作为世界三大黑土区之一的东北黑土区是我国最重要的商品粮基地, 在国家粮食安全中有举足轻重的地位^[1]。黑土因腐殖层厚、肥力高、团粒结构好等特性, 成为珍贵的土壤资源。而土壤酶活性和微生物是评价土壤质量的重要指标, 对促进有机质分解和养分转化十分重要, 两者对各种农业管理措施如秸秆还田、施肥及耕作方式等变化较敏感^[2-5]。我国的秸秆资源十分丰富, 据统计全国每年共产生秸秆数量为6.2亿t, 约占世界的20%—30%^[6]。农作物秸秆作为物质、能量和养分的载体, 成为宝贵的生物质资源, 目前秸秆利用主要以直接还田为主^[7]。Tejada等^[8]研究表明秸秆还田可改善土壤结构, Li等^[9]发现不同形式秸秆还田均能提高土壤蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶及碱性磷酸酶活性^[10]、增加土壤微生物生物量碳氮^[11]、提高细菌群落多样性^[12]、进而改善土壤生物学性状^[13]。农业生产中, 秸秆直接还田常因粉碎不彻底、病虫寄居等原因, 导致作物播种质量差、与作物争夺养分和水分、加重病虫草害及增加温室气体排放等问题^[14-17]。目前, 关于秸秆还田方式、还田量等方面的研究虽然较为常见, 但关于秸秆颗粒还田的相关研究鲜见, 尤其针对秸秆颗粒还田对东北黑土地土壤酶活性及微生物群落的相关研究未见报道。鉴于此, 为明确不同秸秆颗粒还田量对黑土酶活性及微生物群落的影响, 本试验通过6种秸秆颗粒还田处理, 连续2年大田定位试验, 研究不同秸秆颗粒还田量对黑土4种土壤酶活性、微生物生物量及微生物群落及结构的影响, 以期为秸秆合理高效利用、增强黑土可持续生产能力提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验地概况

本试验于2016—2017年在内蒙古兴安盟扎赉特旗农业科技示范园区开展, 该地区属温带大陆性半干旱季风气候区, 年均日照为2855 h, 常年积温2600℃左右, 无霜期110—135 d, 海拔高度203 m, 土壤类型为草甸土, pH为8.22。试验地养分状况见表 1, 试验期间降雨量和气温变化见图 1。

1.2 试验设计

目前大多数关于玉米秸秆还田试验秸秆还田量均为0、30%、60%及100%还田, 本试验设秸秆0还田, 还田量0 kg/hm²(CK)、秸秆60%还田, 还田量4500 kg/hm²(JG1)、秸秆70%还田, 还田量5250 kg/hm²(JG2)、秸秆80%还田, 还田量6000 kg/hm²(JG3)、秸秆90%还田, 还田量6750 kg/hm²(JG4)和秸秆100%还田, 还田量7500 kg/hm²(JG5)6个处理, 各小区采用随机区组设计, 重复3次, 小区面积13.2×10=132 m²。前季玉米收获后将地上部分自然风干, 收割回收后用粉碎机把秸秆揉搓、粉碎至10—20 mm, 用生物质颗粒机(型号KWLH-628, 江苏金梧实业股份有限公司)制得直径3—4 mm、长度30—50 mm的棒状圆柱体, 冷却后存放于干燥室备用。播前一周, 移除地上全部秸秆和根茬, 后将秸秆颗粒均匀撒施入各小区, 随即进行旋耕作业, 深度20 cm。2016—2017年均为5月10日播种, 玉米品种为恒育498, 采用大垄播种机播种, 播量22.5 kg/hm², 行距66 cm, 株距25 cm, 保苗数60000株/hm²。化肥随播种机施入, 尿素150 kg/hm²、磷酸二铵225 kg/hm², 不追肥。于5月26日、7月12日灌水两次, 灌水量900 m³/hm², 10月10日收获。

1.3 样品采集与分析 1.3.1 土样采集与分析

于2016、2017年10月玉米收获后每小区按“S”型取样法取6个处理0—20 cm土壤样品, 混合作为该处理的一个样品, 每个处理重复3次。土样装入无菌密封袋, 后置于保温箱带回实验室, 立即测定土壤生物学性质。2016年10月采集玉米根际土样, 低温运输至北京诺禾致源生物信息科技有限公司测定土壤微生物群落。土壤过氧化氢酶活性采用微量滴定法测定^[18]；蔗糖酶采用二硝基水杨酸比色法测定^[18]；碱性磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定^[18]；土壤脲酶采用靛酚蓝比色法测定^[19]。土壤微生物生物量碳采用熏蒸提取-容量分析法测定, 土壤微生物生物量氮采用熏蒸提取后凯氏定氮法测定^[20]。

