文章信息
- 张顺, 林施泉, 孟凡旭, 吴敏, 许学伟, 王春生
- ZHANG Shun, LIN Shiquan, MENG Fanxu, WU Min, XU Xuewei, WANG Chunsheng.
- 太平洋克拉里昂-克利伯顿断裂带嘴刺目线虫多样性
- Nematode (Enoplida) diversity in sediment samples collected from the Clarion-Clipperton Fracture Zone
- 生态学报. 2017, 37(5): 1630-1638
- Acta Ecologica Sinica. 2017, 37(5): 1630-1638
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201509181920
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文章历史
- 收稿日期: 2015-09-18
- 网络出版日期: 2016-07-13
2. 浙江大学生命科学学院, 杭州 310058
2. College of life sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
自由生活海洋线虫属于线虫动物门, 记录种约4000种, 但尚有大量种类未被鉴定, 估计全球线虫物种数量超过2万种[1]。海洋线虫是最丰富的后生动物类群, 分布广、数量多。在多数生境中海洋线虫丰度可占后生动物数量的70%—90%;在某些生境中, 如有机质丰富的沉积物中, 可达90%以上[2]。在底栖食物链中, 海洋线虫是较高级生物的食物来源, 同时也影响低级生物群落组成, 在食物链中具有承上启下作用[3]。
早期Filipjev以侧器作为主要性状, 其它性状为补充, 建立了线虫分类系统。首次提出包括当时已知全部种的海洋线虫分类系统, 将线虫划分为1个纲11个目, 并首次对线虫起源进行了讨论, 提出线虫共同祖先是嘴刺目海洋线虫的观点[4]。依据WORMS[5]最新数据, 嘴刺目线虫包含14科, 20属, 1742种。嘴刺目是体长较长的海洋线虫类群, 某些种类可达数毫米。研究表明, 嘴刺目线虫是活跃的捕食者 (在形态学分类单元上, 有多个科的线虫具有排列复杂的齿), 在小型底栖动物群落内具有重要的生态功能。然而, 相对于陆生和寄生线虫, 海洋嘴刺目线虫进化关系鲜有研究[1, 6-7]。
形态学鉴定准确度受到多种因素影响, 例如, 不同生境中的同种线虫可表现出不同的外形特征, 仅通过形态学特征将线虫鉴定到种水平难度大, 线虫鉴定缺乏快速准确的技术方法。尽管线虫分类研究历史已有上百年, 然而依然缺乏用于高级分类单元 (如科以上分类单元) 系统发育重建的同源形态性状的客观标准。
DNA条形码 (又称分子条形码) 技术是通过对某一类DNA序列进行分析达到区分物种目的的技术。DNA条形码在运用于海洋线虫研究中, 有两类分子标记显示出较高的价值, 分别是核糖体小亚基序列 (SSU rDNA) 和核糖体大亚基序列 (LSU rDNA), 其中核糖体小亚基序列在多数线虫系统发育分析中具有普遍适用性。其半保守序列可用来研究科以上分类单元的系统发育关系, 其可变区序列能在科或属的水平上将线虫区分, 甚至在种水平上区分不同的种类[8]。同时由于其序列包含较多的系统发育信息、较少的多态性, 因此在揭示不同分类单元遗传关系时也非常有效。核糖体大亚基序列作为分子标记用于线虫鉴定的历史只有20多年, 主要集中于D2或D3延伸片段[9], 此分子标记具有显著的种内多态性, 在区分某些类群的不确定种时具有较高价值, 为系统发育分析提供遗传信息。其他分子标记, 如转录间隔区 (ITS) 和线粒体基因 (COI), 也曾应用于线虫分类研究, 但其具有较高的种内变异性、大量插入, 使比对工作较为困难[10], 序列极难扩增。以往研究表明, 形态学分类和DNA分子条形码鉴定结果之间存在较高的一致性[11-12]。
克拉里昂-克利伯顿断裂带富含多金属结核, 具有重要经济价值。国际海底管理局承担了保护海洋环境免受破坏和过度开发的使命。为了顺利完成这一任务, 需要对海洋生物进行研究。线虫作为海洋底栖生物的主要类群, 其群落结构变化可反映环境变化。嘴刺目线虫是深海线虫最重要的类群之一, 形态学资料较为齐全[1], 已发布的核酸序列较多。然而以往关于嘴刺目线虫的研究主要集中于近海潮间带海滩[13], 深海 (如CC区) 线虫研究报道鲜见, 研究方法主要采用形态学分类法, 分子技术应用少[14-15]。本研究结合形态学分类和分子生物学方法, 研究CC区嘴刺目线虫的多样性, 以期能初步探知该区嘴刺目线虫类群组成, 并对其遗传关系进行探讨。
