2019, Vol. 39文章信息
- 龙艾虹, 梁迪文, 罗洪添, 杨宇峰, 王庆
- LONG Aihong, LIANG Diwen, LUO Hongtian, YANG Yufeng, WANG Qing
- 大型海藻龙须菜抽提液对褶皱臂尾轮虫生命表参数的影响
- Effects of seaweed extract (Gracilaria lemaneiformis) on life history parameters of the rotifer Brachionus plicatilis
- 生态学报. 2019, 39(7): 2583-2590
- Acta Ecologica Sinica. 2019, 39(7): 2583-2590
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201804200903
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文章历史
- 收稿日期: 2018-04-20
- 网络出版日期: 2019-01-10
2. 水体富营养化与赤潮防治广东省教育厅重点实验室, 广州 510632;
3. 热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心, 广州 510632
2. Key Laboratory of Aquatic Eutrophication and Control of Harmful Algal Blooms, Guangdong Higher Education Institutes, Guangzhou 510632, China;
3. Engineering Research Center for Tropical and Subtropical Aquatic Ecological Engineering, Ministry of Education, Guangzhou 510632, China
大型海藻是重要的海洋生物资源, 在生物地球化学循环和治理富营养化方面有很重要的作用[1]。大型海藻具有较高的营养价值, 是结构多样的小分子物质的丰富来源[2], 其富含蛋白质、不饱和脂肪酸、矿物质及多种生物活性物质等, 具有促进生长、抗衰老抗氧化等多种生物活性[3], 可作为饲料添加剂使用, 并广泛应用于生物医药研究[4]。研究表明, 部分红藻门大型海藻可延长褶皱臂尾轮虫寿命[5]。
轮虫是水生食物网的重要组成部分, 是研究抗衰老生物学的良好模式生物[6]。褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)隶属于轮虫动物门、单巢目、臂尾轮虫科, 具有分布广、繁殖快、易培养等特点, 是咸淡水生态系统的重要类群。对褶皱臂尾轮虫的高密度规模化生产已开展了较多研究[7-8], 如大型海藻所含生物活性物质能促进褶皱臂尾轮虫生长繁殖、延长其寿命, 将对褶皱臂尾轮虫的规模化培养和水产养殖具有重要意义。
大型海藻龙须菜是红藻门江蓠属种类, 广泛栽培于中国沿海, 大量吸收氮磷等营养盐, 常用于修复富营养海域, 具有生长快、生物量大等特点, 是工业琼胶的重要原料和鲍鱼养殖的优质饵料, 目前正在拓展其在生物医药领域的应用[9-11]。大型海藻含有丰富的蛋白质和高度不饱和脂肪酸, 可作为褶皱臂尾轮虫的潜在食物来源[12]；利用大型海藻龙须菜影响褶皱臂尾轮虫生长和繁殖的研究未有报道。本文应用正交实验方法, 探讨在两种不同小球藻喂养条件下, 不同浓度大型海藻龙须菜提取液对褶皱臂尾轮虫生命表参数的影响, 以期为寻求最佳培养褶皱臂尾轮虫路径提供技术参考。
1 材料与方法 1.1 轮虫来源与预培养实验前, 褶皱臂尾轮虫在EPA培养基中培养, 于温度(25±1)℃、光照时间L:D=12:12的自然光照培养箱中保存(光照强度约130 lx)。小球藻分别为普通小球藻(Chlorella vulgaris)和蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa), 密度控制在(1.0—2.0)×106个/mL, 同样置于上述培养箱中进行培养。
1.2 大型海藻龙须菜水溶性抽提液的制备称取10 g新鲜龙须菜, 加少许蒸馏水研磨成浆, 用煮沸消毒过的海水离心3次, 得上清液100 mL, 此为提取液的原液[13]。再用煮沸过的海水稀释为不同浓度组：250 mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L, 1000 mg/L。