1.3.2 基因组DNA的提取和PCR扩增

采用CTAB方法对样本的基因组DNA进行提取, 之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度, 取适量的样品于离心管中, 使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板, 根据测序区域的选择, 使用带Barcode的特异引物, New England Biolabs公司的Phusion^® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer, 和高效高保真酶进行PCR, 确保扩增效率和准确性。鉴定细菌多样性引物对应区域：16S rRNA基因V4区引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′)。

1.3.3 PCR产物的混样和纯化

PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样, 充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。

1.3.4 文库构建和上机测序

使用TruSeq^® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建, 构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量, 文库合格后, 使用HiSeq2500 PE250进行上机测序。

1.4 数据处理分析

测序数据处理以及OTU聚类和物种注释方法参照方伟等人的研究^[21]。使用Qiime软件(Version 1.7.0)计算样品复杂度, 并进行多样品比较分析。分别使用R软件(Version 2.15.3)绘制PCoA图和稀释曲线。试验中数据采用Excel 2003和SAS 9.0软件进行统计分析。图表数据均是平均值±标准误。

2 结果 2.1 不同处理对土壤酶活性的影响

由图 2可知, 2016与2017年秸秆还田明显提高了4种酶活性, 2016年蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶与碱性磷酸酶活性较CK分别提高了4.7%—47.3%、5.2%—52.6%、5.0%—18.0%和11.0%—60.2%, JG2与JG4处理酶活性较高；2017年各处理土壤酶活性表现与2016年基本一致, 尤以JG4处理酶活性最高。各处理4种酶活性明显高于CK, 且随着秸秆还田量的增加, 土壤酶活性总体上呈升高趋势, 当还田量达到6750 kg/hm²时, 酶活性达到最大值, 继续增加还田量, 土壤酶活性下降。连续两年秸秆还田与还田一年相比, 过氧化氢酶活性显著提高, 脲酶与碱性磷酸酶活性显著降低(P＜0.05)。

2.2 不同处理对土壤微生物生物量碳氮的影响

如图 3所示, 2016和2017年各处理均未显著提高土壤微生物生物量氮含量(P＜0.05), 2016年和2017年各处理较CK分别提高34.33%—80.43%和16.37%—51.43%, 分别为JG4和JG3处理含量最高。2016年土壤微生物生物量碳含量显著高于2017年(P＜0.05), 2016年和2017年各处理较CK分别提高1.31%—2.63%和3.25%—7.07%, 分别为JG4和JG1处理含量最高。

秸秆改善土壤结构, 提高土壤肥力, 促进微生物繁殖与生长, 提高土壤酶活性。各处理微生物生物量碳氮均明显高于CK, 2016年与2017年均表现为JG1和JG4处理微生物量碳氮含量较高, 随还田量增加, 微生物生物量碳氮均呈增加趋势, JG4与JG5处理最佳。由于2017年的高温及降雨影响, 微生物量碳含量显著低于2016年, JG1、JG2与JG4处理微生物生物量氮含量也小幅降低。

2.3 各处理对测序深度及多样性指数的影响

由表 2可知, 各处理的土样OTU数量在3713—3913之间, JG1、JG2与JG5处理OTU数量显著高于CK, 表明秸秆施入土壤提高了细菌多样性, 且JG1处理的总OTU数量最高, 全部处理测序深度指数均达到99%。由表 2可知, 各处理ACE和Chao1数值差异显著, JG1和JG2处理显著提高ACE和Chao1指数, 而JG3、JG4和JG5的ACE和Chao1数值较CK明显降低, 表明秸秆还田会对细菌的丰富度和多样性产生影响, 但其影响程度会因还田量的不同而差异较大。各处理Shannon和Simpson数值差异显著, JG1、JG2和JG3处理二者数值均显著高于CK, JG4和JG5处理显著低于CK(P＜0.05), 表明秸秆还田会对细菌的群落多样性产生影响, 且影响程度与还田量有关。ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数均为JG1处理最高。

基于Weighted Unifrac距离来进行PCoA分析, 并选取贡献率最大的主坐标组合, 结果见图 4。各处理的3个重复距离较接近, 表示同一处理的样品群落结构相似度较高, 而秸秆还田对土壤细菌群落结构的影响因还田量不同差异很大。PC1和PC2两个轴分别解释了44.23%和30.35%的细菌群落变化。各处理土壤细菌群落在分布上存在着不同, JG1和JG3处理、JG4和JG5处理在PC1轴上的投影较为接近, 但与CK处理相距较远, 而JG2和CK处理在PC1轴上的投影接近, 说明秸秆还田量是影响细菌群落变化的主要因素；整体来看, JG2和CK处理的细菌群落结构都分布在中部, JG1处理分布在左侧方, JG3处理分布在上方, JG4和JG5处理分布在右侧方, 说明JG2和CK处理、JG4和JG5处理的细菌群落结构聚集程度最接近。

