喀斯特天坑(Tiankeng)是一种区别于常态喀斯特漏斗的独特宏大地表负地形^[1], 其具有巨大容积、陡峭而圈闭的岩壁、深陷的井状或桶状轮廓等形态特征, 是宏大且独特的负地形世界奇观。喀斯特天坑受坑壁圈闭化效应和地形约束的影响, 天坑内部的水热条件、气候特征均与地表有异, 由此造就了与外界环境相对独立的内部独特生境^[2]。中国是名副其实的“世界喀斯特天坑王国”, 境内共分布50余个天坑。全球已发现的3个特大型天坑均分布在中国, 并发现了许多颇具代表性的喀斯特天坑群, 例如四川兴文天坑群、重庆武隆天坑群、云南沾益天坑群、贵州罗甸天坑群等^[3]。喀斯特天坑群呈现出独特的生境特征和生物多样性分布格局, 不仅具有物种多样性保护库功能, 并且在全球气候变化的大环境下, 能成为区域小尺度上的生态避难所, 其蕴含的旅游美学价值和科研价值巨大^[4]。

随着对喀斯特天坑研究的深入, 不断有研究表明天坑具有植物种类丰富、珍稀植物多样等特点^[5], 印证了规模最为宏大、圈闭化程度最高的喀斯特天坑是一个重要的生物多样性宝库及物种多样性保护库。近年来针对天坑的研究主要集中在植物多样性及群落结构特征^[6], 如云南沾益大毛寺原生天坑坑底与坑边缘的植物群落组成差异较大, 坑底植物多样性和丰富度更高^[7]。广西流星成熟天坑内植物群落物种多样性较高, 资源生态位多样^[8]。四川兴文天坑群中, 退化程度较小的天坑植物群落物种最丰富^[9]。但相关研究却忽略了退化天坑土壤微生物群落的功能多样性。退化天坑成为植物多样性宝库, 其中的土壤微生物群落功不可没, 是天坑植物生态的中介与桥梁。同时, 生物多样性涉及植物、动物和土壤微生物及其生存环境, 对喀斯特天坑生物多样性的研究, 土壤微生物群落多样性也是必不可少的部分。土壤微生物是生态系统的最活跃的组成部分, 它参与物质循环、有机质分解等生化过程, 被誉为生物地球化学循环的引擎^[10]。土壤微生物群落多样性即土壤生态系统中微生物群落生态特征及微生物与环境间相互作用的多样化程度^[11]。土壤微生物群落多样性包括组成多样性、功能多样性以及遗传多样性, 其中土壤微生物群落功能多样性是土壤微生物群落状态与功能的指标, 反映不同环境下土壤微生物群落的生态特征^[12], 与土壤功能^[13]、植被发育^[14]、生态系统的可持续之间关系密切^[15]。喀斯特天坑内部是一个相对封闭的环境, 较坑外具有湿度大、温度低和负氧离子浓度高的特点, 形成了独特的小气候, 这为各种生态类型动物、植物以及微生物的繁衍生长提供了异质性的环境^[16], 明确天坑生境中土壤微生物群落的分布特征以及土壤生态功能具有重要意义。

本研究对象——巴家陷塘天坑属于退化天坑。在所有天坑类型中, 退化天坑分布最多。退化天坑是指天坑其四周的崖壁退化崩塌形成倒石坡, 在此之上树木掩映块石堆积体后形成天坑植物群落的一种天坑类型^[17], 具有可进入性强, 受人为干扰较大, 与外界环境联系更为紧密等特点, 因此退化天坑的生物多样性更加丰富, 表现出多元化的生态类型^[18][19]。前期的研究发现, 退化天坑中倒石坡由于拥有良好的土壤资源和较少的外界干扰, 形成了植物物种丰富和多样性较高的空间格局^[20]。不同于以往的研究均针对于正地形坡面^{[15, 20-21]}, 退化天坑倒石坡是一种负地形坡面, 作为连接天坑内外的过渡带, 具有异于地表的气候条件(温度、降水等)、土壤特性(pH、含水量、碳氮比等)等环境梯度, 以及植被覆盖的差异, 这些因素都是土壤微生物多样性和空间分布的关键驱动因子^[22]。在退化天坑中选择探究倒石坡土壤微生物多样性更具代表性。

