细菌种类繁多, 对环境、人类和动物既有危害又有用处。一些细菌成为病原体, 导致了破伤风、伤寒、肺炎、梅毒、霍乱和肺结核。在植物中, 细菌导致叶斑病、火疫病和萎蔫。但一些细菌可以与酵母菌及其他种类的真菌一起用于发酵食物, 例如奶酪、泡菜、酱油、醋、酒等的制作。细菌也能够分泌多种抗生素, 例如链霉素即是由链霉菌(Steptomyces)所分泌的。细菌还能降解多种有机化合物, 常被用来清除污染, 如嗜甲烷菌(Methanotroph)可以分解三氯乙烯和四氯乙烯。在生物科技领域中, 细菌也有着广泛的运用。细菌与人类的生产和生活关系极为密切, 因此研究细菌多样性对于环境系统十分重要, 了解环境中的优势菌群和功能菌群具有特殊的指导意义。随着现代分子生物学技术的发展, 仍有大量细菌没有被发现, 因而对于细菌的研究与开发是非常必要的。

内蒙古西部地区地域辽阔, 包括阿拉善、鄂尔多斯、乌海、巴彦淖尔和包头5个盟市, 以农业和畜牧业为基础产业^[1]。由于所处纬度较高, 边沿有山脉阻隔, 气候以温带大陆性季风气候为主。该地区地形地貌复杂, 有鄂尔多斯高原、河套平原以及阴山山脉^[2], 且水资源短缺, 水土流失和沙漠化严重^[3]。整个西部地区以温带荒漠区和温带草原区为主, 土壤类型分布较多, 包括38个土壤亚类。阿拉善与鄂尔多斯等地区沙漠化严重, 以风沙土和灰棕漠土为主；包头、巴彦淖尔和乌海地区的土壤主要为栗钙土、灰钙土、棕钙土。土地利用方式多样, 有耕地、林地、牧区草地、退化草地、荒地等。由于土壤的营养成分含量、有机物的丰富程度、pH的大小、以及土壤植被的不同, 都会导致细菌分布的不同^[4], 也可能存在着特殊类型的细菌。

DGGE技术具有可靠性强、重现性高、方便快捷等优点, 该技术已经被应用于各种环境下微生物多样性的研究, 如沙漠、海洋、湖泊、沙丘、植物根系土壤等。本研究首次通过PCR-DGGE技术^[5-6]来研究内蒙古西部地区土壤细菌的多样性, 为未来该地区的细菌资源开发利用及生态系统的稳定性提供基础数据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土壤样品

根据内蒙古西部地区土壤类型及土壤利用方式, 于2014年与2015年的7—8月份对5个地区的土壤进行布点采样, 其中阿拉善38份、鄂尔多斯32份、巴彦淖尔45份、乌海14份、包头41份, 共计170份土样, 将其放于-80℃冰箱保存备用, 具体采样信息详见表 1。

1.1.2 PCR引物

根据林海龙等^[7]的方法选用适合细菌PCR-DGGE的V3区特异性引物, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成, 详见表 2。

1.2 实验方法 1.2.1 土壤肥力参数的测定

土壤样品水分含量的测定采用烘干法^[8], pH值的测定参见生态学常用实验研究方法与技术^[9], 有效磷的测定采用NaHCO₃浸提-钼锑抗比色法^[10], 速效钾的测定采用NaNO₃浸提-四苯硼钠比浊法^[11], 水解氮的测定采用碱解扩散法^[12], 有机质的测定采用重铬酸钾容量法(稀释热法)^[13]。

