近年来我国煤炭开采重心已逐步向西部转移, 陕西北部地区成为全国最主要的产煤基地之一。大规模煤炭资源开采造成了大量采煤沉陷地, 使原本沟壑纵横的黄土高原生态环境更为恶化与脆弱^[1], 选择当地适生的经济作物进行生态治理是采煤沉陷地开展的研究工作之一。黄花菜是本地重要的经济作物, 具有耐瘠、抗旱、入药等特点, 在陕北黄土高原地区被广泛种植。因其花瓣肥厚, 色泽金黄, 香味浓郁, 食之清香、鲜嫩, 爽滑同木耳、草菇, 营养价值高, 是人们喜吃的一种传统蔬菜, 被视作“席上珍品”。近年来由于煤炭开采引起的土地退化使黄花菜根际生态环境遭到严重破坏, 其生长和发育受到严重影响^[2]。

丛枝菌根真菌(Arbuscula mycorrhizal fungi, 简称AM真菌)是自然界中普遍存在的一种能与植物根系形成互惠互利共生关系的土壤微生物^[3], 在干旱、贫瘠的土壤中能够显著增强宿主植物对干旱或贫瘠的抗逆性^[4-6], 从而实现植被恢复, 提高生态系统稳定性的目的。张鑫等^[7]通过调查紫花苜蓿草地中AM真菌与根际土壤性质之间的相关性, 结果发现大同地区AM真菌与紫花苜蓿可以形成良好的共生关系, AM真菌对土壤营养吸收具有重要的作用。李娇清等^[8]通过在自然条件下接种AM真菌, 研究其对煤矸石修复的作用, 结果表明接种AM真菌后植株成活率平均提高30%, 重金属含量显著下降, 土壤中有机质及速效氮、磷、钾含量显著提高, 说明接种AM真菌在煤矸石山中具有较好的土壤修复效应。

黄土沟壑沉陷区由于受地形破碎、土质疏松、降雨集中等自然因素的影响, 水土流失、土地塌陷裂缝现象非常严重, 生态环境脆弱^[9], 生物修复技术已经成为近年来脆弱区生态治理的有效方法。利用AM真菌促进本地生态经济植物黄花菜生长及其土壤改良方面尚未见报道。通过测定AM真菌对黄花菜营养生长状况及根际土壤理化特性、微生物数量的影响, 研究接种AM真菌对当地经济作物的生态修复效应, 不仅对于本地经济作物的恢复及大规模种植, 甚至对于提高当地农民经济收入起到积极作用, 同时也为陕北黄土高原煤矿区受损生态与经济的可持续发展提供理论依据, 具有重要的生态意义。

1 材料与方法 1.1 试验区概况

研究区地处毛乌素沙漠与黄土沟壑区的过渡地带, 位于陕西省神木县柠条塔矿区, 属干旱半干旱高原大陆性气候, 常年干旱少雨, 多风沙, 植被稀疏。年平均降雨量为441 mm, 主要集中于7—9月份, 年均蒸发量为1337 mm, 是降水量的3倍。年平均气温为8.9℃。土壤类型主要为黄土, 土质疏松, 养分贫瘠。本研究所处地区植被退化较为严重, 植物种类主要以一年生狗尾草(Setaria viridis)、黄花菜(Hemerocallis citrina Baroni)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、沙棘(Hippophae rhamniodes)、柠条(Caragana intermedia)等植物为主。

1.2 试验区设计

试验区总面积为11512 m², 分接菌区(简称GM, 以下同)和对照区(简称CK, 以下同)各占一半, 其地形和土质均相近。于2015年5月开始种植黄花菜(daylily, Hemerocallis citrina Baroni), 种植密度16株/m²。供试菌剂由中国矿业大学(北京)微生物复垦实验室自主扩繁培养得到的摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae(简称F.m), 该菌剂为混有菌根根段的砂土等基质材料组成, 其菌丝密度为5.09 m/g。菌剂随黄花菜幼苗种植时一起接入根际周围, 每株接菌20 g菌剂。植株栽培后第一个月内每周浇水一次, 并达到最大持水量, 一个月后不再人工浇水自然生长。

