施氮对森林生态系统AM真菌群落组成及多样性的影响

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赵爱花, 刘蕾, 付伟, 武慧, 陈保冬

ZHAO Aihua, LIU Lei, FU Wei, WU Hui, CHEN Baodong

Can understory nitrogen addition overestimate the effects of nitrogen deposition on arbuscular mycorrhizal fungal community?

生态学报. 2020, 40(21): 7576-7587

Acta Ecologica Sinica. 2020, 40(21): 7576-7587

http://dx.doi.org/10.5846/stxb202003120515

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收稿日期: 2020-03-12

修订日期: 2020-06-01

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赵爱花, 刘蕾, 付伟, 武慧, 陈保冬. 施氮对森林生态系统AM真菌群落组成及多样性的影响. 生态学报, 2020, 40(21): 7576-7587.

Zhao A H, Liu L, Fu W, Wu H, Chen B D. Can understory nitrogen addition overestimate the effects of nitrogen deposition on arbuscular mycorrhizal fungal community?. Acta Ecologica Sinica, 2020, 40(21): 7576-7587.

施氮对森林生态系统AM真菌群落组成及多样性的影响

赵爱花^1,2 , 刘蕾^1,3 , 付伟^1,2 , 武慧^1,2 , 陈保冬^1,2

1. 中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室, 北京 100085;
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 南京信息工程大学生态研究院, 江苏省农业气象重点实验室, 南京 210044

收稿日期: 2020-03-12; 修订日期: 2020-06-01

基金项目: 国家自然科学基金项目（41877050，31300446）

摘要: 丛枝菌根（AM）真菌能够和绝大多数陆生植物形成互惠共生体，具有重要的生态功能。在氮（N）沉降日益严重的背景下，越来越多的土壤生态学家开始关注N沉降对AM真菌群落的影响，然而已有研究大多数集中在草地生态系统，对森林生态系统的关注相对较少，而在森林生态系统开展的模拟研究又多采用林下施N的方式，忽略了冠层发生的一系列生态过程，可能无法准确反映真实情形。依托鸡公山野外控制试验平台，采用高通量测序技术就不同施N方式（林下vs林冠）及速率对AM真菌alpha多样性和群落组成的影响进行了连续4 a的监测。试验综合考虑植被、坡向和坡度等因素，采用完全随机区组设计，包括4个区组（重复），每个区组随机设置5个样方，对应5个不同处理：对照（CK）、林冠施N 25 kg hm^-2 a^-1（CN25）和50 kg hm^-2 a^-1（CN50）、林下施N 25 kg hm^-2 a^-1（UN25）和50 kg hm^-2 a^-1（UN50）。结果发现，在目前的N素添加水平和时间尺度上，施N方式和施N速率对AM真菌的alpha多样性都没有显著影响，二者之间也无交互作用。然而，经过一年的试验处理，施N方式对AM真菌群落组成产生了轻微的影响，而施N速率有极显著的影响，且二者之间存在显著交互作用。当施N速率为25 kg hm^-2 a^-1时，林冠施N和对照相比差异不显著，而林下施N处理AM真菌群落组成与对照相比差异极显著，与林冠施N相比，差异也极显著；当施N速率为50 kg hm^-2 a^-1时，林冠施N与对照处理群落组成有略微差异（P=0.080），林下施N与林冠施N及对照处理相比AM真菌群落组成均没有显著变化。在接下来的三年中，施N方式和施N速率对AM真菌的群落组成都没有显著影响，二者之间也无显著交互作用。这说明在特定的施N速率和处理时间下，林下施N可能会高估自然N沉降对AM真菌群落组成的影响。随着处理时间的延长，不同处理下AM真菌群落有趋同的趋势，可能是因为AM真菌群落对N沉降产生了适应性。本研究评估了施N方式对森林生态系统AM真菌群落组成与结构的影响，在未来的研究中需要设定更多的N素梯度和更长的时间跨度，才能够更全面的认识N沉降的生态效应。

关键词: 氮沉降林冠林下速率菌根真菌

Can understory nitrogen addition overestimate the effects of nitrogen deposition on arbuscular mycorrhizal fungal community?

ZHAO Aihua^1,2 , LIU Lei^1,3 , FU Wei^1,2 , WU Hui^1,2 , CHEN Baodong^1,2

1. State Key Laboratory of Urban and Regional Ecology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Institute of Ecology, Jiangsu Key Laboratory of Agricultural Meteorology, Nanjing University of Information Science and Technology, Nanjing 210044, China