1.2.2 土壤总DNA提取

由于土壤中的物质繁多, 而且复杂, 其中的蛋白质、腐殖质等物质可能会抑制PCR过程中的关键物质Taq DNA聚合酶的活性, 最终影响到整个实验的结果, 因此土壤总DNA的提取质量是利用PCR-DGGE技术研究微生物多样性的关键环节, 目前土壤总DNA的提取方法可以分为两种, 分别是直接提取与间接提取方法。本研究参照李靖宇等^[14]的方法, 将其稍加改进, 对土壤进行适当的去除腐殖质处理。依据Leff等^[15]提取土壤DNA的方法, 在溶菌酶之前加入直径1 mm的玻璃珠, 涡旋仪强烈震荡, 以增加DNA的产量。

1.2.3 PCR反应条件

采用50 μL反应体系：10×PCR Buffer 5 μL, dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL, 引物(20 μmol/L)各0.4 μL, ExTaq(5 U/μL) 0.4 μL, 模板(80 ng/μL) 1 μL, 补足灭菌双蒸水至50 μL。PCR扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 35 s, 65—55℃ 40 s, 72℃ 50 s, 10个循环(每个循环退火温度降低1 ℃)；94℃ 35 s, 55℃ 40 s, 72℃ 50 s, 72℃ 1 min, 20个循环。两对引物GC-F341/R518与F341/R518的反应体系及PCR扩增条件均相同。

1.2.4 DGGE方法

采用Bio-Rad电泳系统。变性剂为梯度在40%—60%的8%聚丙烯酰胺凝胶。用50 μL注射器快速上样后, 于60℃条件下120 V恒压5 min后, 再75 V、150 W恒压14 h。硝酸银染色15 min后, 用去离子水洗脱10 min^[16]。将制好的胶移至凝胶成像系统中拍照, 图像用Quantity One 4.6.2进行分析。利用香农指数、丰富度以及均匀度等指标来比较不同土壤样品中细菌群落的基因型差异, 计算公式为：香农指数 ；丰富度R=S；均匀度E=H/H_max=H/lnS。其中, P_i是某一个样品中(即每个泳道)属于第i种的个体比例, 如样品总个体数为N, 则第i种个体数为n_i, 那么P_i=n_i/N；S是某一个样品中(即每个泳道)所有条带的总和。

1.2.5 DGGE切胶回收

用75%酒精擦拭手术刀片并用酒精灯灼烧, 待其冷却后将目的条带从凝胶上切下, 置于1.5 mL离心管中, 加入1 mL去离子水, 颠倒洗涤条带, 3000 r/min离心1 min后弃掉去离子水, 重复该步骤两遍。加入50 μL的1×TE缓冲液, 以上清液为模板, 以不带GC夹的引物进行相同程序和体系的扩增, 所得PCR产物与pMD19-T载体连接后转入大肠杆菌, 然后挑取单克隆进行菌落PCR后送北京华大公司测序。

1.2.6 序列分析

将所得测序结果于NCBI数据库的Blast程序进行分析及相似性比较, 并下载同源性最高的核酸序列, 利用ClustalX 2.0程序进行比对后, 利用MEGA 5.0软件构建系统发育树, 进行系统发育分析。

1.2.7 数据处理与分析

使用Quantity One 4.6.2对DGGE图谱进行分析, 采用SPSS 18.0统计软件对土壤样品的各项参数进行数据处理并对其与细菌多样性指数的相关性进行分析。

2 结果与分析 2.1 土壤肥力参数的测定

对内蒙古自治区西部地区采集的170份土壤样品的含水量、pH值、有机质、有效磷、水解氮以及速效钾的含量进行了测定, 将其分别与全国第二次土壤普查的各级土壤养分指标^[17]进行对比, 如表 3所示, 采集的土壤样品中27.06%为中性土壤, 66.47%为微碱性土壤；88.24%的土样含水量低于16%, 处于干旱状态；75.38%的土壤样品的有机质含量处于缺乏状态；有效磷的含量分布较均匀, 每个等级均分布有一定的比例, 约41.77%的土样处于适宜以下的水平；速效钾的含量分布相对集中, 52.94%的土样处在一个适宜的水平, 大约占44.70%的土样处于缺乏状态；而水解氮的含量整体处于一个缺乏的状态, 甚至51.18%的土样水解氮的含量处于很缺乏的水平。