因此, 本研究利用Biolog微平板技术探究喀斯特退化天坑倒石坡不同坡位的土壤微生物群落功能多样性, 明确倒石坡上土壤微生物群落分布特征, 了解喀斯特天坑的土壤功能、植被覆盖以及生态过程, 揭示倒石坡在退化天坑生物多样性保护中的价值, 并为退化天坑的生态恢复和生物多样性保育提供科学依据。

1 研究区域及研究方法 1.1 研究区概况

沾益天坑群位于云南曲靖市沾益海峰自然保护区内(图 1), 地处滇东高原北部, 具有原生和退化天坑完美共存, 集中成群分布等特点。地理位置介于103°29′—103°39′E, 25°35′—25°57′N之间。海峰自然保护区是云南省纬度和海拔最低, 结构完整、功能齐全的区域。天坑群所在区域气候特征为典型的亚热带高原季风气候类型, 其气候特点为干湿季分明﹑年温差小﹑日温差大。平均气温13.8—14℃, 太阳辐射能年总量为123.8 kcal/cm², 年降雨量1073.5—1089.7 mm左右。年平均风速为2.7 m/s, 风向以西南风为主。天坑群区域的土壤处于云南土壤的红土壤水平带, 加之该区域内独特的气候类型共同为生物多样性形成奠定了坚实的基础。

1.2 样地调查

本文选取沾益天坑群中的巴家陷塘为研究对象, 巴家陷塘坑底海拔为2013.5 m, 长径达240.0 m, 短径为197.7 m, 从坑口到坑底的距离达70 m, 深宽比为0.353, 坑壁破损度小于20%。根据退化天坑的深宽比、坑壁破损度及坑口等外观形态方面设置评价参数(表 1)^[23], 将其划分为中度退化天坑。巴家陷塘退化天坑主要在坑南侧形成倒石坡, 坑底没有乔灌木遮挡, 光照充足, 主要生长着黄龙尾Agrimonia pilosa var. nepalensis、荩草Arthraxon hispidus、龙芽草Agrimonia pilosa等阳生型植物。到坑缘由于乔灌木的荫蔽环境影响, 植物逐渐过渡到一把伞南星Arisaema erubescens、川西鳞毛蕨Dryopteris rosthornii等阴生植物。坑坡则主要为森林群落, 优势乔灌层主要有云南松Pinus yunnanensis、栓皮栎Quercus variabilis、油杉Keteleeria fortunei、清香木Pistacia weinmanniifolia等, 坑坡的草本层主要是一把伞南星Arisaema erubescens、紫茎泽兰Eupatorium adenophorum、川西鳞毛蕨Dryopteris rosthornii、半夏Pinellia ternata等。坑口草本层主要为一把伞南星Arisaema erubescens、板凳果Pachysandra axillaris等。各坡位样地信息如表 2所示, 坑坡样方设置如图 2所示。在巴家陷塘南侧布设样线, 起于坑口, 止于坑底, 分为坑口、坑坡(上坡位、中坡位和下坡位)和坑底5个坡位。每个坡位布设5个1 m×1 m草本样方, 记录物种名, 测定各物种的株树、盖度等指标。坑坡主要为森林群落, 故每个坡位再设置1个20 m×20 m木本样方, 记录物种名, 测定各物种的株树、盖度等指标。利用手持GPS记录样地的经纬度、海拔、坡位等地理位置信息。样地土壤环境因子主要采用土壤温湿度测定仪、土壤原位pH测定仪及土壤电导率测定仪采集。每个草本样方内采一个土样, 将5个样方内土样合并为一个样品, 过2 mm筛, 放置在冰盒中冷藏带回实验室, 做土壤微生物群落功能多样性测试。