Abstract: Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi can form symbiosis with most terrestrial plants and provide important ecological services. Under the intensified nitrogen (N) deposition, more and more soil ecologists pay attention to the impacts of N deposition on AM fungal community. However, most relevant studies were carried out in grassland ecosystems, while studies on forest ecosystem were very limited. Moreover, most simulation studies in forest ecosystems applied N to the forest floor, ignoring the canopy processes, may not accurately reflect the natural situations. We conducted a field experiment on the influence of N addition mode (understory vs canopy) and rate on AM fungi in a mixed deciduous forest of China. The experiment had a fully randomized block design with four blocks (replicates) and each block included five plots. Within each block, each plot was randomly assigned with one of the five treatments:ambient (CK), canopy addition of N at 25 (CN25) or 50 kg hm^-2 a^-1 (CN50), understory addition of N at 25 (UN25) or 50 kg hm^-2 a^-1 (UN50). AM fungal alpha diversity indices and community composition were determined by high-throughput sequencing. The results showed that under the experimental conditions, AM fungal richness and Shannon diversity indices were not significantly altered by N addition mode, rate or their interactions. However, after one year of experimental treatment, N application mode showed a marginal effect on AM fungal community composition, while N application rate showed an extremely significant effect, and the treatment interaction was also significant. At N addition rate of 25 kg hm^-2 a^-1, the difference between canopy N addition and control was not significant, while the AM fungal community composition was significantly changed by understory N addition. At N application rate of 50 kg hm^-2.a^-1, canopy addition of N slightly altered AM fungal community composition, but understory of N application did not change AM fungal community composition. In the next three years, N addition mode, rate or their interactions all showed no significant effects on AM fungal community composition. Overall, the results indicated that understory application of N may overestimate the effect of N deposition on the AM fungal community under natural conditions at certain N application rate and time scale. AM fungal communities under different treatments tend to converge over time, suggesting that AM fungal community may have adapted to N deposition over time. This study evaluated the effects of different N application modes on AM fungal community in forest ecosystem. We could have a more comprehensive understanding of the ecological impacts of N deposition by considering broader N gradients and longer observation period in future research.

Key Words: nitrogen deposition canopy understory rate mycorrhizal fungi

自工业革命以来, 大量化石燃料的燃烧, 以及农业和工业生产活动中氮(N)素消耗大量增加, 加速了全球大气N沉降并导致一系列生态环境问题。据估计, 1995年全球平均N沉降速率大约是1860年的3倍, 而2050全球平均N沉降速率将增加到1860年的6倍^[1]。我国陆地生态系统N沉降速率已达21.1 kg hm^-2 a^-1^[2], 其中, 湿沉降速率已经由20纪90年代的11.11 kg hm^-2 a^-1增加到13.87 kg hm^-2 a^-1^[3], 增长了近25%, 在今后几十年中我国N沉降的形势将更加严峻^[2]。N沉降增加一方面可以提高受N限制的生态系统的生产力^[4], 另一方面过多的N素供应也会给生态系统带来诸多负面影响, 如土壤酸化^[5]、植物物种多样性丧失^[6]、水体富营养化^[7]等。同时, N沉降还可以通过改变土壤环境(如N的有效性、土壤酸化等)直接影响土壤微生物多样性^[8-9], 或通过地上植被的生理生态响应间接作用于土壤微生物^[10]。

丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza, AM)真菌是一类在陆地生态系统中广泛存在的土壤真菌, 能与绝大多数陆地植物形成互惠共生体系, 具有许多重要的生态功能, 如帮助植物获取N、P等矿质养分和水分, 增强植物对生物和非生物胁迫的适应能力^[11], 改变植物群落的组成、多样性, 还能影响生态系统的生产力和结构功能稳定性^[12-13]。在陆地生态系统N素循环过程中, AM真菌除了能够吸收、转运N素以外, 在N素生物固定、硝化、反硝化以及N素淋洗过程中均具有潜在重要作用^[14-15]。AM真菌一方面通过改善植物磷(P)营养, 提高豆科植物的固N能力^[14], 另一方面可能通过影响固N微生物功能基因的表达来调控N素的生物固定^[16]。AM真菌还可能通过与氨氧化微生物竞争底物^[17], 改变氨氧化微生物的群落组成^[18]及植物根系营养生理^[19]调控硝化过程, 通过调控反硝化细菌的数量^[20]及相关功能基因的表达进而影响反硝化过程^[16]。此外, AM真菌还能够通过改善土壤结构^[21], 促进宿主植物对无机N的吸收等多种途径减少因淋洗而造成的土壤N素损失。

鉴于N沉降形势的严峻性和AM真菌重要的生态功能, 越来越多的土壤生态学家开始关注N沉降对AM真菌的影响并开展了试验研究。目前, 已有相关研究多采用N素添加的方式模拟N沉降, 受到具体试验条件的影响, 研究结果不甚一致：N沉降对AM真菌多样性可能有积极作用^[22], 没有显著影响^[23], 或者具有消极作用^[24]；类似地, 对于AM真菌群落组成而言, 有的研究显示N沉降有显著影响^[25-28], 而另外一些研究则显示无显著影响^[29-30]。影响N沉降生态效应的因素有很多, 如施N速率^[22]、N素形态^[31]、试验方法^[29]、试验周期^[32]等。此外, 还可能受到环境中N的背景值及生态系统类型的影响^[33]。因此, 客观认识和评价N沉降对AM真菌的影响, 还需要开展更为系统的研究工作。

