毒元素^[15]。海洋酸化造成海水碳酸盐体系的变化，主要表现在OH^-和CO^2-₃浓度下降和H⁺浓度的升高^[16]。海洋酸化现象本身即使没有引起海洋生物的急性致死，但却能造成海洋生物生理、形态和行为特征的改变，逼迫其消耗额外的能量对抗这种环境胁迫，降低其对重金属毒害作用的抵御能力^[3]。此外海水酸化对不同重金属毒性影响的机制有所差异。Cd²⁺在海洋中常形成氯复合物，而Cl^-对pH 的变化不敏感，Cu²⁺在海洋中常形成碳酸盐复合物，对海洋酸化敏感，随pH值下降释放更多的游离Cu^2-，游离Cu^2-的毒性要远远高于复合物形态，因此在近岸，海洋酸化可能将沉积物中大量的Cu²⁺释放于间隙水和上层水体，成为生物可利用状态，加剧铜污染的程度；另一方面，急性毒性试验过程中一般不投饵，重金属需通过体壁转移进入体内才表现出毒性。海洋酸化造成的H⁺浓度的升高能与重金属离子竞争吸附位点从而减少重金属的吸收，从而降低重金属的毒性效应^[6]。这些过程的相互作用可能是导致本研究海水酸化显著加剧铜的急性毒性效应，而对镉的急性毒性效应存在一定的影响趋势，但不显著的原因。

本论文仅涉及二氧化碳引起的海水酸化及其与重金属联合作用对日本虎斑猛水蚤的急性毒性试验结果，未来工作中应进一步探索海洋酸化联合重金属等环境胁迫对其生理、生化和遗传的影响，并开展亚慢性和多世代尺度的研究进一步探索对生殖、发育的影响及其生物适应性。