1.3 植物α、β多样性指数 1.3.1 α多样性指数

α多样性指数选择Simpson优势度指数(C)、Shannon-Wiener多样性指数(H)、Margalef丰富度指数(D)、Pielou均匀度指数(J)进行分析, 计算公式如下：

Shannon-Wiener指数：

(1)

(2)

(3)

(4)

式中, S为调查的物种总数；N_i为样方中物种i的个体数, N表示样方中所有物种的个体总数, P_i表示样方中物种i的个体数占所有物种个体总数的比例, 即P_i=N_i/N。

1.3.2 β多样性指数

β多样性也称为生境间的多样性, 是沿环境梯度不同生境群落之间物种组成的相异性^[24]。β多样性的测度方法分采用二元数据测度法, 选择Whittaker指数、Cody指数、Routledge指数、Whilson-Shmida指数进行分析。

(5)

(6)

(7)

(8)

式中, S为调查的物种总数, m_a为各样方中物种平均数；g(H)是沿生境梯度H增加的物种数目, l(H)是沿生境梯度H失去的物种数目, 即在上一个梯度中存在而在下一个梯度中没有的物种数目；r为分布重叠的物种数。

1.4 土壤微生物群落功能多样性测定

土壤微生物群落功能多样性采用Biolog微平板技术进行测定。Biolog微平板每孔的单一碳源的利用率可了解微生物的动态, 每块平板共96微孔, 3组重复, 每组包含31种不同碳源和1个空白。在一定温度下恒温培养, 土壤微生物代谢碳源产生的电子, 可使微孔内的染料变成紫色。每孔颜色变化程度可以反映土壤微生物对不同碳源的代谢能力高低。

称取10.0 g鲜土放入三角瓶中, 加入90 mL灭菌的生理盐水(0.85% NaCl, W/V), 用无菌棉花塞封口。震荡30 min后, 静置15 min, 用移液枪吸取10 mL上清液, 加入90 mL灭菌生理盐水。按逐步稀释法, 将土壤悬液稀释为10^-3 g/mL。在超净工作台中用移液器将制备好的土壤悬液接种到Biolog微平板的各孔中, 每孔150 μL, 放入25℃的培养箱中培养7 d。每隔24 h用Biolog微生物自动鉴定系统(MicroStationTM System, 美国Biolog公司)在590 nm下测定各孔的吸光值, 完成数据的采集和储存。

1.5 数据分析 1.5.1 平均颜色变化率(Average well Color Development, AWCD)

式中, A_i为反应孔在590 nm处的吸光值, A_A1为控制孔在590 nm处的吸光值。若A_i-A_A1值为负值结果取零。

1.5.2 群落功能多样性

微生物群落功能多样性常通过各种多样性指数来反应, 本研究采用的多样性指数如表 3所示。

所有实验数据采用单因素方差分析, 结果以平均值±标准偏差(SD)表示。土壤微生物群落培养到144 h的AWCD值趋于稳定, 故采用144 h的AWCD值计算群落多样性指数和主成分分析。利用SPSS 22.0和Origin 9.0进行主成分分析, 使用Excel 2007和Origin 9.0组图。

2 结果与分析 2.1 植物群落的物种多样性

多样性指数是反映群落物种多样化或异质性程度的指标。如图 3所示, 草本层植物多样性在坑坡上表现为中坡位的Shannon-Wiener多样性指数最大, 但不同坡位间差异不显著。坑底的Simpson优势度指数和Margalef丰富度指数均显著高于坑口, Margalef丰富度指数在上、中、下坑坡间差异不显著。各坡位上的Pielou均匀度指数差异不明显。分析坑坡上的木本层植物多样性(图 4), 上、中、下坡位的木本植物多样性差异显著, 且下坡位最大。综合分析以上指数发现, 坑内外草本植物分异特征较明显, 而坑坡作为坑底与坑口的过渡地带, 草本层植物与坑底和坑口差异不大, 但坑坡的木本层植物差异显著。