1.3 指标测定

试验分别于2015年8月和10月测定两个试验小区黄花菜菌根侵染、植株生长以及植株生化含量等常规试验指标。每个小区随机选择60个样本测定黄花菜植株的株高、冠幅等生长指标, 随机选择15个样本测定植株叶片的叶绿素含量、氮、磷、钾等营养指标; 在各试验小区随机选取15株黄花菜, 在其根际10—30 cm处采集新鲜土样100 g, 并立即用自封袋密封于4℃冰盒, 并于当天带回实验室放入4℃冰柜冷藏, 用于测定微生物数量和酸性磷酸酶活性。此外, 每个根际土壤样品选取50 g风干, 过2 mm筛后用于分析其理化性质。菌根侵染率的测定采用曲利苯蓝染色法^[10]及根段侵染率加权法^[11]测定。菌丝密度的测定采用网格交叉法^[12]。

黄花菜叶片叶绿素含量的测定采用Konica Minolta公司生产的SPAD-502叶绿素仪测定叶绿素值(Soil and Plant Analyzer Development, 简称SPAD, 以下同), 测定时, 每个小区选取40株, 每株黄花菜选取叶片上、下两层各两片叶子, 每片叶子测10—15个点。取其平均值作为此叶片的叶绿素相对值。光合作用速率的测定采用LI-6400XT便携式光合仪, 时间段选择在9：00—11：00时, 以及14：00—16：00时。测定时选择小区内外形长势相近的植物作为样品, 每个小区选择30株, 每株选择4个方位长势旺盛的叶片, 每个测点重复测3次求平均。可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法^[13], 过氧化氢酶含量测定采用pH 7.8磷酸缓冲液提取粗酶液的分光光度法^[14]。

根际土壤pH值为水土比5：1的玻璃电极-酸度计法, 电导率(Electrical Conductivity, 简称EC, 以下同)为水土比5：1浸提-电导法, 土壤速效磷采用0.5 mol/L NaHCO₃浸提—钼锑抗比色法^[15], 速效钾采用1.0 mol/L NH₄OAc浸提—火焰光度法^[16], 土壤有机质含量的测定采用重铬酸钾外加热方法(K₂Cr₂O₇-H₂SO₄法)^[17]。土壤速效氮含量采用碱解扩散法^[7]。土壤微生物数量的测定采用常规的稀释平板法^[18], 其中, 真菌数量的测定采用孟加拉红培养基, 放线菌数量的测定采用改良高氏一号培养基, 细菌数量的测定采用牛肉膏蛋白胨培养基。酸性磷酸酶活性的测定采用改进的Tabatabai和Brimner法^[19], 酶活性用单位时间每克土产酚量(μg g^-1h^-1)表示。

本文中菌根贡献率的计算采用以下公式^[20]：

2 结果与分析 2.1 黄花菜菌根侵染率及菌丝密度

侵染率反映了菌根真菌与植物根系之间的亲和程度。接菌小区内黄花菜的菌根侵染率达到80%左右, 而对照小区内黄花菜的菌根侵染率只有20%左右(表 1)。接菌区黄花菜根际土壤菌丝密度均高于对照区2.8倍左右, 接种AM真菌极显著提高土壤中菌丝密度, 达到显著性差异。此外, 与8月份相比, 10月份相同处理的黄花菜根际土壤菌丝密度没有显著差异, 可能由于两次监测时间间隔过短, 寄主植物根际土壤菌丝密度的变化量不明显所致。

2.2 接种AM真菌对黄花菜生长量的影响

8月份和10月份接菌处理的黄花菜株高是对照处理黄花菜株高的3—4倍左右(表 1), 达到显著性差异。在8月份和10月份接菌与对照处理黄花菜的冠幅均达到显著性差异, 两次监测时期接菌处理的黄花菜的冠幅是对照组黄花菜冠幅的2.4—2.8倍左右, 说明接种AM真菌对黄花菜的生长起到了显著的促进作用。另外由于两次监测时间间隔较短, 相同处理的黄花菜株高和冠幅在不同月份之间差异不显著。

