生态学报  2017, Vol. 37 Issue (23): 7972-7982

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胡从从, 成斌, 王坤, 赵丽莉, 贺学礼.
HU Congcong, CHENG Bin, WANG Kun, ZHAO Lili, HE Xueli.
蒙古沙冬青及其伴生植物AM真菌物种多样性
Species diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in the rhizospheres of Ammopiptanthus mongolicus-associated plants
生态学报. 2017, 37(23): 7972-7982
Acta Ecologica Sinica. 2017, 37(23): 7972-7982
http://dx.doi.org/10.5846/stxb201609051806

文章历史

收稿日期: 2016-09-05
修订日期: 2017-03-13
蒙古沙冬青及其伴生植物AM真菌物种多样性
胡从从 , 成斌 , 王坤 , 赵丽莉 , 贺学礼     
河北大学生命科学学院, 保定 071002
摘要: 于2015年7月在内蒙古乌海、磴口2个样地选取蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)及其伴生植物为研究对象,分别采集0-20 cm和20-40 cm土层根围土样,利用高通量测序方法分析了不同植物AM真菌群落结构和物种多样性,发掘新物种,为补充和完善AM真菌分类体系提供依据。试验共分离鉴定3纲5目6科9属89个AM真菌OTU,属包括GlomusFunneliformisDiversisporaClaroideoglomusRhizophagusSeptoglomusScutellosporaAmbisporaParaglomus。与形态学研究结果相比,高通量鉴定结果在属水平上更丰富。同一土层不同样地,蒙古沙冬青AM真菌丰度和多样性指数高于伴生植物;同一土层不同植物,AM真菌丰度和多样性指数表现为磴口高于乌海;同一植物不同样地,AM真菌ACE指数和Chao1指数20-40 cm土层高于0-20 cm土层,Simpson指数和Shannon指数0-20 cm土层高于20-40 cm土层。RDA分析表明,AM真菌ACE指数和Chao1指数与土壤碱解N显著正相关,与酸性磷酸酶显著负相关;Simpson指数和Shannon指数与碱性磷酸酶显著正相关,与pH显著负相关。结果表明,蒙古沙冬青AM真菌物种多样性高于伴生植物,同一样地,寄主植物与土壤深度共同作用对AM真菌群落组成有显著影响。
关键词: 蒙古沙冬青     伴生植物     AM真菌     高通量测序     群落组成    
Species diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in the rhizospheres of Ammopiptanthus mongolicus-associated plants
HU Congcong , CHENG Bin , WANG Kun , ZHAO Lili , HE Xueli     
College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China
Abstract: Ammopiptanthus mongolicus is an endangered broadleaf leguminous plant found in the desert ecosystem of northwest China, and it is also an excellent sand fixation plant. Zygophyllum xanthoxylum, Tetraena mongolica, Nitraria Tangutorum and Artemisia desterorum are plants that associated with A. mongolicus. These plants undergo competition inhibition and cooperative evolution, and are ideal for improving desert areas and preventing desertification. Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi can form symbioses with most terrestrial plant roots, and play an important role in improving plant growth and maintaining ecosystem stability. In order to discover new species and complement and improve the classification system of AM fungi, we used high-throughput sequencing to study species composition and the ecological distribution of AM fungi in the rhizosphere of Ammopiptanthus mongolicus and associated plants. Eighty-nine operational taxonomic units of AM fungi belonging to 5 classes, 3 orders, 6 families, and 9 genera including Glomus, Funneliformis, Diversispora, Claroideoglomus, Rhizophagus, Septoglomus, Scutellospora, Ambispora, and Paraglomus were identified. With regard to quantification at the genus level, high throughput sequencing was more sensitive than morphological evaluation. Ammopiptanthus mongolicus had a greater richness and diversity index than other associated plants. The ACE and Chao1 indices of AM fungi were higher in the 20-40 cm soil layer than in the 0-20 cm layer. However, the Simpson and Shannon indices were higher in the 0-20 cm layer. AM fungal abundance and diversity index were higher in Dengkou site than in Wuhai site. Redundancy analysis showed that the ACE and Chao1 indices of AM fungi were significantly positively correlated with soil-available N, but negatively correlated with acid phosphatase. Simpson and Shannon indices were significantly positively correlated with alkaline phosphatase, and significantly negatively correlated with pH. Together, these data show that the species diversity of AM fungi was higher in Ammopiptanthus mongolicus than in its associated plants. Furthermore, they reveal that interactions of host plant and soil depth had a significant effect on the community composition of AM fungi.
Key words: Ammopiptanthus mongolicus     associated plants     arbuscular mycorrhizal fungi     high-throughput sequencing     community composition    

蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)隶属豆科沙冬青属, 是西北荒漠生境中唯一常绿阔叶灌木, 耐干旱、抗逆性强, 在保持水土和防治荒漠化方面作用显著[1]。与蒙古沙冬青相伴而生的霸王(Zygophyllum xanthoxylum)、四合木(Tetraena mongolica)、白刺(Nitraria tangutorum)、沙蒿(Artemisia desterorum)等, 同蒙古沙冬青既存在竞争抑制, 又协同进化, 均为优良固沙植物[2]

荒漠生境中植物与微生物的生长、分布及其相互作用对生态系统改善和稳定有重要影响。AM(arbuscular mycorrhiza)真菌是一类在自然界广泛分布的土壤真菌, 能与绝大多数高等植物根系形成互利共生体, 通过根外菌丝形成的网络增强植物根系对土壤养分资源的吸收利用, 提高植物生产力[3]。研究发现, AM真菌能够提高植物在干旱、重金属污染、病虫害等逆境下的抗性[4-5]。因此, 探明AM真菌群落组成和生物多样性以及与荒漠植物共生机理, 对促进植物适应极端干旱环境, 稳定和改善荒漠生态系统有重要意义。

迄今为止, 荒漠环境中共发现9属107种AM真菌, 并不断有新种报道和已知种类分类地位的重新认识[6-7]。目前, 主要依据孢子形态特征进行AM真菌分类鉴定, 研究结果存在偶然性、局限性和不一致性[8-9]。由于广域的地理环境和生态差异, 不仅导致AM真菌种群强烈分化, 也导致了种间和种内的形态多态性与环境饰变作用下的性状变异难以区分, 要解决这一问题, 对AM真菌分子特征、微形态特征等方面的工作将会起到重要作用。Luke等[10]利用T-RFLP技术分析表明, 种植模式对土壤AM真菌多样性有明显影响。Öpik等[11-12]利用DNA条形码技术对96种植物根际AM真菌进行鉴定, 在分子水平上至少发现了204种, 远超出形态学鉴定的156种AM真菌。近年来, 新一代高通量测序技术因其测序量大、通量高, 不仅可检测到极微量AM真菌序列, 而且研究结果更接近微生物真实的群落结构, 被广泛应用于AM真菌群落结构和物种组成分析[13-14]

本试验在前期基于形态学特征对蒙古沙冬青及其伴生植物AM真菌分类鉴定的基础上[15], 利用高通量测序技术进一步分析检测土壤AM真菌种属结构和生态分布, 发掘新的物种和信息, 补充完善AM真菌群落组成和物种多样性, 为阐明蒙古沙冬青适应极端荒漠环境机理, 利用AM真菌资源促进荒漠植物生长和植被恢复提供依据。

1 材料与方法 1.1 样地概况及样品处理

2015年7月于内蒙古乌海、磴口各选取以蒙古沙冬青为建群种的3个样地, 每个样地随机选取长势相似的蒙古沙冬青和两种伴生植物各4株, 其中乌海样地伴生植物为霸王(Zygophyllum xanthoxylum)、四合木(Tetraena mongolica), 磴口样地为沙蒿(Artemisia desterorum)、白刺(Nitraria tangutorum)。去除土壤表面枯枝落叶层, 在距植株主干0—30 cm范围内挖取土壤剖面, 分别采集0—20 cm和20—40 cm土层新鲜土壤各500 g, 将同一样地4株植物按土层混合均匀, 3个样地作为重复, 共计36个土壤样品, 分别标记为SWL (沙冬青乌海0—20 cm), SWD (沙冬青乌海20—40 cm), BWL (霸王乌海0—20 cm), BWD (霸王乌海20—40 cm), HWL (四合木乌海0—20 cm), HWD (四合木乌海20—40 cm), SDL (沙冬青磴口0—20 cm), SDD (沙冬青磴口20—40 cm), BDL (白刺磴口0—20 cm), BDD (白刺磴口20—40 cm), HDL (沙蒿磴口0—20 cm), HDD (沙蒿磴口20—40 cm), 将土样编号装入自封袋运回实验室后, 用于土壤总DNA提取的土样在-20℃保存, 其余土样自然风干后过2 mm筛, 用于土壤理化性质测定。样地具体情况见表 1