根据土壤类型进行统计分析, 表 4所示为不同土壤类型肥力参数均值。粗骨土、栗褐土、灰褐土、草甸土和灰色森林土为中性土壤, 其余类型土样为微碱性土壤；栗褐土的含水量偏高, 其余类型土壤均表现出不同程度的干旱状态；沼泽土的水解氮含量最高为134.80 mg/kg, 处于丰富的水平, 灰褐土处于缺乏的状态, 其余土壤处于很缺乏或极度缺乏的状态；沼泽土的有机质含量同样也是最高的, 为39.00 g/kg, 处于丰富的水平, 灰褐土与草甸土的有机质含量处于适宜的水平, 粗骨土与灰钙土处于很缺乏的状态, 其余土壤处于缺乏的状态；虽然粗骨土的有机质含量最低, 但其有效磷含量最高, 为31.61 mg/kg, 与潮土、盐土、栗钙土、棕钙土和草甸土均处于丰富的水平, 而灰色森林土、沼泽土、灰钙土、栗褐土均处于极度缺乏的状态, 其余土壤处于缺乏或很缺乏的状态；灰褐土、潮土、盐土、栗褐土与沼泽土的速效钾含量处于适宜的水平, 其余土壤处于缺乏的状态。

根据土壤利用方式对各参数进行统计分析, 如图 1所示。土壤的不同利用方式对pH值的影响并不明显, 而耕地和林地的含水量要高于草地与未利用土壤, 未利用土壤含水量最低；对于水解氮的含量, 耕地、草地与林地相差不大, 但却都明显高于未利用土地；速效钾的含量则均相差较大, 由高到低为草地 > 耕地 > 林地 > 未利用土地；未利用土壤、耕地与草地的有机质含量无明显差异, 而林地的有机质含量明显高于其他利用方式, 这可能是由于其长年落叶导致腐殖质的含量明显高于其他利用方式的土壤；未利用土壤与耕地的有效磷含量无明显差异, 且明显高于其他利用方式, 与林地有机质含量最高正相反, 该利用方式的土壤样品的有效磷含量最低。

2.2 细菌多样性的分析 2.2.1 土壤总DNA提取

本研究采用直接提取方法, 在SDS-酶结合的基础上对土壤样品做脱腐处理, 经过预实验, 对提取到的土壤总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测, 显示条带不够明亮, 如图 2所示。

本研究采用物理、化学与酶相结合的实验方法, 又根据实际情况适当调整脱腐的次数, 最终使提取的土壤总DNA量明显增加, 如图 3所示。其中1号样品为流动荒漠风沙土, 单娜娜等^[18]研究表明流动沙土的微生物含量较少, 可能是导致优化后提取的DNA量仍相对较少的原因。

2.2.2 16S rRNA片段的PCR扩增

以提取的土壤总DNA为模板, 扩增细菌16S rRNA基因片段。由于引物前有一段高度重复的GC序列, 因此对PCR扩增条件要求很苛刻, 通过多次摸索, 最终确定了细菌的PCR条件, 得到清晰, 无杂带的扩增条带, 如图 4所示, 扩增片段大小约为220 bp。

2.2.3 PCR产物的DGGE分析

将扩增的细菌16S rRNA基因片段纯化后进行DGGE电泳检测。图 5为部分样品的细菌DGGE电泳图, 使用Quantity One 4.6.2对所有DGGE图谱进行分析。结果显示, 内蒙古西部地区土壤样品的细菌DGGE图谱中的条带普遍分布均匀, 条带数目较多, 优势条带明显。