总体上, 目前N沉降对AM真菌多样性和群落组成影响的研究多集中在草地生态系统, 对森林生态系统的研究相对匮乏。在森林生态系统中开展的有限研究中, 施N方式又多为林下施N^{[24-25, 29]}, 这种方式忽略了冠层发生的一系列生态过程, 如N的吸收、固定、挥发、转化等^[34-38], 而这些过程都会影响到达地面的N的形态和数量^[39], 因此林下施N可能无法准确反映自然条件下N沉降对AM真菌多样性和群落组成的影响。Huang等^[40]研究发现, 林冠施N对土壤微生物生物量和群落组成的影响小于林下施N, 那么对AM真菌来说是否也是类似的情况, 目前尚无相关报道。基于此, 我们依托鸡公山林冠模拟氮沉降野外试验平台, 通过连续4 a的样品采集和分析, 尝试回答这个问题。我们提出的研究假设是：林下施N模拟N沉降会高估自然N沉降对森林土壤AM真菌多样性和群落组成的影响。

1 材料与方法 1.1 研究区概况

鸡公山林冠模拟N沉降野外试验平台于2013年建于河南省信阳市以南38 km的鸡公山国家级自然保护区(31°46′—31°52′N, 114°01′—114°06′E)的原生林中。研究区由于地处北亚热带边缘秦岭山系西端的浅山区, 受东亚季风气候的影响, 具有典型的北亚热带向暖温带过渡的季风气候和山地气候特征, 四季分明。研究区内土壤以黄棕壤、黄褐土为主, pH值在5.0到6.0之间。植被类型为落叶阔叶混交林, 林龄约45 a。优势乔木树种为麻栎(Quercus acutissima Carruth.)、栓皮栎(Quercus variabilis Bl.)和枫香(Liquidambar formosana Hance), 林下树种和草本丰富。

根据1951—2011年间的气象数据, 鸡公山地区年平均气温为15.2℃, 年降雨量为1119 mm, 其中80%的降水集中在4到10月份, 年均空气湿度为79%^[41]。N沉降的背景值大约为19.6 kg hm^-2 a^-1, 其中NH₄⁺/NO₃^-比值接近于1^[41]。

1.2 实验设计

实验采用完全随机区组设计, 包括4个区组(相当于4个试验重复), 每个区组随机设置5个半径为17 m的样方, 对应5个试验处理：对照(CK)、林冠施N 25 kg hm^-2 a^-1(CN25)或50 kg hm^-2 a^-1(CN50)、林下施N 25 kg hm^-2 a^-1(UN25)或50 kg hm^-2 a^-1(UN50)。为防止处理间的干扰, 各样方之间留有至少20 m的缓冲带, 每个缓冲带中间都加装深度为1 m的PVC隔离板。

N添加在每年4到10月份进行, 每月一次, 一年7次。添加的N素形态为NH₄NO₃溶液。每次施N时, 添加的NH₄NO₃溶液相当于3 mm的降水量, 一年的添加量相当于21 mm的降水量, 小于该地区年均降雨量的2%, 因此水分的影响可以忽略不计^[41]。林冠施N和林下施N都是由位于相应样方中心的自动喷洒装置来实现的。林冠喷洒装置高35 m(冠层以上约5 m), 林下喷洒装置距离地面的高度为1.5 m。该装置顶端安装有一套摇臂喷头, 有供水管道与样地外的蓄水池连接, 利用变频调速恒压喷灌设备提供压力, 驱动摇臂喷头360°旋转, 以保证喷洒的均匀性和精确性。塔基处供水管道安装有水量计, 可精准控制每次处理的用水量。关于装置的细节、工作方式和效率参考Zhang等^[41]。

1.3 样品采集与分析

从2013年到2016年, 每年最后一次N添加处理完成之后, 进行土壤样品采集。采样时间为11月中下旬到12月初, 具体时间视当地天气情况而定。土壤样品的采集和分析, 以及生物信息学分析均参考Zhao等^[32]。为了尽可能减少采样位置的影响, 在各样方核心区20 m×20 m范围内选取5棵树作为目标树。在距每棵目标树1—2 m范围内, 取2钻土(直径3 cm, 深度10 cm), 每个样方共10钻土, 制备成一个混合土样, 用冰袋运送到实验室。混合土样过2 mm筛之后分成两部分, 一部分冷冻干燥后储存于-80℃冰箱, 用于土壤微生物总DNA的提取；另一部分自然风干, 用于测定土壤pH、有效磷(available phosphorus, AP)等基本理化性质。

土壤有效磷用0.5 mol/L的NaHCO₃提取, 钼蓝比色法测定^[42]；土壤pH值采用水土比2.5:1, PB-10 pH计(Sartorius, Göttingen, Germany)测定；铵态N、硝态N首先用2 mol/L的KCl浸提(水土比为5:1), 然后用连续流动分析仪进行测定(SAN++, Skakar, Breda, Holland)；铵态氮、硝态氮含量之和作为有效N含量(available nitrogen, AN)；有效N与有效P之比即为N/P比。