1 研究方法 1.1 样品采集分离和鉴定采用箱式 (9 cm Ø 61 cm, BC) 和多管 (MC) 取样的方式从太平洋CC区4个站位采集沉积物样品 (表 1), 立即固定于DESS溶液 (20%的二甲基亚砜, 0.2 M乙二胺四乙酸二钠, 加入氯化钠使溶液饱和, pH 8.0)[16]。
站位 Sites | 经度 (W) Longitude | 纬度 (S) Latitude | 采样日期 Date | 采样方法 Methods | 站位深度/m Depth |
BC05 | 146°53′27″ | 08°26′59″ | 2013-08-25 | 箱式 | 5217 |
BC06 | 144°56′4″ | 07°30′58″ | 2013-08-31 | 箱式 | 5062 |
MC03 | 154°04′19″ | 10°02′47″ | 2013-09-07 | 多管 | 5140 |
MC12 | 154°14′0″ | 10°10′1″ | 2013-09-08 | 多管 | 5193 |
BC:箱式取样器Box-Corer; MC:多管取样器Multi-Corer |
沉积物先用孔径为38 μm的滤网过滤, 再用LudoxTM(密度为1.18 g/mL) 重悬浮[17]。在解剖显微镜下, 将线虫 (嘴刺目) 样本转移到载玻片上, 制备线虫临时玻片。在显微镜 (Leica DM5500) 下用微分干涉和相差模式对线虫形态进行观察、拍照和测量。形态学鉴定主要依据Gerlach、Rieman和Lorenzen的方法[18-20]。显微观察后, 为了防止线虫基因组降解, 立即提取线虫基因组[21]。
1.2 DNA提取、PCR扩增、鉴定线虫从玻片分离, 用无菌水清洗3次, 清除线虫表面的化学试剂和其它杂质。依据线虫的大小, 将线虫切成几段并转移至0.5 mL的PCR管中, PCR中含有20 μL线虫裂解液 (WLB)(50 mmol/L KCl, 1% Gelatin, 10 mmol/L Tris-Cl pH 8.2, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.45%(v/v) Tween 20, 60 μg/mL蛋白酶K)。线虫样品在-70℃冻融15 min, 65 ℃消化1 h以上去除蛋白质, 95 ℃处理15 min使蛋白酶K失活。冷却至室温后, 于13000 r/min离心1 min。上清液即可作为PCR模板, 用于两种片段 (片段长度分别为~990 bp的18S rRNA gene和~260 bp的28S rRNA gene D3区) 扩增。18S rRNA gene用988F (5′-CTCAAAGATTAAGCCATGC-3′) 和1912R (5′-TTTACGGTCAGAA CTAGGG-3′) 引物对扩增[22]。28S rRNA基因D3区使用引物对D3a (5′-GACCCGT CTTGAAACACGGA-3′)、D3b (5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′) 扩增。50 μL PCR体系包括ddH2O 34.5 μL、10×Ex buffer 5 μL、引物各2 μL (10 μM)、dNTP (每种2.5 mmol/L)4 μL、Ex Taq (Takara, 5 U/μL)0.5 μL、模板DNA 2 μL。PCR反应条件为:98℃变性10 s, 退火30 s, 72℃延伸1 min, 循环40次, 72 ℃延伸10 min。引物对988F、1912R的退火温度为49 ℃, 引物对D3a、D3b的退火温度为54 ℃。
PCR产物用2%的琼脂糖电泳检测、纯化后, 连接到pMD19-T, 有插入片段的单克隆送铂尚生物技术 (上海) 有限公司测序。
1.3 数据分析从GenBank网络数据库下载相关序列, 使用MEGA5软件包内置的Clustal W[23]对序列进行比对, 然后使用邻接法、最大似然法和最大简约法构建系统发育树。其中邻接法为双木村双参数模型, 最大似然法 (ML) 采用田村3参数模型, 其他参数为:G+I。最大简约法 (MP)、最大似然法 (ML) 和邻接树 (NJ) 自举值:MP和NJ为1000, ML为100。