β多样性用于表示沿环境梯度不同生境间物种组成的差异性, 是植物种类对环境异质性的响应^[25]。β多样性越大, 表明不同生境间的差异越大。从图 5可以看出, 从坑口到坑底, 各β多样性指数大致呈逐渐增大的趋势, 这表明沿着坑坡的环境梯度, 共有种的数量逐渐减少, 植物种类差异越来越大。且Whittaker指数、Cody指数、Routledge指数及Whilson-Shmida指数均表现为下坡位与坑底的差异最大。综合可知, 退化天坑倒石坡的下坡位生境类型最多样, 能量物质交换频繁。而其它坡位的β多样性指数相比较低, 植物群落结构更稳定。

2.2 土壤微生物群落代谢活性

土壤微生物群落的代谢活性及对单一碳源利用能力可通过平均颜色变化率(AWCD)来表征, 其值也在一定程度上反应了土壤微生物群落的数量及结构特征。由图 6可以看出, 在0—24 h内, 微生物群落利用对碳源的利用率低, 故AWCD值较低。随着培养时间的增加, AWCD值不断上升, 且在24 h后不同坡位的AWCD值出现不同的增长趋势, 24—72 h时间段里不同坡位土壤微生物的AWCD值呈现出交替上升, 72 h后各坡位土壤微生物的AWCD值出现分化, 大体上呈现出下坡位>坑底>中坡位>上坡位>坑口。结果表明坑底和下坡位的土壤微生物群落代谢活性相对较高。

2.3 土壤微生物群落对碳源利用强度

Biolog微平板的碳源包括糖类、羧酸类、氨基酸类、酚酸类、聚合物类和胺类。通过不同坡位土壤微生物群落对6类碳源的利用程度分析(图 7)可知, 不同坡位土壤微生物利用碳源的程度存在差异, 大体上呈现出从坑底到坑口利用程度逐渐降低的趋势, 利用率较大的碳源为糖类和氨基酸类, 酚酸类和聚合物类利用率较低。说明糖类和氨基酸类碳源是倒石坡上土壤微生物群落利用的主要碳源。

2.4 土壤微生物群落代谢多样性类型

不同坡位的土壤微生物群落结构和功能多样性能通过对不同碳源的利用差异来体现。采用144 h的AWCD值, 对不同坡位土壤微生物群落利用单一碳源特征进行主成分分析。获得两个与土壤微生物群落多样性相关的主成分, 分别为PC1(31.9%)和PC2(28.7%), 两者累计贡献率为60.6%, 由于其他成分贡献率更小, 故只采用PC1和PC2来表征土壤微生物群落碳源代谢特征。由图 8可知, 不同坡位土壤微生物群落在PC轴上出现分布差异。不同坡位土壤微生物群落的碳源利用有明显的分异效果, 这表明坡位不同对土壤微生物群落的碳源利用有较大的影响。整体上下坡位在PC1和PC2正半轴的载荷值最高, 这说明坑底的土壤微生物群落基础代谢活性高于其他坡位。此外, 将主成分PC1和PC2的得分系数与31种单一碳源做相关性分析, 其中与PC1相关的碳源有14种, 主要是糖类(D-半乳糖酸γ-内酯﹑D, L-α-磷酸甘油)和羧酸类(丙酮酸甲酯﹑D-半乳糖醛酸﹑α-丁酮酸), 与PC2相关的碳源有12种, 其中糖类(D-木糖/戊醛糖﹑N-乙酰-D葡萄糖氨), 氨基酸类(L-苯丙氨酸﹑L-丝氨酸)和聚合物类(α-环式糊精﹑肝糖)对PC2贡献较大。由此可以看出，在倒石坡上糖类和羧酸类碳源更能引起土壤微生物群落功能变化。同时也说明倒石坡的土壤环境为土壤微生物提供了充足的营养基质, 且碳水化合物类物质丰富。