2.3 接种AM真菌对黄花菜抗逆性影响

8月份和10月份接菌和对照处理的黄花菜叶片的光合速率影响见表 2, 在8月份不同处理间黄花菜叶片的光合速率未达到显著性差异, 而在10月份接菌处理黄花菜叶片的光合速率显著高于对照组, 菌根贡献率达51%, 可能是由于10月份陕北黄土区气温已经下降, 光强较8月份变弱, 而接种AM真菌能在一定程度上减弱光强对植物光合速率的影响, 对促进光合作用起到积极作用。

8月份和10月份不同处理的黄花菜叶片叶绿素含量接菌的处理均高于对照, 但并未达到差异显著水平(表 2), 说明在该野外试验条件下, 接种AM真菌在一定程度上有利于提高黄花菜叶片叶绿素含量, 增强光合产物的生产能力。

比较了10月份接菌和对照处理黄花菜叶片可溶性糖含量(表 2)。接菌组叶片可溶性糖含量显著高于对照, 菌根贡献率达12%。说明接种AM真菌对于黄花菜叶片可溶性糖的合成起到积极促进作用, 增加了黄花菜叶片的抗寒能力。

过氧化氢酶是作物抗氧化防御的一种表现, 接菌和对照处理过氧化氢酶含量如表 2所示。接菌组叶片的过氧化氢酶含量显著高于对照组, 菌根贡献率达79%, 说明在该试验区接种AM真菌能显著促进黄花菜叶片合成过氧化氢酶的能力, 增强了黄花菜抗逆性。

2.4 接种AM真菌对黄花菜根际土壤养分含量的影响

8月份和10月份接菌与对照处理黄花菜根际土壤pH没有显著性差异, 而电导率均显著高于对照处理, 菌根贡献率分别为39%、48%(表 3), 说明接菌处理对改善黄花菜根际土壤盐分含量有一定作用。8月份和10月份相比, 相同处理间差异不明显, 可能与其监测间隔时间较短相关。

8月份不同处理黄花菜根际土壤有机质含量差异不显著, 而在10月份不同处理间达到显著性差异, 菌根贡献率达21%(表 3)。与8月份相比, 10月份接菌与对照处理黄花菜根际土壤有机质含量均有所增加, 说明10月份后气温下降, 早晚温差变大有利于有机质的积累, 接种AM真菌对土壤有机质积累有积极促进作用。

接菌处理根际土壤碱解氮、速效钾含量均显著高于对照处理, 其中碱解氮的菌根贡献率达17%—50%, 速效钾的菌根贡献率为30%—34%(表 3), 说明接种AM真菌能够显著提高该土壤中碱解氮、速效钾的含量。土壤速效磷含量略与对照处理之间没有显著性差异, 接菌处理略低于对照处理, 可能是菌根对磷较为敏感, 接菌促进了植物吸收了较多的土壤磷所致。

2.5 接种AM真菌对黄花菜根际土壤微生物数量及磷酸酶活性的影响

10月份接菌处理的黄花菜根际土壤微生物数量及酸性磷酸酶活性均高于对照组(表 4), 表明菌根真菌能够影响根际土壤微生物的数量与酸性磷酸酶活性。接菌处理对黄花菜根际土壤中真菌、放线菌数量影响不显著, 而土壤细菌数量显著高于对照, 菌根贡献率达77%, 说明接种AM真菌能够显著促进根际细菌的数量, 而对真菌和放线菌数量的影响作用不明显。接菌黄花菜根际土壤酸性磷酸酶活性显著高于对照, 菌根贡献率为24%, 说明接种AM真菌能显著提高黄花菜根际土壤酸性磷酸酶活性, 促进了土壤速效磷的高效利用。

3 讨论

本文研究了接种AM真菌对陕北柠条塔黄土沟壑采煤沉陷扰动区黄花菜生长及土壤改良的影响。黄花菜是当地农民普遍选种的一种经济植物, 近年来随着采煤沉陷对土地的破坏与扰动, 黄花菜的生存环境受到了很大的干扰, 幼苗成活率低。接种菌根真菌显著提高了黄花菜的生长, 一定程度上改善了黄花菜根际土壤养分状况, 改善提高了品质和抗逆性。为黄土沟壑沉陷区扰动土地的微生物修复技术应用提供了较好的研究思路, 具有普遍的现实生态意义。