表 1 内蒙古荒漠带各采样点概况 Table1 Sampling sites in Inner Mongolia desert zone
样地
Sample site
经纬度
Longitude/Latitude
海拔
Elevation/m
乌海 Site1 39°83′ N106°83′E 1129.45 m
Site2 39°73′N 106°87′E 1109.85 m
Site3 39°73′ N106°81′E 1141.35 m
磴口 Site1 40°39′ N106°74′E 1002.99 m
Site2 40°47′N 106°43′E 1006.47 m
Site3 40°48′N 106°38′E 1002.18 m
1.2 土壤理化性质测定

土壤有机碳用马弗炉烘干法;土壤pH用电位法;土壤速效P用钼锑抗比色法;碱解N采用碱解法利用全自动化学分析仪Smartchem200测定;酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)用改进的Brimner和Tabatabai方法[16]测定。球囊霉素分易提取球囊霉素(Easy-extrated glomalin, EEG)和总球囊霉素(Total extractable glomalin, TEG), 分别按Wright和Vpadhyaya[17]及Janos等[18]的方法测定, 称取1.0 g风干土于试管中, 加入柠檬酸钠浸提剂, 通过高压浸提、再提取上清液离心、用考马斯亮蓝显色, 绘制标准曲线, 求出球囊霉素含量。所得数据由Excel 2003统计整理, 利用CANOCO 4.5软件进行RDA分析。

1.3 土壤总DNA提取、PCR扩增及产物回收

采用已修改的Bead-Beating法[19]提取土壤总DNA, 用TE缓冲液溶解提取的DNA, 置于-20℃冰箱待用。

基于HiSeq测序对基因片段的限制(300 bp以内)以及真实客观反应AM真菌群落结构和丰富多样性的要求, 第一轮扩增以土壤总DNA为扩增模板, 引物为GeoA2 (5′-CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′)和AML2 (5′-GAA CCC AAA CAC TTT GGT TTC C-3′), 扩增片段为1000 bp左右。以第一轮扩增产物为模板, 使用带Barcode的特异引物NS31 (5′-TTG GAG GGC AAG TCT GGT GCC-3′)和AMDGR (5′-CCC AAC TAT CCC TAT TAA TCA T-3′)进行第二轮PCR, 扩增片段为280—300 bp。根据PCR产物浓度进行等量混样, 利用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 切割目的条带, 使用凝胶回收试剂盒回收目标产物。

1.4 构建文库与测序

使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建, 构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量, 文库合格后, 使用HiSeq2500 PE250进行上机测序, 每个样品至少测3万条序列[20]

1.5 数据处理与多样性指数测定

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列拆分出各样品数据, 截去Barcode和引物序列后使用FLASH对每个样品的reads进行拼接得到原始Tags数据(Raw Tags), 再经过滤处理得到高质量Tags数据(Clean Tags)。参照Qiime的Tags质量控制流程, 将Raw Tags从连续低质量值(默认质量阈值为 19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断;得到Tags数据集, 进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags。

利用Uparse软件对全部Effective Tags进行聚类, 默认以97%的一致性(Identity)将序列聚类成OTUs, 同时依据其算法原则, 筛选OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。应用RDP Classifier方法和GenBank数据库对序列进行物种注释分析(设定阈值为0.6—1), 并在属水平统计各样品群落组成。使用MUSCLE软件进行快速多序列比对, 得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。最后对各样品数据进行均一化处理, 以样品中数据量最少的为标准进行均一化处理, 用Qiime软件计算Chao1, ACE指数, Shannon和Simpson, 用SPSS 19.0进行相关性分析, 用R软件(vegan package)绘制稀释曲线, 进行Alpha多样性指数组间差异分析与PERMANOVA分析。用R软件(vegan package)绘制NMDS图, 进行Beta多样性指数组间差异分析。Chao1指数[21-22](S), ACE指数(EH), Shannon指数(H)和Simpson指数(D)公式计算:

其中Schao 1为估计的OTU数, Sobs为观测到的OTU数, N1为singletons序列的OTU数, N2为doubletons序列的OTU数。

式中, Pi=Ni/N即表示第i种AM真菌的优势度。

2 结果 2.1 土壤理化性质

图 1可知, 乌海样地, 蒙古沙冬青根围土壤pH、有机质、EEG和ACP含量在0—20 cm土层较高, 速效P、TEG、ALP和碱解N在20—40 cm土层含量较高;霸王各项土壤因子除有机质外都在0—20 cm土层有最大值;四合木各土壤因子除pH和有机质外都在0—20 cm土层有最大值。同一土层, 蒙古沙冬青pH、有机质和碱解N均高于伴生植物, 而速效P、ACP和ALP含量低于伴生植物。