采用Power-Soil RDNA提取试剂盒(MO BIO Laboratories, San Diego, CA, United States), 按照说明书提取土壤DNA。DNA样品用灭菌超纯水稀释5倍, 然后进行巢式PCR扩增。扩增的引物分别为AML1/AML2^[43]和AMV4.5NF/AMDGR^[44], 扩增体系及程序设置与Zhao等^[32]相同：第一次PCR反应总体积为25 μL, 其中含有2.5 μL 10 × Ex-Taq缓冲液(Mg²⁺ Plus)、2.0 μL dNTP混合物、0.25 μL Ex-Taq(5u/mL)(Takara, 大连, 中国)、1.0 μL(10 mg/mL)BSA(TaKaRa, 大连, 中国), 双端引物各0.5 μL(10 μmol/L), 17.25 μL无菌水和1.0 μL DNA模板。PCR扩增条件如下：94℃预变性3 min；94℃ 45 s, 51℃ 40 s, 72℃ 1 min, 扩增35个循环；然后72℃延伸10 min, 16℃冷却2分钟。第一轮的PCR产物进行10倍稀释, 作为第二轮的模板。第二轮扩增体系与第一轮相同, 扩增条件如下：94℃预变性3 min；94℃ 40 s, 58℃ 1 min, 72℃ 1 min, 扩增35个循环；然后72℃延伸10 min, 4℃冷却2 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后, 送上海瀚宇科技有限公司切胶回收、纯化、建库及测序(Illumina Miseq PE300测序平台)。

最初的数据质量控制和序列拼接由上海瀚宇生物科技有限公司完成。原始测序数据用Trimmomatic v 0.32^[45]进行质控, 主要步骤如下：(1)删除带有N碱基的reads；(2)删除低质量的reads Q value < 20)；(3)删除过短的reads(< 50 bp)及其配对reads。用Mothur v. 1.32.1 ^[46]进行序列拼接, 允许引物有1个碱基的错配。删除拼接同聚物长度>8, 序列总长 < 200 bp的序列。嵌合体的过滤由Chimera.uchime v.4.2^[47]完成。使用Usearch v.9.0.2132_i86linux32^[48]在97%的相似性水平划分OTU (operational taxonomic unit, 操作分类单元)。删除序列数 < 5条的OTUs。其余OTUs的代表序列和NCBI GenBank数据库及MaarjAM数据库进行比对, 满足下列条件的OTUs用于后续分析：Identifications >97% similarity, >90% coverage及>200 BLAST score value, 不满足条件者被舍去。为了进一步确认分类信息的可靠性, 我们把OTUs的代表序列和在GenBank数据库中比对到的序列放在一起, 采用MEGA v5^[49], 依据Kimura 2-parameter模型构建了Neighbor-Joining系统发育树。除了bootstrap数目设为1000以外, 其余参数均采用默认值。

1.4 统计分析

所有的统计分析均采用R 3.3.2 (R Core Team, 2016)完成。采用中位数稀释法对每年的样品测序数据进行标准化^[50]。标准化后的OTU表格进行Hellinger转化, 作为分析AM真菌群落组成的数据, 也用来计算AM真菌群落的alpha多样性指数(丰富度S、香侬指数H、Pielou′s均匀度指数J和辛普森指数)。用“vegan”包^[51] “specnumber”函数计算丰富度。香侬指数和辛普森指数的计算采用“vegan”包“diversity”函数完成。Pielou′s均匀度指数J=H/log(S)。采用“aov”函数进行双因素方差分析, 评估施N方式和施N速率对土壤因子和AM真菌alpha多样性指数的影响, 分析之前用“stats”包“shapiro.test”函数进行正态性检验, 不符合要求的数据进行1次或2次乘方、开方、log或Box-Cox转化, 若转化后仍不满足正态分布, 则采用“friedman.test”函数进行Friedman检验。

施N方式和施N速率对AM真菌群落组成的影响及不同处理间的两两比较, 均采用“vegan”包“adonis2”函数进行PERMANOVA分析, 距离矩阵为“Bray-Curtis”距离, 置换次数设为9999次。为了实现数据的可视化, 使用“vegan”包“metaMDS”函数进行NMDS分析并作图。

2 结果 2.1 施氮对土壤理化性质的影响

在2013年, 施N速率对土壤pH值有显著影响(P=0.024)。两个施N速率与对照相比, pH值均显著降低, 但是两个施N速率之间没有显著差异。施N方式对土壤pH没有显著影响(P=0.826), 而且施N方式和施N速率之间也没有显著交互作用(P=0.929)(表 1)。对于其他土壤性质而言, 施N方式、施N速率的影响及二者交互作用均不显著(表 1)。在2014年, 施N方式和施N速率对所有土壤性质参数均无显著影响(表 1)。在2015年, 施N方式显著影响了土壤pH值(P=0.021)(表 1), 林下施N土壤pH值(4.21)显著低于林冠施N处理(4.35)。对于其他土壤性质而言, 施N方式、施N速率的影响以及二者交互作用均不显著(表 1)。2016年和2013年结果基本相同。

表 1 施N方式和施N速率对土壤性质的影响 Table 1 The influence of N treatment approach and rate on soil properties over years