2 研究结果 2.1 形态学鉴定从CC区4个站位分离获得26个嘴刺目线虫个体 (图 1), 分属6个科 (表 2和表 3), 线虫中文学名依据文献[24]。其中, 尖口线虫科线虫15条 (占线虫总数的57.7%), 包括Oxystominasp.1条、Halalaimussp.13条及无法鉴定到属的线虫1条;前感线虫科线虫5条 (19.2%), 均为Anticomasp.;光皮线虫科线虫2条 (7.7%), Phanodermopsissp.和Crenopharynxsp.各1条;钩线虫科线虫2条 (7.7%), 均为Viscosiasp.;烙线虫科线虫1条 (3.4%), 为Syringolaimussp.;矛线虫科线虫1条 (3.4%), 为Bathyeurystominasp.。
科Family | 属Genus | 站位Site | 数量Numbers | 18S rRNA基因 | 28S rRNA基因 |
光皮线虫科 | Phanodermopsis | BC05 | 1 | 1 | 0 |
Crenopharynx | MC12 | 1 | 1 | 1 | |
尖口线虫科 | Oxystomina | BC05 | 1 | 1 | 0 |
Halalaimus | BC05 | 1 | 1 | 0 | |
Halalaimus | BC06 | 1 | 0 | 0 | |
Halalaimus | MC03 | 3 | 0 | 0 | |
Halalaimus | MC12 | 8 | 3 | 3 | |
Oxystominid | MC03 | 1 | 0 | 0 | |
矛线虫科 | Bathyeurystomina | MC12 | 1 | 1 | 1 |
钩线虫科 | Viscosia | BC06 | 1 | 0 | 1 |
Viscosia | MC12 | 1 | 0 | 1 | |
前感线虫科 | Anticoma | BC05 | 4 | 0 | 0 |
Anticoma | MC12 | 1 | 0 | 1 | |
烙线虫科 | Syringolaimus | MC12 | 1 | 0 | 0 |
总计Total | 26 | 8 | 8 | ||
本次研究的烙线虫科未获得核酸序列 |
站位 Sites | 物种 Species | 性别 Sex | 长度 Length/ mm | de Man比值de Man ratios | 食道长度 Oesophagus length | 最大直径 Maximum diameter | 尾长 Tail length | ||
a | b | c | |||||||
BC06、MC12 | Viscosiasp. | J | 1773 | 37 | 6 | 9.5 | 298.5 | 48.5 | 190.6 |
MC03 | Thalassomonhysterasp. | M | 254 | 20 | 6 | 4 | 41.4 | 12.6 | 57.5 |
J | 492 | 27 | 7 | 11 | 39.3 | 18.3 | 45.4 | ||
F | 725 | 28 | 17 | 2 | 42.9 | 25.3 | 314.2 | ||
MC12 | Syringolaimussp. | J | 1166 | 40 | 3 | 9 | 375 | 29.1 | 126.7 |
BC05 | Phanodermopssp. | J | 906 | 22 | 8 | 4 | 112.7 | 40.8 | 226.5 |
MC03 | Oxystominid | J | 205 | 14 | 3 | 3 | 67.3 | 14.1 | 81.4 |
BC05 | Oxystomina sp. | J | 1091 | 54 | 12 | 12 | 91.4 | 20.2 | 92.6 |
MC03、MC12 | Halalaimussp1 | M | 1518 | 52 | NA | 7 | 381.8 | 32.6 | 294.3 |
MC03 | Halalaimussp1 | F | 1100 | 56 | 4 | 17 | 247 | 19.4 | 66.3 |
