氮素通过降雨或降尘的形式从大气中移除并降落到地表的过程称为氮沉降,它同生物固氮、氮的矿化并称为生态系统中氮素的三大来源,是氮素生物地球化学循环中的重要环节^[1]。19世纪后期以来,随着人类进入工业化社会,化学氮肥的生产和使用,矿物燃料的燃烧,以及畜牧业迅猛发展导致NH₃和NO_x(NO+NO₂)的大量排放,使得大气中的Nr(活性氮,reactive nitrogen)浓度持续升高,人为干扰下的大气氮素沉降已成为全球氮素生物化学循环的一个重要组成部分^[2-4]。大气氮沉降作为营养源与酸源,其数量的急剧变化将严重影响陆地及水生生态系统的生产力和稳定性^[5],因而成为各国公众和科学家广泛关注的科学问题。如今北美、西欧和东亚(我国)已成为全球三大氮沉降热点地区^[6]。目前,我国氮沉降临界负荷最低(＜10 kg hm^-2 a^-1)的地区分布在青藏高原西部和阿拉善高原,而临界负荷最高(＞40 kg hm^-2 a^-1)的地区则在东北平原、华北平原、长江中下游平原以及四川盆地等^[7]。

森林土壤微生物活性是土壤性质的重要组成部分,而三大类微生物数量则是土壤微生物活性高低的重要指标之一。过量氮输入会导致土壤微生物数量发生变化。Wallenstein^[8]在研究哈佛森林氮沉降对其森林土壤微生物影响中发现,真菌/细菌随施氮水平增加而减少。薛璟花等^[9]通过对3个不同林分进行3种不同水平氮沉降后发现,氮沉降可以促进土壤微生物总的数量,且细菌、放线菌的数量与氮沉降水平成正相关,但超过中氮施用水平后,对放线菌作用将转为抑制,整个过程中,真菌数量与氮沉降水平成负相关。但也有研究表明,过量氮沉降对细菌数量的影响并不显著^[10-11]。由于实验林分的不同和检测手段的不一致,也有学者认为过量氮沉降抑制了细菌数量^[12]。多数研究认为氮沉降会抑制真菌数量^[12-13],也有研究认为氮沉降对真菌数量有促进作用^[13],这可能与土壤酸化程度和氮沉降水平有关。可见,氮沉降对森林土壤微生物数量的影响还存在很大的不确定性。

华西雨屏区位于四川盆地西缘,由于受邛崃山脉地形的影响,形成四川盆地西部的一个多雨狭长地带^[14],这使得该地区的湿沉降尤为明显,使其成为研究氮沉降的天然实验室^[15]。有研究表明,华西雨屏区全年总N沉降量为95 kg N hm^-2 a^-1,并有逐年上升的趋势^[15]。氮沉降的持续增加,势必会影响该区森林生态系统的结构和功能,为了解氮沉降是否会影响该区常绿阔叶林土壤微生物数量,影响程度如何,本文以华西雨屏区天然常绿阔叶林为对象,通过模拟大气N沉降,研究了大气N沉降对该区最为典型的常绿阔叶林生态系统土壤微生物数量的影响,有助于理解全球环境变化背景下华西雨屏区森林生态系统土壤微生物对氮沉降的响应,为研究该区天然常绿阔叶林生态系统物质循环提供理论依据,并为森林生态系统经营管理提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验地概况

研究区位于四川省雅安市雨城区碧峰峡风景区(102°90′E,29°40′N),海拔高度977.62 m,≥ 10℃年积温5231℃,年均气温为16.2℃,最冷月为1月,平均气温6.1℃,最热月为7月,平均气温25.4℃。日照长度为1039.6 h,全年太阳辐射总量为3640.13 MJ/cm²。无霜期为304 d,年平均降水量1772.2 mm,年蒸发量为1011.2 mm。气候温和湿润,属亚热带湿润季风型山地气候。实验区内植物种类丰富,群落结构复杂。主要树种有木荷(Schima superba)、硬斗石栎(Lithocarpus hancei)、海桐(Pittosporum tobira)、润楠(Machilus pingii)、总状山矾(Symplocos botryantha)、柃木(Eurya japonica)、青榨槭(Acer davidii)、大叶石栎(Lithocarpus megalophyllus)、野漆(Rhus succedanea)、深裂中华槭(Acer sinense)、利川润楠(Machilus lichuanensis)、肉桂(Cinnamomum cassia)和山茶(Camellia japonica)等^[16]。土壤类型以黄壤为主,土壤厚度大于60 cm,立地条件基本一致。0—20 cm土层土壤全C含量为(17.17±1.54) g/kg、全N含量为(1.14±0.13) g/kg、硝态氮含量为(9.45±1.03) mg/kg,铵态氮含量为(6.87±0.56) mg/kg,pH值为6.21±0.13。