	对照	林冠施氮 25 kg hm^-2 a^-1	林冠施氮 50 kg hm^-2 a^-1	林下施氮 25 kg hm^-2 a^-1	林下施氮 50 kg hm^-2 a^-1	氮添加方式		氮添加速率		交互作用
	CK	CN25	CN50	UN25	UN50	NTM (F, P)		NDR (F, P)		NTM×NDR (F, P)
2013年
速效磷 Available phosphorus (mg/kg)	44.11±6.84 a	29.83±5.01 a	34.90±10.85a	37.50±10.37a	41.65±3.70a	0.508	0.487	0.801	0.467	0.129	0.880
pH	4.57±0.12 a	4.28±0.05 a	4.29±0.09a	4.28±0.04a	4.35±0.12a	0.050	0.826	4.840	0.024^*	0.074	0.929
速效氮 Available nitrogen (mg/kg)	24.76±2.23a	18.24±2.79a	26.37±2.40a	28.16±4.84a	27.93±5.61a	1.526	0.236	0.550	0.588	0.988	0.395
N/P比 N/P ratio	0.63±0.16a	0.68±0.15a	1.11±0.46a	0.53±0.04a	0.69±0.13a	0.333	0.573	0.506	0.613	0.142	0.869
2014年
速效磷 Available phosphorus (mg/kg)	22.44±0.63	26.06±3.28	27.57±2.42	26.63±2.14	26.31±3.37	Friedman chi-squared=4.608, P=0.466
pH	4.35±0.15a	4.15±0.10a	4.25±0.10a	4.12±0.01a	4.23±0.03a	0.051	0.825	3.473	0.058	0.017	0.983
速效氮 Available nitrogen (mg/kg)	13.21±2.11ab	13.01±1.55b	17.14±1.19a	13.88±1.63ab	12.37±1.01b	1.721	0.209	0.950	0.409	3.146	0.072
N/P比 N/P ratio	0.59±0.15a	0.55±0.13a	0.64±0.07a	0.53±0.07a	0.48±0.04a	0.686	0.423	0.128	0.881	0.426	0.662
2015年
速效磷 Available phosphorus (mg/kg)	27.40±6.56a	35.72±2.63a	32.15±3.12a	44.29±2.45a	44.77±7.66a	2.593	0.128	3.279	0.066	0.719	0.503
pH	4.35±0.11ab	4.27±0.08ab	4.43±0.10a	4.14±0.03b	4.18±0.03b	6.933	0.021^*	2.635	0.109	1.801	0.204
速效氮 Available nitrogen (mg/kg)	8.24±2.08a	11.88±2.28a	8.52±1.56a	9.15±2.52a	10.66±2.43a	0.023	0.881	0.463	0.638	0.500	0.616
N/P比 N/P ratio	0.31±0.05a	0.33±0.06a	0.29±0.07a	0.20±0.05a	0.26±0.06a	1.437	0.249	0.441	0.651	0.787	0.473
2016年
速效磷 Available phosphorus (mg/kg)	11.54±1.88a	8.94±0.69a	16.04±3.28a	12.73±2.87a	17.4±6.58a	0.098	0.759	0.900	0.431	0.313	0.737
pH	4.41±0.04a	4.31±0.06ab	4.28±0.07ab	4.17±0.05b	4.31±0.05ab	0.771	0.396	4.750	0.028^*	1.672	0.226
速效氮 Available nitrogen (mg/kg)	9.63±1.00a	9.81±1.42a	11.25±1.60a	8.66±2.01a	12.59±1.53a	0.002	0.961	1.802	0.199	0.335	0.721
N/P比 N/P ratio	0.90±0.13a	1.09±0.10a	0.75±0.12a	0.79±0.22a	1.03±0.30a	0.002	0.966	0.035	0.966	1.140	0.350
表中数据为平均值±标准误(n=4); *双因素方差分析显著(P < 0.05);多重比较方法为Duncan检验; 不符合方差分析条件的, 进行Friedman检验

表选项

2.2 高通量测序基本信息及AM真菌OTUs分类情况

对连续4 a共80个土壤DNA样品进行高通量测序, 初步得到761939条序列, 划分为661个OTUs。经过严格筛选以后, 最终确认AM真菌的OTUs为181个, 共604890条序列, 隶属于1门, 1纲, 4目, 8科, 9属, 50VT(virtual taxa)。其中, 绝大多数的OTUs和序列属于Glomus属, 其次为Acaulospora属(图 1)。OTUs的代表序列已上传到Genbank数据库(MN559107-MN559287)。序列数过少的3个样品(2014年区组3的CN50处理33条；2015年区组1的UN50处理194条；2016年区组4的UN25处理60条), 在后续的分析中没有被包括进来, 其余样品的序列数均多于1957条。

图 1 所有土壤样品AM真菌序列和操作分类单元的分布情况 Fig. 1 The proportional distributions of AM fungal sequences and derived AM fungal OTUs detected in all soil samples

图选项

2.3 施氮对AM真菌alpha多样性指数和群落组成的影响

从2013年到2016年, 施N方式、施N速率及二者之间的交互作用对AM真菌alpha多样性指数都没有显著影响(表 2)。随着处理时间的延长, 不同处理下AM真菌的alpha多样性指数有趋同的趋势(表 2)。

表 2 不同年份下施N方式和施N速率对AM真菌alpha多样性指数的影响 Table 2 The effects of N addition mode and rate on AM fungal alpha diversity indices