1.3 实验步骤将携带非混交卵的单个轮虫挑进塑料孔板, 经过培养孵化出新一代轮虫幼体, 取刚孵化的轮虫幼体作为实验对象, 加入不同浓度龙须菜提取液的培养基中, 分别投喂普通小球藻和蛋白核小球藻, 其浓度分别为1.0×106个/mL和2.0×106个/mL, 实验在光照培养箱中进行, 培养条件同上。实验过程中, 每间隔12 h观察一次, 记录轮虫产出的幼体数及存活个数, 将新产出的幼体用毛细玻璃管移出。每间隔24 h更换一次培养液、龙须菜抽提液和食物小球藻。实验设置8个平行, 直至所有母体均死亡为止。
1.4 生活史参数及其计算方法(1) 特定年龄存活率(lx): x年龄组开始时存活个体百分数;
(2) 特定年龄繁殖率(mx):x年龄组平均个体所产的雌性后代数, mx=后代数/(母体数×24 h);
(3) 平均寿命：所有个体平均能活多久的观察值；
(4) 净生长率(R0)：种群经过一个世代后的净增长率, R0=∑lxmx；
(5) 世代时间：完成一个世代所需要的时间, T=∑lxmx/R0；
(6) 种群内禀增长率：种群在特定实验条件下的最大增长率, 根据方程r= lnR0/T, 在粗略计算的基础上, 再根据方程
采用SPSS统计分析软件对数据进行统计分析, 采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(LSD检验)分析各浓度组下各组数据之间的差异性。以龙须菜抽提液和食物密度作为双因子, 应用SPSS软件双因素方差分析的一般模型, 比较不同龙须菜抽提液浓度与不同食物密度两种因素及其交互影响对轮虫生命表参数的影响。采用Origin Pro 2016进行作图。
2 结果 2.1 轮虫的产卵数和平均寿命不同食物浓度下, 轮虫的产卵数随着大型海藻龙须菜抽提液浓度的升高而不同；食物浓度1×106个/mL蛋白核小球藻和普通小球藻的实验组, 其大型海藻抽提液浓度组产卵数显著高于对照组(P < 0.05), 并在浓度为750 mg/L达到最高(P < 0.05), 对比对照组分别增长26%和29.8%；食物浓度为2×106个/mL普通小球藻的实验组在500 mg/L处达到最高(P < 0.05), 对比对照组增长15.1%；而食物浓度为2.0×106个/mL蛋白核小球藻实验组产卵数与对照组相比未有显著增多(图 1)。
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| 图 1 大型海藻抽提液对褶皱臂尾轮虫产卵数的影响 Fig. 1 The effects of seaweed extracts on the egg number of Brachionus plicatilis 图柱字母ab与AB分别表示各处理组间差异显著(P < 0.05) |
不同浓度小球藻的实验组, 随着龙须菜抽提液浓度的提高, 平均寿命值呈先上升再下降的趋势；食物浓度1.0×106个/mL小球藻实验组的轮虫平均寿命值在抽提液浓度750 mg/L时达到最高(P < 0.05), 对比对照组分别增长11.6%和14.2%；食物浓度为2.0×106个/mL蛋白核小球藻实验组的轮虫平均寿命值在抽提液浓度为250 mg/L达到最高, 而浓度为2.0×106个/mL普通小球藻实验组则为500 mg/L处最高(P < 0.05), 对比对照组最大增长分别为10.7%和14.4%(图 2)。
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| 图 2 大型海藻抽提液对褶皱臂尾轮虫平均寿命的影响 Fig. 2 The effects of seaweed extracts on the average life span of Brachionus plicatilis 图柱字母ab与AB分别表示各处理组间差异显著(P < 0.05) |
不同食物浓度, 不同龙须菜抽提液浓度下的存活率开始下降的时间有所不同。浓度1.0×106个/mL蛋白核小球藻以及投喂普通小球藻轮虫实验组的存活率结果显示, 对照组在第4天开始下降, 实验组在第6天或以上开始下降(P < 0.05)；而食物浓度为2.0×106个/mL蛋白核小球藻则没有显示出显著差异(图 3)。
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| 图 3 大型海藻抽提液对褶皱臂尾轮虫存活率的影响 Fig. 3 The effects of seaweed extracts on the survival rate of Brachionus plicatilis |