BC05、BC06 MC03、MC12 | Halalaimussp1 | J | 940 | 42.7 | 4.5 | 6.3 | 273.2 | 26.0 | 204.9 |
MC12 | Halalaimussp2 | J | 1421 | 39 | 15 | 8 | 93.8 | 36.8 | 176 |
MC12 | Crenopharynxsp. | J | 1473 | 18 | 4 | 4 | 363.1 | 82.4 | 386.9 |
MC12 | Bathyeurystomina sp. | J | 1498 | 29 | 4 | 10 | 373.5 | 51.4 | 154.6 |
BC05、MC12 | Anticomasp. | J | 944.8 | 22.6 | 7.8 | 9.4 | 154.1 | 45.9 | 108.1 |
M:雄性male;F:雌性Female;J:幼体Juvenile;de Man比值, a=全长/最大体宽; b=全长/食道长; c=全长/尾长;如有多条线虫, 则a、b、c取平均值;-NA:数据无法获得not available |
箱式采样站位 (BC站) 和多管采样站位 (MC站) 均为2个采样点。BC站和MC站共有的嘴刺目线虫包括剑口线虫科、前感线虫科、钩线虫科和光皮线虫科。BC站样品中, 前感线虫科为最主要类群;MC站样品中, 剑口线虫科为主要类群。烙线虫科和矛线虫科仅在MC站样品中发现, 比例为10%。
形态学测量值上, 嘴刺目线虫体长一般在1 mm以上, 其中最长线虫Viscosiasp.体长约1.8 mm, 最短的线虫Oxystominid长度仅为0.2 mm。在尾长方面, Crenopharynxsp.最长, Thalassomonhysterasp.最短 (表 3)。
2.2 18S和28SrRNA基因序列采用分子生物学方法, 共获得16条DNA序列 (18S rRNA基因序列和28S rRNA基因序列各8条, 表 2)。序列已经提交到GenBank, 基因登陆号为KR0811950-KR0811957和KR0811958-KR0811965。18S rRNA基因序列片段长度约为991 bp, 其可变区比例低于保守区, 具有较高的保守性。28S rRNA基因序列片段长度为306 bp, 可变性区比例高于18S rRNA基因 (表 4)。序列与数据库比对后均可确定到科的水平和84.6%属的水平。尚有少量18S和28S rRNA基因序列在数据库中无法搜索到相近的线虫核酸序列, 表明部分种类的线虫核酸序列尚未纳入核酸数据库中, 线虫分子数据尚需补充。
基因Gene | 18S rRNA gene | 28S rRNA gene | |
碱基长度Alignment size/bp | 991 | 306 | |
可变区Variable region /bp (%) | 275 (27.7) | 109 (35.6) | |
保守区Conservative region /bp (%) | 704 (71.0) | 194 (63.3) | |
简约信息位Parsimony informative /bp (%) | 166 (16.8) | 83 (27.1) | |
碱基频率Nucleotide frequencies/% | A | 0.28 | 0.27 |
T | 0.27 | 0.22 | |
C | 0.19 | 0.21 | |
G | 0.26 | 0.30 | |
碱基长度包括空位, 可变区包括缺失片段; 碱基频率A, 腺嘌呤Adenine; T, 胸腺嘧啶Thymine; C胞嘧啶Cytosine; G鸟嘌呤Guanine |
采用NJ、MP或ML法进行基于18S和28S rRNA基因序列的系统发育分析结果显示, 不同方法构建的系统发育树分支结构基本一致 (图 2)。28S rRNA基因序列的系统发育树中, 钩线虫科和矛线虫科聚类在一起, 光皮线虫科和前感线虫科聚类在一起, 分别显示出其彼此间较近的遗传关系。
2.4 形态学与分子数据比较分析本研究获得的分子序列与GenBank数据库中的序列相似性为94%—99%(表 5), 分子条形码比对结果和形态学鉴定结果有较高的一致性。在科水平上, 所有DNA条形码比对结果和形态学鉴定结果一致;在属水平上, 87.5%的线虫DNA条形码比对结果与形态学鉴定结果一致。