2.5 土壤微生物群落功能多样性

目前群落多样性指数常用Simpson指数(D)、Shannon-Wiener指数(H)和McIntosh指数(U)来表征, 是研究常见物种优势度, 群落丰富度及均匀度的综合指标^[26]。结果如表 4所示, 下坡位的Shannon-Wiener指数最高, 不同坡位间差异显著(P < 0.05), 表明下坡位的土壤微生物群落种类多, 分布均匀。其次Simpson指数在坑底和下坡位略高于其他坡位, 除坑口和上坡位差异不显著外, 其余坡位均差异显著(P < 0.05), 说明在坑底和下坡位的土壤微生物群落优势种群长势良好, 数量优势明显。最后的McIntosh指数在各坡位差异显著(P < 0.05), 下坡位最大, 其次坑底, 表明下坡位的土壤微生物种类丰富, 且均匀度高。综上可知在退化天坑的倒石坡上, 不同坡位的土壤微生物群落功能多样性存在差异, 相比而言坑底和下坡位的多样性更高, 具有更高的土壤微生物种群生态位。

3 讨论 3.1 负地形倒石坡环境梯度对土壤微生物多样性的影响

生物多样性沿环境梯度的变化是近年来生物多样性研究的重要问题, 环境梯度是影响物种多样性分布格局的决定性因素之一, 亦是生物多样性分布格局研究的重要方面^[27]。本研究通过β多样性指数比较发现, 从坑口到坑底各β多样性指数逐渐增大, 各坡位间物种组成差异大, 这说明天坑作为一种独特的地理生境, 坑内外生境具有明显的分异特点, 坑坡上不同坡位的生境也存在差异, 其中下坡位和坑底的差异最大, 下坡位生境异质性明显。不同生境具有差异性的土壤环境、温度和水分等非生物环境, 这些都会影响土壤微生物群落多样性^[28]。首先坡位是重要的地形因子, 不同坡位的生境直接影响着土壤微生物群落。研究表明坡面表层的土壤微生物量和养分会由于地表径流和淋溶作用而表现出明显的“洼积效应”, 即随坡位的上升, 土壤微生物量和土壤养分会逐渐降低^[29]。喀斯特退化天坑的倒石坡坡面, 坡上部土壤细粒由于侵蚀、重力等作用搬运到坡下部, 因此土壤汇聚效应使坡下部的土壤较厚, 有机质含量高。而土壤颗粒越细﹑有机质含量越高, 土壤微生物群落结构就会越复杂, 多样性也越高^[30]。本研究发现土壤微生物群落功能多样性也表现为下坡位>中坡位>上坡位, 有明显的“洼积效应”。这与黄土高原丘陵沟壑区坡面^[15]和紫色土区坡耕地坡面^[31]的土壤微生物群落多样性和数量分布规律一致。

其次坡位会引起土壤水分的变化, 这也是导致多样性波动的重要因素。Gordon等^[32]和Xiang等^[33]的研究一致认为, 较高的土壤水分可提高土壤微生物活性。样地调查土壤含水量发现, 坑内土壤含水量显著高于坑口(P < 0.05)。坑口为典型的喀斯特地质环境, 石漠化严重, 保水性差, 造成土壤有机质流失, 影响土壤微生物生存环境, 因而坑口的土壤微生物群落多样性较低。而喀斯特漏斗地形底部可聚集大量的水分, 坑坡(冲沟)也具有较强的汇水功能, 良好的土壤条件使土壤微生物群落多样性更高。

最后土壤的管理方式也会通过改变土壤理化性质而影响土壤微生物群落多样性。走访调查了解到巴家陷塘在70年代以前坑底曾进行农耕活动, 建国之后处于停耕状态, 有一定的自然恢复, 但同时存在适度放牧等人为干扰, 羊等牲畜主要集中在坑底和下坡位处觅食。根据“中度干扰理论”, 适度放牧干扰下, 植物根系发育良好且分泌物较为丰富, 改善土壤条件, 利于微生物的生存和繁殖, 从而使得下坡位和坑底具有较高的土壤微生物群落多样性^[34]。