双因素方差分析显示, 龙须菜抽提液和不同的小球藻投喂量对轮虫的生命表统计参数有不同程度的影响(表 1)。其中, 食物浓度为1.0×106个/mL的两种小球藻和2.0×106个/mL普通小球藻实验组培养条件下, 不同浓度龙须菜抽提液对轮虫净生长率R0、世代时间T均有显著影响(P < 0.05)；相同浓度龙须菜抽提液条件下, 食物浓度为1.0×106个/mL蛋白核小球藻轮虫的净生长率R0、世代时间T比食物浓度为2×106个/mL的实验组高(P < 0.05), 但食物浓度为2.0×106个/mL蛋白核小球藻实验组的内禀增长率r相对更高。交互作用分析显示, 主体间效应检验到不同浓度的小球藻与龙须菜抽提液均对褶皱臂尾轮虫具有显著影响(P=0.01；P < 0.05), 龙须菜抽提液与小球藻食物的交互作用对褶皱臂尾轮虫的内禀增长率有显著影响(P < 0.05)。
| 参数 Parameters |
抽提液浓度 Extract concentration/(mg/L) |
蛋白核小球藻C. pyrenoidosa | 普通小球藻C. vulgaris | |||
| 1.0×106个/mL | 2.0×106个/mL | 1.0×106个/mL | 2.0×106个/mL | |||
| 平均寿命 Average life span/d |
0 | 6.63±1.3 | 6.63±0.85 | 6.25±0.67 | 6.50±0.77 | |
| 250 | 7.75±1.28 | 7.75±0.98* | 7.25±1.28 | 7.75±1.39* | ||
| 500 | 8.38±0.69* | 7.63±1.41 | 8.00±0.69* | 8.63±0.85* | ||
| 750 | 9.25±0.91* | 6.13±0.64 | 8.75±0.67* | 7.5±1.41* | ||
| 1000 | 8.25±0.67* | 5.25±1.49* | 7.50±0.41 | 6.38±0.51* | ||
| 净生长率 Net reproductive rate |
0 | 11.56±0.94 | 11.68±0.93 | 10.95±0.92 | 10.80±0.92 | |
| 250 | 13.61±0.99* | 12.84±1.01* | 12.46±1* | 13.67±1.08* | ||
| 500 | 13.98±0.88* | 11.46±1.04 | 13.44±0.94* | 14.59±1.03* | ||
| 750 | 15.17±0.87* | 10.29±0.94 | 14.51±1.01* | 13.49±1.13* | ||
| 1000 | 13.93±0.93* | 9.47±1.04 | 12.80±1.05* | 11.67±1.17 | ||
| 世代时间 Generation time/d |
0 | 3.66±0.35 | 3.69±0.34 | 3.45±0.33 | 3.61±0.35 | |
| 250 | 4.34±0.39* | 4.07±0.36* | 4.05±0.39 | 4.37±0.4 | ||
| 500 | 4.51±0.34* | 3.68±0.36 | 4.39±0.35* | 4.65±0.36* | ||
| 750 | 5.04±0.35* | 3.48±0.34 | 4.85±0.37* | 4.11±0.39* | ||
| 1000 | 4.58±0.37* | 3.01±3.62* | 4.04±0.38 | 3.62±0.41 | ||
| 内禀增长率 Intrinsic rate |
0 | 0.67 | 0.67 | 0.69 | 0.66 | |
| 250 | 0.60 | 0.63 | 0.62 | 0.60 | ||
| 500 | 0.58* | 0.66 | 0.59* | 0.58* | ||
| 750 | 0.54* | 0.67 | 0.55* | 0.63 | ||
| 1000 | 0.57* | 0.75* | 0.63 | 0.68 | ||
| 数据为平均值±标准差, *表示同一食物浓度下不同龙须菜抽提液浓度与对照组相比有显著差异(P < 0.05) | ||||||
不同食物浓度下, 轮虫的繁殖率最高值随着龙须菜抽提液浓度的改变而不同, 繁殖率均呈现出先增加后减少的趋势(图 4)。
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| 图 4 大型海藻抽提液对褶皱臂尾轮虫繁殖率的影响 Fig. 4 The effects of seaweed extracts on the reproduction rate of Brachionus plicatilis |