1.2 试验设计

2013年10月在四川省雅安市雨城区碧峰峡选择具代表性的天然常绿阔叶林作为研究对象,在研究对象内建立12个3 m×3 m的样方,每个样方间设>3 m的缓冲带。华西雨屏区全年总N沉降量为95 kg N hm^-2 a^-1,并有逐年上升的趋势^[15]。据此本试验设置4个N沉降水平,即对照(CK,0 kg N hm^-2 a^-1)、低氮沉降(L,50 kg N hm^-2 a^-1)、中氮沉降(M,150 kg N hm^-2 a^-1)和高氮沉降(H,300 kg N hm^-2 a^-1),每个水平3个重复。将施氮量平均分成24等分,从2013年11月10日起,每15 d用NH₄NO₃进行模拟氮沉降。施氮的方法是将每个样方所需NH₄NO₃溶解在2 L水中,用手提式喷雾器在林地样方50 cm高度来回均匀喷洒,对照样方喷施2 L水以减少因外加水而造成对森林生物地球化学循环的影响^[16]。

1.3 土壤样品的采集及制备

于2014年3月、6月、9月和12月采集土样,在各标准地中内随机设5个土壤采集样点,去除土壤表层的苔藓、枯枝落叶后,用土钻采集样地内0—10 cm和10—20 cm土层的土壤,用无菌袋收集。回实验室后立即去除可见动植物残体和根系,将每一处理内相同层次土样混合均匀,过2 mm筛后,放入冰箱在4℃下保存待测。

1.4 指标测定方法

土壤中可培养细菌、真菌和放线菌数量采用稀释平板法^[17],细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基、真菌采用马丁氏培养基、放线菌采用高氏1号培养基培养7—15d,结果以每克干土所含微生物菌落(cfu/g干土)表示。所有化学分析均作3个重复。本研究中土壤微生物总量仅为真菌、细菌和放线菌3种可培养微生物类群的总量。

1.5 数据分析

利用Excel 2007和SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)对各处理土壤微生物数量方差分析,采用最小显著差异法(LSD)检验施氮处理、采样时间和土壤层次及它们的交互作用对土壤微生物数量的影响,显著性水平设定为α= 0.05。利用Excel 2007软件作图。图中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析 2.1 模拟氮沉降对微生物总量的影响

由图 1可知,CK处理0—10 cm土层微生物总量大于10—20 cm土层,氮沉降未改变这种垂直分布格局。各处理土壤微生物总量有明显的季节动态(表 1) ,在0—10 cm和10—20 cm土层表现为秋季最高,夏季较低。与CK处理相比,氮沉降未改变微生物总量的季节动态。

不同土层土壤微生物总量对氮沉降响应基本一致。氮沉降处理1 a后,L、M和H处理0—10 cm土层的微生物总量分别比CK降低了9.67%、41.59%和49.36%;10—20 cm土层的微生物总量分别比CK降低了0.32%、5.85%和46.60%。方差分析表明,L处理对0—10 cm 和10—20 cm土层土壤微生物总量无显著影响(P＞0.05) ,M和H处理则显著降低了土壤微生物总量(P＜0.05) 。

2.2 模拟氮沉降对细菌数量的影响

由图 2可知,CK处理0—10 cm土层细菌数量大于10—20 cm土层,氮沉降未改变这种垂直分布格局。各处理土壤细菌数量有着明显的季节动态(表 1) ,在0—10 cm和10—20 cm土层均表现为秋季最高,夏季较低。与CK处理相比,氮沉降未改变土壤细菌的季节动态。