图 1 蒙古沙冬青和伴生植物土壤因子空间分布 Fig. 1 Spatial distribution of soil factor in A.mongolicus and associated plants 不同大写字母表示乌海样地同一土层3种植物差异显著(P < 0.05);不同小写字母表示磴口样地同一土层3种植物差异显著(P < 0.05); ALP:碱性磷酸酶, alkaline phosphatase; ACP:酸性磷酸酶, acid phosphatase; EEG:易提取球囊霉素Easily extrated glomalin; TEG:总提取球囊霉素, Total extrated glomalin.

磴口样地, 蒙古沙冬青根围土壤pH、EEG和TEG最大值在0—20 cm土层, 有机质、速效P、ACP、ALP和碱解N在20—40 cm土层含量较高;白刺各土壤因子除pH和TEG外, 均在0—20 cm土层有最大值;沙蒿除pH外各因子均在0—20 cm土层含量较高。同一土层, 蒙古沙冬青有机质、速效P、EEG和ALP含量均高于伴生植物, 而pH、ACP和碱解N低于伴生植物。同一植物不同样地, 蒙古沙冬青有机质、EEG、ACP和碱解N在乌海高于磴口, pH、速效P、TEG和ALP在磴口高于乌海;伴生植物除pH和TEG外各土壤因子均在乌海含量较高。

2.2 序列统计分析

所有样品经PCR检测合格后, 构建文库并测序。由表 2可知, 本试验共获得1885864条原始序列, 去掉低质量的Reads后得到1790731条高质量序列, 平均每个样品测得49742条优化序列, 每个样品的优化序列百分比均在94%以上, 所有样品读长平均为292 bp。不同样品优化序列数差异明显。同一土层, 蒙古沙冬青土样中高质量序列多于伴生植物;同一植物, 20—40 cm土层样品高质量序列多于0—20 cm土层。

表 2 不同土壤样品序列特征 Table2 Sequence characteristics of different soil samples
样品编号
Sample No.
平均序列长度
Average
length(bp)
碱基对数
Bases(bp)
优化序列数
Trimed
sequences
优化序列百分比/%
The percentage
of trimed
sequences
SWL 292 13916364 47599 95.11
SWD 292 17864379 61107 95.06
BWL 292 13491625 46157 95.07
BWD 292 16386567 56063 95.14
HWL 292 13702314 46890 94.91
HWD 292 15026701 51409 95.19
SDL 292 13514479 46233 94.85
SDD 292 16306370 55781 95.07
BDL 292 11902378 40708 94.74
BDD 292 15453572 52857 94.73
HDL 292 10926711 37377 94.58
HDD 292 16000055 54724 94.88
  SWL:沙冬青乌海0—20cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Wuhai 0—20 cm soil layer; SWD:沙冬青乌海20—40cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Wuhai 20—40 cm soil layer; BWL:霸王乌海0—20cm, Zygophyllum xanthoxylum in the Wuhai 0—20 cm soil layer; BWD:霸王乌海20—40cm, Zygophyllum xanthoxylum in the Wuhai 20—40 cm soil layer; HWL:四合木乌海0—20cm, Tetraena mongolica in the Wuhai 0—20 cm soil layer; HWD:四合木乌海20—40cm, Tetraena mongolica in the Wuhai 20—40 cm soil layer; SDL:沙冬青磴口0—20cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Dengkou 0—20 cm soil layer; SDD:沙冬青磴口20—40cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Dengkou 20—40 cm soil layer; BDL:白刺磴口0—20cm, Nitraria tangutorum in the Dengkou 0—20 cm soil layer; BDD:白刺磴口20—40cm, Nitraria tangutorum in the Dengkou 20—40 cm soil layer; HDL:沙蒿磴口0—20cm, Artemisia desterorum in the Dengkou 0—20 cm soil layer; HDD:沙蒿磴口20—40cm, Artemisia desterorum in the Dengkou 20—40 cm soil layer
2.3 稀释曲线分析