对照区黄花菜根有一定的菌根侵染率和菌丝密度, 自然状态下土壤中存在土著AM真菌, 野外人工接种AM真菌对于加速生态修复具有积极意义。接种AM真菌能够扩大植物根系吸收面积^[21]、增加根系内营养与水分的运输速度^[22], 促进植物生长, 改善植物对磷、锌、钙、镁等矿物质营养元素的吸收^[23-24]。8月份和10月份接菌处理的黄花菜株高、冠幅均显著高于对照组, 对于黄花菜的生长起到显著的促进作用, 这可能是由于菌根菌丝扩大了黄花菜根系与土壤的接触面积, 促进了黄花菜根系对土壤中水分和矿物质养分的吸收, 长势明显, 与在采煤沉陷区接种AM真菌的沙蒿^[25]、柠条^[26]和紫穗槐^[27]均表现出相同的生长规律。

黄土丘陵土壤养分贫瘠, 气候干旱, 采煤沉陷频发又加剧了贫瘠及干旱等逆境胁迫。在土壤养分贫瘠、气候干旱、入秋早温差大的煤矿塌陷区, 接种AM真菌可以显著提高寄主植物的抗旱寒性等逆境的适应性, 改善其品质^[28]。植物的抗旱能力与其体内的可溶性糖含量密切相关^[29], 过氧化氢酶作为抗氧化剂, 可为作物组织提供抗氧化防御能力^[30]。接种丛枝菌根真菌显著提高黄花菜叶片光合速率, 可能是接种菌根激活了黄花菜叶片的气孔开关^[31], 也可能是由于菌根菌丝加强了黄花菜根系对土壤中水分和其他矿物质养分的吸收和转运, 使之有利于接菌组黄花菜叶片的气体交换, 从而提高植物叶片的光合速率^[32]。接菌处理黄花菜叶片可溶性糖含量与过氧化氢酶含量均显著高于对照处理, 菌根贡献率分别达到12%和79%, 与前人的研究结果一致^[33], 可能是在土壤养分和水分贫瘠的采煤沉陷区, 菌根真菌可以通过增加宿主体内的可溶性糖含量来降低渗透势, 以维持植株体内的水分含量^[34]。说明在煤炭开采强烈干扰区接种真菌可以显著提高黄花菜植株的可溶性糖与过氧化氢酶含量, 从而增强黄花菜在干旱贫瘠地区的生长适应能力, 提高品质。

由于陕北黄土沟壑采煤沉陷区水土流失严重, 土壤中普遍缺乏有机质以及氮、磷、钾等矿物质元素^[35]。接菌处理对黄花菜根际土壤的电导率值显著高于对照组, 显著提高了黄花菜根际土壤的有机质、碱解氮、速效钾含量, 这说明接种AM真菌改善了黄花菜根际土壤的微环境, 促进了根际土壤中矿物质养分的活化, 改良了土壤肥力, 从而促进黄花菜植株的生长和根际微环境的改善。这对黄土沟壑采煤沉陷区受损的生态系统恢复到自然生态系统的良性循环具有重要的意义。这一结论与王瑾等^[36]在神东采煤沉陷区利用紫穗槐接种丛枝菌根真菌促进根际土壤的速效磷、碱解氮、有机质含量等增加的规律一致。

土壤性状改善反过来促进了黄花菜根际土壤微生物群落的生长和新陈代谢, 土壤中微生物主要参与有机质的分解、腐殖质的形成、土壤养分转化等过程, 土壤中的酶活性及土壤中微生物数量的变化不仅可以敏感地反映土壤质量及其物质代谢的旺盛程度^[37-38], 而且也是土壤生物活性的具体体现^[39]。接种AM真菌显著提高了黄花菜根际土壤中的真菌、放线菌、细菌及磷酸酶活性, 表明AM真菌对刺激土壤中微生物的生长有一定的促进作用, 与王瑾^[33]和马源^[40]等研究结果类似。接菌后微生物数量及酶活性的增加, 一定程度上反映了接菌区土壤质量改善^[41], 这对于黄花菜根际土壤微生态环境的改良起到积极促进作用, 使得黄土沟壑采煤沉陷区的生态系统具有向多样性发展的潜力。