图 6所示的为用Quantity one软件分析图 5后得到的条带分布及强度示意图。1#、10#、11#泳道土样的利用方式均为草地, 但1#为栗钙土, 10#为灰褐土, 11#为潮土, 由图 6可知10#泳道的条带数明显多于11#泳道和1#泳道, 且1#泳道的条带数最少, 说明相同利用方式的不同土壤类型对菌群的多样性有明显影响。示意图中4#、5#、7#泳道为相同土壤类型, 但是其条带数目与条带强度明显不同, 4#有24个条带, 5#有32个条带, 而7#泳道有34个条带, 且7#泳道主要分布在胶图的上半部分, 4#与5#主要分布在下半部分, 4#与5#的优势条带大体一致, 7#泳道与4#、5#有相同的优势条带也有不同的优势条带, 由此可知7#土壤菌群分布与4#、5#明显不同, 图谱中4#为未利用淋浴灰褐土, 5#都为耕地淋浴灰褐土, 7#为草地淋浴灰褐土, 说明不同利用方式对菌群的分布有明显影响。9#与7#泳道为相同类型土壤, 土壤的利用方式也都为耕地, 条带数与优势条带基本保持一致, 可知微生物类群大致相同。对内蒙古西部地区其他土壤的分析也基本遵循这一规律。

2.2.4 多样性指数分析

将细菌16S rRNA片段的DGGE图谱进行标准化后通过多样性指数的计算以分析不同土壤类型的细菌分布特点, 包括香浓指数(H), 丰富度(S), 均匀度(Eh)三个指标, 如表 5所示。香浓指数是微生物的多样性指数^[19], 其数值越大多样性越丰富；丰富度是指一个群落结构中的物种数目；均匀度指数越接近1, 表明群落结构组成越均匀。将所有土样按照土壤类型进行归类, 计算平均值后比较, 香浓指数由高到低为新积土、灰钙土、棕钙土、栗钙土、灰褐土、沼泽土、潮土、粗骨土、石质土、风沙土、草甸土、盐土、栗褐土、灰漠土；丰富度由高到低为新积土、棕钙土、栗钙土、灰钙土、沼泽土、灰褐土、潮土、风沙土、粗骨土、石质土、草甸土、盐土、栗褐土、灰漠土；均匀度指数由高到低为灰漠土、灰钙土、灰褐土、棕钙土、潮土、石质土、粗骨土、栗褐土、栗钙土、盐土、草甸土、风沙土、沼泽土、新积土、灰色森林土。由此可知, 新积土中的细菌物种数目最为丰富, 灰钙土、棕钙土与栗钙土的细菌物种数目次之, 也比较丰富, 而灰漠土的细菌物种数目最少, 其他土壤类型的居中；所有类型土壤的均匀度指数均接近于1, 说明其群落结构组成都比较均匀, 土壤类型对细菌群落结构组成的均匀度影响不明显。

若将所有土样按照土壤利用方式进行归类, 对香浓指数、丰富度以及均匀度三个指标计算平均值后比较, 如表 6所示。香浓指数与丰富度由高到低均为耕地土 > 草地土 > 林地土 > 未利用土壤, 且耕地、草地与林地土壤样品的香浓指数与丰富度相差不多, 但都明显高于未利用土壤的香浓指数与丰富度, 说明这三种土壤利用方式的细菌物种数目要明显比未利用土壤的丰富。结合不同土壤利用方式对各参数的影响可知, 土样利用方式对水解氮的含量与香浓指数及丰富度的影响相同, 推测在环境参数中, 水解氮的含量可能是影响细菌香浓指数与丰富度的主要因素；不同土壤利用方式的均匀度指数由高到低为未利用土 > 草地土 > 耕地土 > 林地土, 但其数值均接近于1, 说明其群落结构组成都比较均匀, 土壤利用方式对细菌群落结构组成的均匀度影响不明显。