不同土层土壤细菌数量对氮沉降的响应不一致。氮沉降处理1 a后,L、M和H处理0—10 cm土层的细菌数量分别比CK降低了12.92%、50.11%和53.15%;10—20 cm土层的细菌数量分别比CK降低了1.87%、11.24%和53.54%。方差分析表明,氮沉降各处理均显著降低了0—10 cm土壤细菌数量(P＜0.05) ,且抑制作用随氮沉降量的增加而增大;L处理对10—20 cm土层土壤细菌数量无显著影响(P＞0.05) ,M和H处理则显著降低了10—20 cm土层土壤细菌数量(P＜0.05) 。

2.3 模拟氮沉降对真菌数量的影响

由图 3可知,CK处理0—10 cm土层真菌数量大于10—20 cm土层,氮沉降未改变这种垂直分布格局。土壤真菌数量有着明显的季节动态(表 1) ,在0—10 cm和10—20 cm土层均表现为秋季最高,夏季最低。在10—20 cm土层,M和H处理在一定程度上改变了季节动态,表现为M和H处理样地夏季10—20 cm土层真菌数量远高于CK和L处理,由一年中低谷转为峰值。

不同土层真菌数量对氮沉降的响应不一致。氮沉降处理1 a后,L、M和H处理0—10 cm土层的真菌数量分别比CK降低了18.11%、8.36%和22.29%;10—20 cm土层的放线菌数量分别比CK增加了28.50%、13.60%和23.23%。方差分析表明,氮沉降显著降低了0—10 cm土层土壤真菌数量(P＜0.05) ,但下降幅度与氮沉降量无明显规律;氮沉降对10—20 cm土层土壤真菌数量的影响较为复杂,无明显变化规律。

2.4 模拟氮沉降对放线菌的影响

由图 4可知,CK处理0—10 cm土层放线菌数量大于10—20 cm土层,氮沉降未改变这种垂直分布格局。各处理土壤放线菌数量有着明显的季节动态(表 1) ,在0—10 cm和10—20 cm土层均表现为秋季最高,夏季最低。与CK处理相比,氮沉降未改变土壤放线菌的季节动态。

不同土层土壤放线菌数量对氮沉降的响应不一致。氮沉降处理1 a后,L、M和H处理0—10 cm土层的放线菌数量分别比CK增加18.89%、32.54%和—16.53%;10—20 cm土层的放线菌数量分别比CK增加了13.57%、42.92%和16.07%。方差分析表明,L和M处理显著增加了0—10 cm土层土壤放线菌数量(P＜0.05) ,且M处理的促进作用最强,而H处理显著降低了土壤放线菌数量(P＜0.05) ;氮沉降显著增加了10—20 cm土层土壤放线菌数量(P＜0.05) ,以M处理对土壤放线菌的促进效果最为明显。

3 讨论

土壤微生物数量是反映土壤质量的重要生物学指标,氮沉降对其最直接的效应是通过改变土壤微生物分解底物的质量(C:N:P化学计量比)、数量以及pH环境等进而影响土壤微生物数量、土壤微生物生物量以及土壤微生物区系组成^[18]。土壤细菌、真菌和放线菌是土壤微生物的主要组成部分,本研究中各处理0—10 cm土层土壤细菌、真菌和放线菌数量均显著大于10—20 cm。这与龚伟等^[19]和杨玉莲^[20]的研究一致。这是因为在0—10 cm土层具有发达的根系,根系分泌物和脱落物是微生物丰富的能源物质,有利于土壤养分的积累和微生物的生长繁殖^[21]。氮沉降并不能改变其垂直分布格局。