	对照	林冠施氮 25 kg hm^-2 a^-1	林冠施氮 50 kg hm^-2 a^-1	林下施氮 25 kg hm^-2 a^-1	林下施氮 50 kg hm^-2 a^-1	氮添加方式		氮添加速率		交互作用
	CK	CN25	CN50	UN25	UN50	NTM (F, P)		NDR (F, P)		NTM×NDR (F, P)
2013年
丰富度 Richness	56.75±5.27a	56.50±6.06a	56.25±10.89a	54.25±6.22a	33.00±6.87b	2.329	0.148	1.895	0.185	1.767	0.205
香侬指数 Shannon index	3.31±0.16ab	3.40±0.19a	3.30±0.29ab	3.39±0.14a	2.53±0.42b	2.036	0.174	1.708	0.215	1.657	0.224
Pielou′s均匀度指数 Evenness	0.82±0.03ab	0.84±0.02ab	0.83±0.03ab	0.85±0.01a	0.72±0.08b	0.912	0.355	1.919	0.181	1.098	0.359
辛普森指数 Simpson index	0.95±0.00a	0.95±0.01a	0.94±0.02a	0.95±0.01a	0.92±0.02	0.444	0.518	0.985	0.402	0.469	0.637
2014年
丰富度 Richness	52.25±5.89ab	57.25±11.20ab	68.33±15.24a	60.75±6.82ab	38.25±7.79b	1.452	0.248	0.503	0.615	2.122	0.157
香侬指数 Shannon index	3.30±0.15a	3.29±0.28a	3.53±0.37a	3.46±0.13a	2.73±0.36a	0.957	0.340	0.499	0.618	1.717	0.215
Pielou′s均匀度指数 Evenness	0.84±0.02a	0.82±0.04a	0.84±0.04a	0.85±0.01a	0.81±0.01a	0.000	0.989	0.103	0.903	0.340	0.718
辛普森指数 Simpson index	0.95±0.01	0.93±0.02	0.95±0.02	0.95±0.00	0.93±0.00	Friedman chi-squared=1.364, P=0.928
2015年
丰富度 Richness	47.50±18.32a	42.75±11.18a	46.50±7.42a	56.00±7.39a	35.33±7.22a	0.052	0.822	0.364	0.701	0.568	0.579
香侬指数 Shannon index	2.87±0.59a	2.93±0.37a	3.04±0.25a	3.39±0.19a	2.88±0.21a	0.217	0.649	0.303	0.743	0.382	0.690
Pielou′s均匀度指数 Evenness	0.79±0.06	0.80±0.05	0.80±0.04	0.85±0.02	0.82±0.01	Friedman chi-squared=6.212, P=0.286
辛普森指数 Simpson index	0.87±0.07	0.91±0.03	0.91±0.03	0.95±0.01	0.92±0.01	Friedman chi-squared=5.215, P=0.390
2016年
丰富度 Richness	40.50±8.84a	48.00±7.38a	43.00±13.69a	46.67±12.12a	41.50±6.65a	0.078	0.784	0.764	0.484	0.158	0.855
香侬指数 Shannon index	3.00±0.29a	3.21±0.16a	2.92±0.42a	3.14±0.35a	3.00±0.20a	0.024	0.879	0.934	0.416	0.296	0.749
Pielou′s均匀度指数 Evenness	0.83±0.02	0.84±0.01	0.81±0.03	0.83±0.03	0.81±0.02	Friedman chi-squared=7.121, P=0.212
辛普森指数 Simpson index	0.93±0.02a	0.94±0.01a	0.90±0.04a	0.93±0.03a	0.93±0.02a	0.037	0.850	0.693	0.517	0.361	0.703
表中数据为平均值±标准误(n=4);双因素方差分析, 显著作用(P < 0.05)加粗显示。多重比较方法为Duncan检验; 不符合方差分析条件的, 进行Friedman检验

表选项

在2013年, 施N方式对AM真菌群落组成有轻微影响(P=0.052), 而施N速率有极显著的影响(P=0.004), 且二者之间有显著交互作用(P=0.045)(表 3)：施N速率为25 kg hm^-2 a^-1时, 林冠施N(CN25)与对照差异不显著(P=0.115), 林下施N(UN25)与对照差异极显著(P=0.005), 且林冠施N(CN25)和林下施N(UN25)相比, 群落组成差异极显著(P=0.002)(表 4, 图 2)；当施N速率为50 kg hm^-2 a^-1时, 林冠施N(CN50)、林下施N(UN50)及对照三者之间均无显著差异(表 4, 图 2)。从2014年到2016年, 施N方式和施N速率对AM真菌群落组成都没有显著影响, 双因素交互作用也不显著(表 3, 图 2)。

表 3 不同年份施N方式和施N速率对AM真菌群落组成的影响 Table 3 The effects of N addition mode and rate on AM fungal community composition over years

			2013年		2014年		2015年		2016年
			F	P	F	P	F	P	F	P
群落组成	NTM	1	1.842	0.052	0.700	0.697	0.681	0.703	0.435	0.897
Community	NDR	2	2.203	0.004^*	0.909	0.553	1.730	0.060	1.366	0.178
composition	NTM×NDR	2	1.645	0.045^*	0.678	0.817	1.057	0.379	0.465	0.956
采用双因素PERMANOVA分析, *表示显著作用, 显著水平为P < 0.05

表选项

表 4 2013年不同处理间AM真菌群落组成差异 Table 4 The dissimilarity of AM fungal community composition among different treatments in 2013