2.2.5 系统发育树的构建

将内蒙古西部地区所有土壤样品的DGGE指纹图谱上的优势条带进行切胶回收, 测序, 由于有一部分优势条带胶回收DNA量没有达到测序要求, 导致测序失败, 只得到大部分优势条带的测序结果, 将这部分序列在NCBI上与标准菌株比对, 选取同源性高的菌株进行系统进化树的构建。优势条带胶回收测序后共得到了35个细菌16S rRNA基因序列, 选取27个同源性相近的标准菌株构建系统发育树, 如图 7所示。由系统发育树可知, 优势菌群大概分为两簇, 其中一簇均与未被培养的标准菌株同源性相近, 另外一簇多数都与可培养的标准菌株同源性相近。优势菌群共划分为7个门19个属, 分别为Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、Nitrospira(硝化螺旋菌门)。其中Proteobacteria(变形菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)为多数样品的优势菌群。19个属分别为Corynebacterium(棒状杆菌属)、Sunxiuqinia、Paracoccus(副球菌属)、Sorangium(堆囊菌属)、Alicyclobacillus(脂环酸芽孢杆菌属)、Reyranalla(未分类螺旋菌目)、Prallserella、Phreatobacter、Stenotrophobacter、Hankyongella、Enhydrobacter(栖水菌属)、Termodesnlfovibrio、Sphingomonadceae(鞘脂单胞菌属)、Oxalicibacterium、Rhodococcus(红球菌属)、Pesulfotomaculum(脱硫肠杆菌属)、Paenibacillus(类芽孢杆菌属)、Burkholderia(伯克氏菌属)、Pasteurella(巴斯德菌属), 还有两个Bacteloidets(未分类拟杆菌门)和Alphaproteobacteria(未分类变形菌门), 表现出了较高的多样性。其中与未被培养的菌株亲缘关系较近的有10株, 占优势菌群的28.6%, 其中的八株都集中在发育树的同一簇上, 表示这些未被培养的优势菌群亲缘关系较近。

2.3 细菌多样性与土壤理化性质的关系

将土样的含水量、pH、有机质、水解氮、有效磷和速效钾的含量与细菌的香浓指数、丰富度以及均匀度利用SPSS进行相关性分析, 结果如表 7所示, 香浓指数、丰富度以及均匀度与pH、含水量、水解氮呈正相关, 与有机质以及速效钾的含量呈负相关, 但由于相关系数的绝对值均较低, 说明它们之间的相关性并不显著。

3 讨论

对内蒙古西部地区的土壤参数进行分析统计, 可知该地区的土样基本为中性偏碱性, 且土样的含水量、水解氮、有机质和有效磷的含量基本处于适宜以下的水平, 而有效钾的含量则相对较高, 处在适宜的水平, 但单一元素的适宜并不能改善养分整体的肥力状况。由赵业婷^[20]对陕西省关中地区土壤养分进行的分析可知, 该地区有机质、速效氮、速效磷及速效钾的含量分别处于土壤养分分级标准的第5、4、3、2级, 即除有机质处于缺乏的状态外, 其他含量均处于适宜及适宜以上的水平。付巧玲^[21]在对河南省郑州市蔬菜基地的土壤资源评价中分析得出该市郊土壤肥力中等, 除速效磷含量较低外, 其他养分含量中等。相比可知内蒙古西部地区土壤旱化严重, 土壤肥力水平较低, 由此也可以解释该地区风沙及沙漠化严重、植被退化等一系列的生态环境恶化问题。

在对土样中细菌多样性的分析后可知, 新积土、棕钙土与栗钙土的香浓指数及丰富度均相对较高, 栗褐土和灰漠土则相对较低。新积土是由河流流水沉积物或山丘、河谷低处的洪积物和堆积物发育而成, 多数是肥力水平较高的农耕地, 而棕钙土和栗钙土等是我国北方分布范围极广的草原土壤, 钙积作用强, 相对西部地区其他土壤来说较肥沃, 同时棕钙土地区光热资源丰富, 这都可能是细菌分布较为丰富的主要原因。栗褐土风蚀严重, 母质特征明显, 灰漠土则是石膏盐层土中稍微湿润的类型, 是温带漠境边缘细土物质上发育的土壤, 有盐化和碱化的缺点, 这可能是该类型土壤细菌多样性指数较低的原因。