本研究中对照样地0—10 cm和10—20 cm土层细菌、真菌和放线菌数量均在秋季达到最大,在夏季比较低,这与龚伟等^[19]的研究结果一致。由于秋季处于生长季末期,枯落物带来大量营养物质,再加上良好水热条件,使得微生物数量在这一时期达到顶峰。秋冬季节土壤枯落物分解的有效C经过一定时间的分解释放后,在夏季含量变小,这将显著影响土壤微生物数量。再加上夏季降水较多,土壤通气性较差,微生物活动会受到阻碍。放线菌数量在夏季显著低于其他季节,这是因为耐旱放线菌不适宜在水分较多的季节生长繁殖。本研究中,M和H处理样地夏季10—20 cm土层真菌数量远高于CK和L处理,由一年中低谷转为峰值。这是因为夏季植物生长旺盛,对氮素需求强烈,本研究中氮沉降施用的NH₄NO₃中的NH₄⁺可以被植物根系直接吸收,提高了根系活动强度,增加了外生菌根真菌的分泌。但夏季丰富的降水同样会加快NH₄⁺的淋失,导致L处理的氮添加效果不明显。

土壤微生物对于氮输入极为敏感,过量氮沉降会导致土壤微生物数量发生明显变化^[7]。本研究中,氮沉降降低了0—10 cm和10—20 cm土层土壤细菌数量,这与刘彩霞等^[22]的研究结果相似。原因可能有以下两方面：一方面氮沉降引起了地下碳分配减少^[23],改变了微生物对底物的利用模式^[9],最终导致细菌数量的减少。另一方面氮沉降引起土壤高渗环境胁迫,改变了土壤的理化性质^[24-25]。在本实验样地中我们还发现,氮沉降促进了华西雨屏区常绿阔叶林土壤有机碳和无机氮的累积,并使土壤pH值降低(出版中),氮沉降改变了阔叶林土壤碳库和氮库以及其他理化性质,因此模拟氮沉降降低了细菌数量。但薛璟花等^[9]在鼎湖山的研究发现,氮沉降能有效地促进土壤细菌数量,这与土壤中贫富营养细菌的分布比例有关。与贫营养细菌相比,富营养细菌更适应在氮沉降造成的富氮环境中生长和繁殖^[26]。土壤真菌是利用有机质作碳源的异养型土壤微生物,具有复杂的酶系统,在土壤碳循环中起着重要作用^[27]。本研究中,氮沉降在0—10 cm土层降低了土壤真菌数量,这与土壤外生菌根真菌在富氮环境中丰度下降有关。Kjølle等^[28]的研究结果发现,氮沉降会降低外生菌根真菌子实体生产力,从而导致外生菌根丰度下降。而10—20 cm土层土壤真菌数量对氮沉降响应较为复杂,无明显规律。与0—10 cm土层相比,较少的根系导致菌根真菌的丰度较低,对氮沉降的负响应较小。同时真菌群落结构和多样性的不同也会造成氮沉降的响应方式各异。Blackwood等^[29]在北方森林中的研究发现,担子菌的丰度和多样性并未受氮沉降的影响。放线菌能分解多数真菌和细菌不能分解的化合物,还参与难分解有机质的分解过程^[30]。本研究中,0—10 cm土层放线菌数量随氮沉降量呈现非线性变化,L和M处理促进了放线菌数量,H处理降低了放线菌数量。这与薛璟花等^[9]的研究结果一致。在10—20 cm土层,各氮处理均促进了放线菌数量,这与刘彩霞等^[22]的研究结果一致。氮沉降对不同土层放线菌数量影响的不同与不同土层接受的氮沉降浓度差别,以及放线菌的群落结构组成差异有关。Eisenlord等^[31]的研究结果发现,放线菌酸微菌目中的一些种易受到氮沉降的正面影响,而与木质素降解有关的链孢囊菌科则受到负面影响,与10—20 cm土层相比,0—10 cm土层中的链孢囊菌科放线菌数量更多,因此在0—10 cm土层较高处理的氮沉降(H处理)降低了放线菌数量。

综上所述,氮沉降显著影响了华西雨屏区天然常绿阔叶林土壤微生物数量。阔叶林0—10 cm土层的细菌、真菌和放线菌数量大于10—20 cm土层,氮沉降未改变原有垂直分布格局。氮沉降降低了0—10 cm和10—20 cm土层的细菌数量,且抑制作用随氮沉降量的增加而增强;氮沉降降低了0—10 cm土层的真菌数量,但下降幅度与氮沉降量之间无明显规律;低氮沉降和中氮沉降处理增加了0—10 cm放线菌数量,高氮沉降则降低了0—10 cm放线菌数量,氮沉降增加了10—20 cm土层土壤放线菌数量。