2.4 各处理对细菌群落构成的影响

如图 5所示, 群落构成其中相对丰度最高的菌门为变形菌门(Proteobacteria), 占33.0%—44.1%, 随后依次是放线菌门(Actinobacteria)23.3%—34.3%、酸杆菌门(Acidobacteria)6.3%—15.1%、拟杆菌门(Bacteroidetes)4.5%—6.9%、绿弯菌门(Chloroflexi)2.3%—4.2%、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)2.5%—4.0%、浮霉菌门(Planctomycetes)0.9%—4.4%、厚壁菌门(Firmicutes)1.0%—2.6%、疣微菌门(Verrucomicrobia)0.8%—1.8%、奇古菌门(Thaumarchaeota)0.2%—0.8%和其他2.8%—3.9%。

秸秆还田各处理变形菌门的相对丰度显著高于CK及JG1处理, 随还田量增加, 其丰度越高。变形菌门包括丰富的固氮细菌, 秸秆还田可提高土壤固氮能力, 与本试验微生物生物量氮及脲酶活性表现一致。放线菌门多为致病细菌, 秸秆还田各处理放线菌门相对丰度显著低于CK及JG3处理, 致病细菌减少, 降低了土壤病害发生概率。厚壁菌门可以抵抗脱水和极端环境, 能够分解土壤中脂肪和碳水化合物等物质, 同时还能抵御外来病原体的入侵。各处理厚壁菌门相对丰度明显高于CK, 较高含量的厚壁菌门可以更好地分解土壤养分, 供玉米吸收利用, 同时提高土壤抵御外来病原体能力。如表 3所示, 与CK相比, 秸秆还田处理提高了厚壁菌门、疣微菌门、变形菌门和拟杆菌门丰度, 且JG4与JG5处理丰度增加最多, 主要包含Fusibacter、Stenotrophomonas、Zoogloea、Desulfovibrio、Pannonibacter与Mangroviflexus等, 出现的新细菌主要涉及固氮、吸磷及改良重金属污染土壤等功能, 此外还有4个属未能注释。

2.5 各处理影响土壤细菌菌群结构的因子分析

图 6的RDA分析表明, 两个主要轴特征值分别为48.33%和19.20%；两个轴相互垂直, 相关系数为0, 说明RDA的排序结果是可信的^[22]。不同秸秆还田量微生物群落变化差异明显, JG4与JG5处理在第一排序轴的正端, 其他4个处理在序轴负端；CK、JG2与JG3处理在第二排序轴的正端, 而JG1、JG4与JG5处理在序轴负端。第一轴排序与微生物生物量碳(相关系数为0.992)、过氧化氢酶(0.989)、脲酶(0.960)、碱性磷酸酶(0.865)与微生物生物量氮(0.728)呈正相关；第二轴排序与脲酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、微生物生物量碳、氮无明显相关性。结果表明影响微生物群落多样性较大的环境因子为微生物生物量碳氮含量及脲酶活性。

3 讨论 3.1 各处理对土壤酶活性及微生物生物量的影响

秸秆还田能提高土壤脲酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性, 且酶活性提高程度与秸秆还田量相关^{[7, 23]}。本研究验证了前人试验结果, 秸秆还田各处理4种酶活性明显高于CK, 且随还田量增加, 土壤酶活性总体上呈上升趋势。秸秆本身含有大量的酶, 施入土壤分解后也可为土壤带来酶和有机物质等, 提升土壤肥力, 提高土壤微生物数量, 微生物的增加又会加快有机物质的分解, 改善土壤环境, 更适合微生物生长与繁殖^[24-25]。研究表明50%秸秆还田处理对微生物量碳、氮的提高作用最明显(P＜0.05), 表明50%秸秆还田量的C/N更适合土壤微生物生存, 土壤微生物数量和活性也随之提高, 又进一步提高土壤酶等分泌物的数量, 酶活性提高又促进微生物分解^[5]。本试验JG4处理微生物生物量碳氮含量均最高, 可能是该还田量下C/N(6.44)更适宜微生物生长。前人研究发现两季秸秆均还田可显著提高土壤微生物量碳氮及酶活性, 翻耕和旋耕两季秸秆还田处理土壤微生物生物量碳含量均显著高于其他处理^[26]。本研究表明, 2016和2017年各处理微生物量碳氮含量均显著高于CK(P＜0.05), 连续秸秆还田土壤微生物量碳及部分处理的微生物量氮含量反而低于2016年, 可能是2017年拔节期干旱少雨而灌浆期持续降雨对土壤水热状况产生影响, 导致微生物量碳氮含量降低。