轮虫种群增长被认为受食物水平和温度等因素的影响[14-16]。研究显示, 优化温度和藻类食物密度的组合可以提高轮虫(B. havanaensis)的产卵数, 总繁殖率和净繁殖率以及种群内禀增长率随着温度升高而增加, 并且通常在任何给定的温度下, 较高的藻类食物水平都会导致这些变量产生较高值[17]。但不同的研究其结果有较大的差异。温度和斜生栅藻密度对裂足臂尾轮虫(B. diversicornis)的生活史参数有不同影响, 其中, 温度对轮虫的生命期望、世代时间、净生长率和总生殖率均有显著影响；而食物密度显著提高了裂足臂尾轮虫的净生长率和总生殖率；温度与食物之间的交互作用并没有显著影响轮虫的生活史参数[18]。温度25℃下, 较高或较低的食物密度显著缩短萼花臂尾轮虫(B. calyciflorus)的平均寿命和世代时间, 在3.0×106个/mL的小球藻密度下轮虫的生命期望和平均寿命最长[19]。但Halbach等认为, 投喂蛋白核小球藻的密度为1.0×106个/mL时, 萼花臂尾轮虫的繁殖速度最快, 当超过这一食物密度, 轮虫繁殖速度则随着食物密度的增加而下降[20]。在小球藻浓度为1.0×106个/mL和2.0×106个/mL时, 变异臂尾轮虫(B. variablis)的净生长率、平均寿命和生命期望最高, 高于或低于该密度则显著降低；此外, 食物密度对变异臂尾轮虫的总繁殖率、世代时间和种群增长率有显著影响[21]。本实验的研究结果显示：食物密度为1.0×106个/mL蛋白核小球藻时, 在龙须菜抽提液的交互影响下, 褶皱臂尾轮虫的净生长率显著高于食物密度为2.0×106个/mL的实验组, 世代时间相对更长, 这与Halbach等的研究结果类似。
除了受单一食物饵料的影响, 不同的食物组合对轮虫的存活与生殖也有显著影响。李香等发现蛋白核小球藻与水华鱼腥藻组成的混合饵料对萼花臂尾轮虫的增殖效果有显著影响, 而蛋白核小球藻则是最适培养萼花臂尾轮虫的单一种类[22]。席贻龙等研究发现, 利用椭圆小球藻、尖细栅藻和两者以1:1组成的混合藻培养壶状臂尾轮虫, 轮虫的繁殖率、产卵率和种群内禀增长率均为小球藻组最高, 混合藻组次之, 栅藻组最低, 三者间具显著差异[23]。由此可见, 小球藻是培养轮虫最适饵料之一。
3.2 大型海藻对轮虫存活与生殖的影响实验发现, 大型海藻龙须菜提取液对轮虫的产卵数量以及存活时间有显著影响。大型海藻具有较高的营养价值, 其富含蛋白质、矿物质及多种生物活性物质等, 这些特点使得大型海藻具有抗衰老抗氧化活性, 可作为饲料添加剂来使用, 对经济水生动物的生长具有促进作用[9]。有研究显示, 饲料中添加龙须菜粉能促进凡纳滨对虾的生长和抗应激能力, 以海藻作为饲料添加剂, 能有效改善饲料的营养结构, 提高鱼、虾等水产动物的生产率和饲料利用率[24]。在斑节对虾幼虾饲料中添加2%—4%的裙带菜能显著提高对虾对饲料蛋白质的利用率, 促进饲料蛋白质在虾体内的沉积[25]。在日本对虾饲料中添加2%的石莼藻粉, 对虾的成活率提高8.69%, 增重率提高173%, 在饲料中添加3%的紫菜粉, 能促进黑鲷幼鱼的生长繁殖, 改善营养物质的利用率以及整体营养组成[26]。殷旭旺等[27]研究了孔石莼、角叉菜、裙带菜等3种大型海藻干粉混合饲料对刺参幼参的影响, 结果表明混合了孔石莼的饲料对刺参的促进作用最好。
本实验结果显示, 大型海藻龙须菜提取液可显著延长轮虫的寿命。大型海藻富含多种结构多样的小分子生物活性物质, 这些活性物质具有抗衰老等相关特性, 其中红藻目前至少鉴定出42种新结构活性物质[3]。Snare等研究发现3种大型海藻的提取液可延长臂尾轮虫(B. manjavac)寿命的9%—14%, 起主要作用的是提取液中的脂类, 如二十碳饱和脂肪酸、十八酸丁酯和棕榈酸等[5]。大型海藻孔石莼、裙带菜和角叉菜是一种适合褶皱臂尾轮虫大规模培养的替代食物, 这些大型海藻的碎屑分别与微拟球藻(Nannochloropsis sp.)混合喂养褶皱臂尾轮虫, 获得了更高轮虫种群密度和种群增长率, 其中, 以孔石莼碎屑混合投喂的褶皱臂尾轮虫, 其体内游离氨基酸、多不饱和脂肪酸和二十二碳六烯酸(DHA)含量最高[28]。
本实验中, 利用不同浓度大型海藻龙须菜抽提液对褶皱臂尾轮虫进行培养, 结果表明, 龙须菜抽提液对轮虫的存活与生殖均有影响。随着龙须菜抽提液浓度的提高, 褶皱臂尾轮虫的产卵数以及平均寿命相应提高, 与对照组相比, 不同浓度龙须菜抽提液培养的轮虫净生长率、平均寿命以及内禀增长率均表现出显著差异。研究结果表明大型海藻龙须菜抽提液对褶皱臂尾轮虫生长与生殖具有一定的促进作用, 为优化该轮虫的大规模培养提供了参考。
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