3.2 负地形倒石坡植被对土壤微生物多样性的影响

植被群落状态是土壤微生物群落功能多样性的主导因素之一, 坡面不同坡位的水热组合会影响植被覆盖差异, 同时影响土壤性质, 使得地表群落和地下系统相互关联^[35]。生态系统中的植物群落可通过影响土壤的碳氮含量﹑含水量﹑通气性及pH值等来影响土壤微生物群落多样性^[36], 地表植物多样性高有利于土壤微生物群落代谢及多样性形成。Waid等^[37]认为土壤微生物群落多样性变化与植被类型﹑数量及化学组成有密切关系。周桔等^[38]研究发现地上植被多样性与土壤微生物群落多样性呈显著正相关。本研究通过对比草本层植物多样性指数发现, 坑底的Simpson指数和Margalef指数均显著高于坑口(P < 0.05)。坑口植物群落受环境的影响, 植被覆盖率及多样性较低。而土壤微生物群落多样性也显示坑底土壤微生物群落对碳源利用程度较高, 多样性指数均表现为坑底显著高于坑口(P < 0.05), 表明坑底土壤微生物群落种类多且均匀。

坑坡的下坡位植物群落逐渐由灌草丛向森林群落过渡, 生境较为湿润, 主要生长着阴生草本植物, 如一把伞南星﹑板凳果等。研究表明一种植被类型被另一种植被类型取代的生态张力区, 往往具有物质交换和能量流动比临近群落高、生物多样性高以及土壤养分条件改变等特点^[39]。等^[40]认为不同草原类型的交错区域由于生境异质性, 能保持较高的植物多样性。结合草本植物多样性指数分析, 坑坡草本植物多样性指数差异不显著, 但木本植物多样性在上、中、下坡位间差异显著(P < 0.05)。任正龑等^[41]也认为坡面地形因生境差异而对木本层植物分布影响最显著。坑坡作为过渡带, 坑内外植物多样性差异显著, 具有一定的“边缘效应”。比较坡面上土壤微生物群落功能多样性指数和群落利用碳源的整体能力, 结果均表现为下坡位>中坡位>上坡位, 这可能是由于在草本层植物多样性差异不显著的情况下, 下坡位较高的木本层植物多样性可以通过更多的凋落物和根系分泌物来供给土壤微生物, 提高土壤微生物群落多样性。土壤微生物群落多样性高的土壤, 生态功能更多样化, 土壤生态系统和生产力能保持稳定, 从而维持植被群落结构、发育和演替。

4 结论

通过对巴家陷塘中度退化天坑倒石坡的土壤微生物群落研究发现, 坑底和坑口的土壤微生物群落功能多样性存在明显差异, 坑底土壤微生物群落的碳源代谢能力和功能多样性指数(Shannon指数﹑Simpson指数﹑McIntosh指数)均高于坑口。坑坡作为连接坑内外的过渡带, 其土壤微生物群落多样性与坑底、坑口具有相异的特点, 下坡位土壤微生物群落功能多样性略高于坑底, 显著高于中坡位, 在坡面上呈现出下坡位>中坡位>上坡位的趋势。下坡位的系统结构较复杂, 生物多样性较丰富, 异质性较高, 并且受到天坑环境资源调控, 其土壤养分及持水性能优于其他样地, 能为土壤微生物群落提供更多的生态位。因此未来在退化天坑封山育林的保护中, 更应重视倒石坡的生物多样性及物种保护的重要性。

本研究采用的Biolog微平板技术工作效率高, 操作简单, 被广泛应用于土壤微生物群落功能多样性研究。但该技术具有一定的局限性, 只能反映能利用Biolog微平板中碳源的微生物。今后研究需采用高通量测序技术﹑磷脂脂肪酸(PLFA)、土壤蛋白质组学等方法, 对比天坑内外土壤微生物群落差异, 深入探究土壤微生物群落结构及功能多样性, 特别与土壤营养循环相关的功能微生物群落多样性, 这将有利于喀斯特天坑作为生物多样性宝库的进一步探索。