3.2 各处理对测序深度及多样性指数的影响

从OTU数量可以看出, 各处理特有OTU数量均高于CK与JG3, 且JG1处理OTU数量最多, 表明秸秆还田增加土壤OTU数量, 提高了细菌多样性。高圣超等^[27]研究发现施入有机肥提高了土壤细菌的16S rRNA基因拷贝数, Teixeira等^[28]与其研究结果相似, 本研究结果与前人研究一致。从α多样性指数(Chao1和ACE指数)看出, 秸秆还田对细菌的丰富度与多样性的影响程度因还田量的不同差异较大。可能是土壤环境改变造成的, 秸秆还田能改善土壤性状、增加有机质含量、提升肥力并改善土壤水热状况, 为微生物提供适宜生长环境^[29-30]。分析β多样性指数(Shannon和Simpson指数), 秸秆还田对土壤细菌群落结构的影响因还田量不同差异很大, CK和JG2处理细菌群落结构聚集程度最优, 而与其他各处理差异很大。秸秆还田改变土壤细菌的菌群结构, 对黑土地的发展产生重要影响。

3.3 各处理对细菌群落构成的影响

JG1处理OTU数量最高, 但变形菌门等有益菌丰度较低, 明显提高放线菌门等致病菌丰度；JG4和JG5处理虽然总OTU数量低于CK, 但有益菌丰度明显升高, 致病菌丰度明显降低, 保持了良好的土壤细菌群落结构。变形菌门、放线菌门和酸杆菌门丰度值占所有优势菌门的70%以上, 这与前人研究结果一致^[24]。长期施肥砂姜黑土的细菌群落研究发现, NPK施肥处理降低了土壤细菌群落的多样性^[31], 长期施用化肥降低土壤细菌群落多样性, 结合本研究, 通过秸秆还田或秸秆与无机肥料配施可能提高土壤细菌群落的多样性。本研究表明, 秸秆还田提高土壤变形菌门相对丰度, 提升土壤固氮能力；放线菌门相对丰度减少, 降低土壤遭受病害概率；秸秆还田还提高厚壁菌门相对丰度, 参与土壤养分分解, 供玉米生长所需, 同时提高土壤抵御外来病原体能力。王伏伟等^[32]研究表明, 施肥增加了土壤中放线菌相对丰度, 这与本试验结果相反。Ai等^[33]对31年玉米-小麦轮作土壤细菌菌群分析表明施肥处理嗜酸菌门丰度明显高于CK, 这与本研究结果不同, 原因可能是本试验地为长年玉米连作, 土壤与玉米-小麦轮作有所差异。本试验JG1、JG2处理嗜酸菌门相对丰度高于CK, 而JG3、JG4和JG5处理低于CK。秸秆还田处理较CK新增了Fusibacter、Stenotrophomonas、Zoogloea、Desulfovibrio、Pannonibacter与Mangroviflexus等。其中, Zoogloea属于γ-变形菌纲, 目前国内外大量研究表明Zoogloea是某些区域活性污泥法强化除磷系统中的主要功能菌株之一^[34], 还能够吸收磷, 并将其以多聚偏磷酸盐的形式贮存在细胞中^[35]。近年来, 一些Desulfovibrio物种已经显示出通过还原性生物蓄积过程对有毒放射性核素具有生物修复潜力^[36], 也有研究表明Pannonibacter可适应于高pH、高Cr(Ⅵ)含量污染土壤中的生长^[37], 对改良重金属土壤意义重大。

4 结论

秸秆颗粒还田能显著提高4种土壤酶活性及微生物量碳氮含量；提高了变形菌门和厚壁菌门的相对丰度, 尤以JG4与JG5处理效果最佳；JG3处理放线菌门丰度高于CK, 而其他处理均降低了放线菌门相对丰度；与CK相比, 秸秆颗粒还田处理过程中出现具有固氮、吸磷、改良重金属土壤等特性的细菌, 可见玉米秸秆还田具有重要的生态学意义, 可在一定程度上增加细菌数量和种类多样性, 进而使土壤系统向稳定健康的方向发展。综合研究结果, 在本试验条件下以6750 kg/hm²为较适宜的玉米秸秆颗粒还田量。