	对照 CK	林冠施氮 25 kg hm^-2 a^-1 CN25	林冠施氮 50 kg hm^-2 a^-1 CN50	林下施氮 25 kg hm^-2 a^-1 UN25
林冠施氮25 kg hm^-2 a^-1 CN25	0.115	-	-	-
林冠施氮50 kg hm^-2 a^-1 CN50	0.080	0.061	-	-
林下施氮25 kg hm^-2 a^-1 UN25	0.005^*	0.002^*	0.078	-
林下施氮50 kg hm^-2 a^-1 UN50	0.480	0.159	0.366	0.182
采用PERMANOVA分析, *表示显著作用, 显著水平为P < 0.05

表选项

图 2 不同处理下AM真菌群落组成 Fig. 2 The variation of AM fungal community composition among different treatments 不同颜色的椭圆代表不同处理下95%的置信区间; CK:对照；CN25:林冠施 N 25 kg hm^-2 a^-1；CN50:林冠施 N 50 kg hm^-2 a^-1；UN25:林下施 N 25 kg hm^-2 a^-1；UN50:林下施 N 50 kg hm^-2 a^-1

图选项

2.4 AM真菌alpha多样性指数和群落组成的变化与土壤因子变化之间的关系

在目前的时间尺度下, AM真菌alpha多样性指数与土壤因子之间没有显著的相关性(表 5)。在2013年, AM真菌群落组成的变化与土壤pH呈显著正相关关系(表 6), 与其他土壤因子之间无显著相关关系, 而从2014年到2016年, 所有土壤因子与AM真菌群落组成之间的相关性均未达到显著水平(表 6)。

表 5 所有样品AM真菌alpha多样性指数与土壤因子之间的Pearson相关性分析 Table 5 Pearson correlation analysis between AM fungal alpha diversity indices and soil parameters of all samples

	丰富度 Richness			香侬指数 Shannon index			Pielou′s均匀度指数 Pielou′s evenness			辛普森指数 Simpson index
	df	r	P	df	r	P	df	r	P	df	r	P
速效磷 s/(mg/kg) Available phosphoru	73	-0.038	0.628	73	-0.055	0.682	72	-0.091	0.780	72	-0.091	0.780
pH	73	-0.137	0.880	73	-0.130	0.868	72	-0.092	0.781	72	-0.092	0.781
速效氮/(mg/kg) Available nitrogen	75	0.076	0.255	75	0.035	0.383	74	-0.042	0.642	74	-0.043	0.642
N/P比 N/P ratio	72	0.071	0.274	72	0.056	0.319	71	0.042	0.394	71	0.042	0.361

表选项

表 6 不同年份AM真菌群落组成与土壤因子之间的Mantel检验 Table 6 Mantel test between the changes in AM fungal community composition and the dissimilarity of soil factors over years

	2013年		2014年		2015年		2016年
	r	P	r	P	r	P	r	P
速效磷 Available phosphorus (mg/kg)	-0.223	0.987	0.160	0.051	-0.129	0.865	0.082	0.273
pH	0.223	0.050^*	0.183	0.107	-0.025	0.561	-0.011	0.513
速效氮 Available nitrogen (mg/kg)	0.041	0.378	0.029	0.369	-0.006	0.495	0.025	0.386
N/P比 N/P ratio	0.166	0.849	0.127	0.156	-0.003	0.490	-0.116	0.801
*表示显著作用, 显著水平为P < 0.05

表选项

3 讨论 3.1 氮沉降对土壤理化性质的影响

施N速率对土壤pH值的影响, 从2013年到2016年依次为显著(P=0.024)、轻微(P=0.058)、不显著(P=0.109)又到显著(P=0.028)(表 1)。据此我们推测, 土壤pH值对N沉降的响应可能存在短期“应激反应”, 中期“适应现象”和长期的“累积效应”。而N沉降能够降低土壤pH值, 早已被很多研究所证实^{[5, 28, 32]}, 可能的机制包括：(1)铵根离子(NH₄⁺)被植物根系吸收, 同时将H⁺释放到土壤中, 导致土壤酸化；(2)NH₄⁺经过硝化作用被转化为亚硝酸根离子, 进而转化为硝酸根离子的过程中释放出H⁺, 导致土壤酸化；(3)NH₄⁺置换碱基阳离子, 如Ca^2+, Mg²⁺, K⁺, Na⁺等, 金属阳离子的丢失会降低土壤对酸化的缓冲能力^[32]等。

之前的meta分析表明, 不论是在区域尺度上^[52], 还是在全球范围内^[53], 温带森林生态系统土壤pH值对N沉降的响应都十分敏感。对于我国森林生态系统来说, N沉降速率 < 30 kg hm^-2 a^-1也会显著降低土壤pH值^[52]。我们的研究也支持此观点, 因为在2013年和2016年, 低N处理(25 kg hm^-2 a^-1)与对照处理相比, pH值有显著下降。同时, 高N(50 kg hm^-2 a^-1)处理与对照相比, pH值也有显著下降, 但与低N处理(25 kg hm^-2 a^-1)相比, 并无显著差异, 这可能是由于本研究区域土壤pH背景值较低造成的。因为Tian等^[53] meta分析表明, 土壤pH值的背景值越低, 对N沉降的响应越不敏感。而本研究区域的初始pH值为弱酸性(5.0—6.0), 所以尽管施N速率增加一倍, 土壤pH值并没有很大的改变。