线虫编号 ID | 形态学鉴定 Morphological identification | 18S rRNA基因相似性 Similarity of 18S rRNA gene | 28S rRNA基因相似性 Similarity of 28S rRNA gene | |||||
科 Family | 属 Genus | 属 Genus | 相似性/% Similarity | 属 Genus | 相似性/% Similarity | |||
BC05-6 | Oxystominidae | Halalaimus | Halalaimus | 99 | ||||
BC05-7 | Oxystominidae | Oxystomina | Oxystomina | 99 | ||||
BC05-22 | Phanodermatidae | Phanodermops | Phanodermatid | 99 | ||||
MC12-3 | Phanodermatidae | Crenopharynx | Phanoderma | 99 | Phanoderma | 94 | ||
MC12-5 | Enchelidiidae | Bathyeurystomina | Bathyeurystomina | 99 | Bathyeurystomina | 99 | ||
MC12-20 | Oxystominidae | Halalaimus | Halalaimus | 98 | ||||
MC12-1 | Oxystominidae | Halalaimus | Halalaimus | 98 | Halalaimus | 98 | ||
MC12-12 | Oxystominidae | Halalaimus | Halalaimus | 99 | ||||
MC12-2 | Oncholaimidae | Viscosia | Viscosia | 98 | ||||
MC12-7 | Oxystominidae | Halalaimus | Halalaimus | 99 | ||||
MC12-8 | Oxystominidae | Halalaimus | Halalaimus | 99 | ||||
MC12-9 | Anticomidae | Anticoma | Anticomid | 99 | ||||
BC06-1 | Oncholaimidae | Viscosia | Viscosia | 98 | ||||
MC12-10 | Ironidae(1) | Syringolaimus | ||||||
(1) 未获得核酸序列 |
本次研究围绕CC区嘴刺目线虫开展, 科水平上, 尖口线虫科数量最多, 烙线虫科数量最少, 属水平上, Halalaimus是主要的属, 这与Lambshead等人研究结论一致[14]。此外, 本次研究发现光皮线虫科线虫2条, 占线虫总数的6.9%, Phanodermopsissp.和Crenopharynxsp.各1条, 这在以往CC区线虫研究文献中鲜见[14-15]。上述结果表明, CC区尚有部分线虫种类未被发现, 该区嘴刺目线虫多样性需进一步研究。
本研究中, 所获得的线虫两种rRNA基因序列 (18S rRNA和28S rRNA基因) 与GenBank数据库中的序列相似性为94%—99%(表 5), 分子条形码比对结果和形态学鉴定结果具有较高一致性, 表明分子条形码技术是海洋自由生活线虫快速鉴定的有效手段。18S rRNA基因由于保守性较高, 常用于高级分类单元的系统分析;28S rRNA基因往往表现出较高变异性、难以确定不同类群同源性及高级分类单元的遗传关系, 研究者通常采用28S rRNA基因序列研究线虫属或更低分类水平之间的遗传关系[11]。形态学方法由于步骤繁琐、鉴定耗时长, 影响线虫基因组完整性, 从而降低PCR扩增效率[21]。同时, 在PCR扩增过程中, 容易扩增获得真菌或细菌序列。此外, DNA制备技术对线虫序列获取效率具有影响, 例如碱裂解法制备的基因组容易扩增获得真菌序列, 这在研究线虫与微生物之间关系方面具有一定价值。