在本研究中, 由于土壤利用方式的不同而在相同地区的相同类型土壤中细菌多样性出现了一定的差异性, 土壤的利用方式不同可能会影响到土壤微生物结构与多样性, 此外, 内蒙古西部地区降雨量、温度与地形等诸多因素都有很大的区别^[22], 可能导致不同地区的相同土壤类型的微生物结构差异很大。研究中发现, 相同类型的土壤的整体微生物结构中草地的微生物比耕地的微生物丰富, 如本文图 5中4#为未利用淋浴灰褐土, 5#都为耕地淋浴灰褐土, 7#为草地淋浴灰褐土, 7#泳道的细菌条带数明显多于4#与5#泳道。由于内蒙古西部地区地域辽阔, 土壤类型众多, 土壤利用方式多样, 加之产生细菌多样性差异的原因众多, 包括重金属污染、温度、盐度等^[23-25]都可能导致细菌多样性的差异。

经过16S rRNA基因序列测序比对后总共得到了7个门的细菌优势条带, 分别为Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、Nitrospira(硝化螺旋菌门), 共分属于19个属, 其中Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)与Actinobacteria(放线菌门)的菌种为多数样品的优势菌群。以上结果基本与张星星^[26]、张善利^[27]等的研究基本一致。吴永胜等^[28]对内蒙古不同退化阶段的荒漠草原进行研究发现荒漠草原中土壤微生物的数量最多的为细菌, 其中优势菌群为Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)和Firmicutes(厚壁菌门), 明显少于本研究中发现的优势菌群种类。细菌在人类生产生活中扮演着重要的角色, 如Proteobacteria(变形菌门)中的粘细菌除了产生可以应用于临床的抗生素外, 还产生与抗肿瘤有关的物质^[29-30]；Nitrospira(硝化螺旋菌门)中的硝化细菌在农业生产以及氮污染环境方面都具有重要的作用^[31-32], 了解这些菌群的分布对于评价内蒙古西部地区土壤环境稳定性以及开发利用微生物资源都具有重要的指导意义。

本研究发现土样的含水量、pH、有机质、水解氮、有效磷和速效钾的含量与细菌的香浓指数、丰富度以及均匀度之间的相关性并不显著。杨菁等^[33]发现影响降香黄檀混交林土壤细菌群落结构和细菌多样性的主要土壤理化因子除了pH值和有机质外, 还有脲酶和多酚氧化酶, 而这两项参数在该研究中并未测定。李鹏等^[34]在研究水稻秸秆还田时间对土壤真菌群落的结构影响时发现土壤有机碳、pH和速效磷是影响菌群结构及多样性变异的主要因素；靳正忠等^[35]通过探究沙漠人工绿地土壤微生物与环境因子的关系, 认为全氮和速效氮是影响微生物数量的主要因素；张瑞娟^[36]的研究结果显示钾素和氮素对土壤微生物的多样性影响较大。由此可知土壤中有机质、氮、磷、钾等元素是影响微生物多样性的重要养分因子。这与本文的研究结果略有不符, 可能是由于影响细菌多样性的原因众多, 土壤类型与土壤的利用方式也会对其产生影响, 而上述研究人员的实验结果前提是其采取的土壤样品多为同一利用方式。此外, 也可能还有其他环境因子的影响, 比如微量元素、金属离子等, 但本研究尚未对其进行检测。

4 结论

本研究首次对内蒙古西部地区土壤中的细菌多样性进行了分析。内蒙古西部地区细菌资源较为丰富, 其多样性受到土壤类型及土壤利用方式的显著影响。该地区土壤中的优势菌群包括Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、Nitrospira(硝化螺旋菌门)。这为今后该地区的细菌资源开发利用以及进一步研究其多样性提供了基础数据。