在2015年, 林下施N土壤pH值与林冠施N处理相比显著降低, 这与Huang等^[40]研究结果一致。这一现象说明在特定条件下, 林下施N会高估自然N沉降对土壤环境的影响。

3.2 氮沉降对AM真菌alpha多样性的影响

在目前的时间尺度下(4 a), 施N方式、施N速率对AM真菌物种alpha多样性指数都没有显著影响, 且二者也没有显著交互作用, 说明在目前的N素添加水平和时间尺度下, 林下施N并没有高估自然N沉降对AM真菌alpha多样性的影响。尽管施N以后土壤pH值有显著下降, 但是pH值的变化并没有对AM真菌alpha多样性造成影响。土壤pH值与AM真菌的alpha指数没有明显关系(表 5), 这与之前该试验平台的研究结果相符^[32]。此外, 之前的研究还发现, 土壤N/P比与AM真菌的丰富度和香侬指数关系密切^[32], 而在目前的时间尺度下, 施N方式和施N速率都没有明显改变土壤N/P比(表 1)。我们推测这可能是AM真菌alpha多样性对N沉降没有响应的原因之一。随着处理时间的延长, 几种试验处理下AM真菌alpha多样性有趋同的趋势(表 2), 这可能是森林生态系统土壤AM真菌对持续N素输入产生了适应, 也可能和N素添加浓度有关。例如, 刘永俊等^[54]研究发现, 低量施肥(30 g/m² (NH₄) ₂ HPO₄)对垂穗披碱草(Elymus nutans)根系中AM真菌物种丰富度没有显著影响, 而当施肥量达到为120 g/m²时, 施肥表现出极其显著的负面作用。对于土壤真菌来说, N素添加带来的影响还受到试验持续时间的影响^[33], 如Van Diepen等^[25]研究发现, 在美国北部森林中, 经过连续12年的N素添加, 区域A的AM真菌香侬指数有轻微的增加, 而区域C有轻微的下降。本研究时间跨度为4 a, 那么在更大的时间尺度上, N沉降是否会对AM真菌alpha多样性产生显著影响还值得进一步研究。

3.3 氮沉降对AM真菌群落组成的影响

在试验早期(2013年), 施N方式对AM真菌的群落组成有轻微影响, 而且受到施N速率的制约：当施N速率较低(25 kg hm^-2 a^-1)时, 林下施N对AM真菌群落组成的影响大于林冠施N, 支持了我们的假设；而当施N速率较高(50 kg hm^-2 a^-1)时, 两种施N方式都没有显著改变AM真菌群落组成, 与我们的假设不一致。这些结果说明在特定试验条件下, 林冠施N比林下施N能更好地反应自然N沉降对AM真菌群落组成的影响, 与Huang等^[40]的研究结论相似。冠层对N的截留会影响到达地面的N的数量^[39], 截留的百分比和生态系统类型、N沉降量及研究区域土壤特征有关, 少则10%以下, 多则70%—80%^[41]。在本试验样地内, 林冠喷洒的N被冠层截留大概占到一半左右^[55], 在短时间内, 林冠喷洒的N只有一半左右直接到达林下。所以林冠施N 25 kg hm^-2 a^-1(CN25), 大致相当于林下施N 12.5 kg hm^-2 a^-1, 林冠施N速率为50 kg hm^-2 a^-1(CN50), 则大概相当于林下施N 25 kg hm^-2 a^-1 (UN25), 如此施N方式的问题就基本简化为林下不同施N速率的问题。在Jiang等^[56]的研究中, 随着施N速率的增加, N添加对AM真菌群落组成的影响也越大。在本研究中, CN25、CN50、UN25与对照相比, P值依次为0.115, 0.080, 0.005, 基本上与Jiang等^[56]的研究结果相一致, 但是UN50与对照相比差异却不显著(P=0.480), 这有可能是因为试验处理重复次数较少, 组内的差异可能掩盖了组间差异(图 2), 所以在空间异质性较大的环境条件下进行控制试验时, 需要尽可能地增加重复次数。

从2014年到2016年, 不同试验处理之间AM真菌群落组成差异不显著, 可能有两方面的原因：(1)AM真菌对N素添加产生了一定程度的适应；(2)试验处理时间还不够长。Van Diepen等^[25]研究还发现, 经过连续12年的慢性N沉降, 枫木(Acer spp.)根中AM真菌的群落组成发生了显著的改变, 因此在更长的时间尺度上, 施N是否会对土壤AM真菌群落组成产生影响还需要后续研究。

4 结论

本试验条件下, 施氮对落叶阔叶混交林土壤AM真菌alpha多样性没有显著影响, 但在试验早期施氮对AM真菌的群落组成产生一定的影响, 林下施氮高估了自然氮沉降对AM真菌群落组成的影响。随着处理时间的延长, 不同试验处理下AM真菌群落有趋同趋势, 这可能是因为AM真菌群落对N沉降产生了适应。本研究评估了不同施N方式对森林生态系统土壤AM真菌的影响, 考虑到实验条件的局限性, 在未来的研究中需要考虑更多的N素添加梯度和更长的时间跨度, 才能够更全面的认识氮沉降的生态效应。

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