DNA条形码技术是通过使用DNA基因片段作为条形码来对物种进行快速、准确识别的技术。它主要具有两个作用:1、利用已知种类对未知种类辅助鉴定;2、辨别往期研究种类之间的不同。对于研究充分、采样全面、基因和形态广泛研究的类群, DNA条形码显示出较高的价值, 特别是在已知种类对未知种类的辅助鉴定方面。本次研究中, 经形态鉴定, MC12-1号线虫属于Halalaimus属, 但与其他Halalaimus属的线虫存在显著差异;系统发育分析上, MC12-1号线虫与其他Halalaimus属线虫归为同一类群, 但形成不同分支, 表现出一定的遗传分化。这显示出DNA条形码在形态学鉴定结果的补充上具有一定价值。
DNA条形码应用于海洋线虫鉴定中需要以下几步:(1) 创建海洋线虫综合条形码数据库;(2) 需要成熟方法, 新的类群能比对和匹配到数据库中已有数据, 或能进行有效补充;(3) 条形码需要与分类学数据结合, 应用于生物种类确定。截至2015年7月, GenBank数据库有104个属、150个种共计600多条海洋线虫条形码序列[25]。其中41种海洋线虫序列属于嘴刺纲, 109种属于色矛纲。嘴刺纲和色矛纲中, 分子序列 (SSU/LSU/COI) 最多的是钩线虫科和色矛线虫科, 它们包含的种均不超过20个;而Oncholaimus属仅包含了30种已经描述的种。与现有线虫多样性相比, 具有分子数据的海洋线虫较少。为促进DNA条形码准确性, 需增加不同种类海洋线虫的分子序列数据。
采用分子生物学方法对CC区嘴刺目线虫研究鲜有报道。依据近期嘴刺目线虫分子系统发育分析[1, 26], 嘴刺目线虫主要分为5大分支:(1):杆咽科 (Rhabdolaimidae);(2):无咽科 (Alaimidae) 和烙线虫科;(3):似三孔线虫科 (Tripyloididae) 和长尾线虫科 (Trefusiidae);(4):尖口线虫科、钩线虫科和矛线虫科;(5):腹口线虫科 (Thoracostomopsidae)、嘴刺线虫科 (Enoplidae)、光皮线虫科、狭线虫科 (Leptosomatidae)、烙口线虫科、裸口线虫科 (Anoplostomatidae) 和前感线虫科。本研究结果显示, 采用18S和28S rRNA基因分别构建系统发育树, 运用不同建树方法, 获得的系统发育树拓扑结构基本一致。遗传分析结果显示, 钩线虫科和矛线虫科, 遗传关系较近 (NJ、ML和MP法分别为:100%、100%和99%), 这和形态学分类一致, 它们都归为钩线虫超科 (Oncholaimoidea), 与往期结果一致, 钩线虫超科为单系群;尖口线虫科所包含的属, 在本次系统发育树中的拓扑结构不稳定, 表明尖口线虫科可能为并系群, 其中属之间关系需要进一步研究;光皮线虫科和前感线虫科的遗传关系较近 (NJ、ML和MP法分别为:99%、98%和98%), 可归为嘴刺线虫超科 (Enoploidea), 关于其是否为单系群或并系群, 以往争议多, 本次研究支持其为单系群。为了确定线虫的遗传关系, 后期的研究可以使用合并的序列 (18S和28S rRNA基因) 进行系统发育分析或开展多基因综合分析, 并参考口器等形态学特征。
分子条形码技术缺点是缺乏通用引物, 导致核酸序列扩增效率不高。因此, 未来线虫分子鉴定一方面需要设计或寻找更合适的引物、新的基因位点和采用宏基因组分析等新技术;另一方面需要改进形态学分析方法, 如视频采集与编辑方法 (VCE)[27]。未来对深海嘴刺目线虫的研究不仅要有形态分类和种群遗传关系研究, 还需要结合形态可视化技术, 如串型玻片扫描电镜、三维重建[28]、共聚焦成像和肌肉组织功能分析[29], 增进对线虫形态学进化和功能多样性的了解。综合运用形态学和分子生物学的方法将有助于探知生物类群的同形种 (Cryptic species), 提升对海洋线虫生物多样性的认识, 完善线虫的分类体系。
4 结论CC区嘴刺目线虫科水平上, 尖口线虫科数量最多, 烙线虫科数量最少;属水平上, Halalaimus属是优势属。本次研究发现的光皮线虫科线虫在以往CC区线虫研究文献中鲜见。这表明, CC区尚有部分线虫种类未被发现, 该区嘴刺目线虫多样性需进一步系统研究。所获得的分子序列与数据库中的序列比对结果显示, DNA条形码比对结果和形态学鉴定结果有较高一致性, 表明DNA条形码技术可作为深海线虫鉴定的有效手段。基于18S和28S rRNA基因序列, 采用不同方法构建系统发育树, 其分支结构基本一致;钩线虫科和矛线虫科聚类在一起, 光皮线虫科和前感线虫科聚类在一起, 显示出彼此间较近的遗传关系。
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