稀释曲线能检验测序数据量的合理性, 并反映样品物种丰富度。水平方向上, 曲线的宽度反映了物种的丰富度;垂直方向上, 曲线的平滑程度体现了样品物种的均匀度。从图 2可见, 供试样品的稀释曲线均趋于平缓, 说明测序量趋于饱和, 测得数据可反映土壤AM真菌群落真实情况。在水平方向曲线较宽, 垂直方向平滑程度较小, 说明AM真菌的丰度大, 但物种的均匀度低。

图 2 AM真菌稀释性曲线 Fig. 2 Rarefaction curves of AM fungi in soil samples SWL:沙冬青乌海0—20cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Wuhai 0—20 cm soil layer; SWD:沙冬青乌海20—40cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Wuhai 20—40 cm soil layer; BWL:霸王乌海0—20cm, Zygophyllum xanthoxylum in the Wuhai 0—20 cm soil layer; BWD:霸王乌海20—40cm, Zygophyllum xanthoxylum in the Wuhai 20—40 cm soil layer; HWL:四合木乌海0—20cm, Tetraena mongolica in the Wuhai 0—20 cm soil layer; HWD:四合木乌海20—40cm, Tetraena mongolica in the Wuhai 20—40 cm soil layer; SDL:沙冬青磴口0—20cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Dengkou 0—20 cm soil layer; SDD:沙冬青磴口20—40cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Dengkou 20—40 cm soil layer; BDL:白刺磴口0—20cm, Nitraria tangutorum in the Dengkou 0—20 cm soil layer; BDD:白刺磴口20—40cm, Nitraria tangutorum in the Dengkou 20—40 cm soil layer; HDL:沙蒿磴口0—20cm, Artemisia desterorum in the Dengkou 0—20 cm soil layer; HDD:沙蒿磴口20—40cm, Artemisia desterorum in the Dengkou 20—40 cm soil layer
2.4 OTU聚类及物种注释分析

从两个样地36个土样中共获得89个AM真菌OTUs, 经序列比对, 89个真菌OTUs归为3纲5目6科9属(表 3)。其中36个OTUs属于Glomus, 16个属于Funneliformis, 16个属于Diversispora, 最低的为Septoglomus, ScutellosporaAmbispora, 各有1个OTU。图 3展示了样品中相对丰度排名前10的AM真菌所对应OTUs的系统发生关系, 说明AM真菌主要分布在Glomus, Funneliformis, Diversispora, Rhizophagus, Septoglomus, ScutellosporaParaglomus 7个属。将已比对序列按属分类水平进行统计分析(图 4)可知, 供试样品中AM真菌种属组成相似, 但每个样品中各属相对丰度差异显著。Diversispora相对丰度最高, 是所有样品的优势属, 其次是GlomusFunneliformis, 3属之和在所有土样中均占到AM真菌总量90%以上。Claroideoglomus, Rhizophagus, SeptoglomusParaglomus在每个土样中均有分布, Ambispora仅在蒙古沙冬青、四合木和沙蒿深土层有发现, 而Scutellospora未在沙蒿根围土样中检测到。

表 3 AM真菌属种组成统计 Table3 Statistics of AM fungi
纲 Class 目 Order 科 Family 属 Genus OTU数
The number of OTUs
球囊霉纲
Glomeromycetes
球囊霉目
Glomerales
球囊霉目
Glomeraceae
球囊霉属
Glomus
36
管柄囊霉属
Funneliformis
16
根内囊霉属
Rhizophagus
3
有隔囊霉属
Septoglomus
1
近明球囊霉科
Claroideoglomeracea
近明球囊霉属
Claroideoglomus
3
多孢囊霉目
Diversisporales
多孢囊霉科
Diversisporaceae
多孢囊霉属
Diversispora
16
巨孢囊霉目
Gigasporales
盾巨孢囊霉科
Scutellosporaceae
盾巨孢囊霉属
Scutellospora
1
原囊霉纲
Archaeosporomycetes
类球囊霉目
Archaeosporales
Ambisporaceae Ambispora 1
类球囊霉纲
Paraglomeromycetes
类球囊霉目
Paraglomerales
类球囊霉科
Paraglomeraceae
类球囊霉属
Paraglomus
4

图 3 OTUs的系统发育关系及其物种注释 Fig. 3 Phylogenetic relationship and species annotation of OTUs

图 4 AM真菌各属相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of AM fungi at genera levels Diversispora多孢囊霉属, Funneliformis管柄囊霉属, Claroideoglomus近明球囊霉属, Rhizophagus根内囊霉属, Septoglomus有隔囊霉属, Scutellospora盾巨孢囊霉属, Paraglomus类球囊霉属,others其它
2.5 α—多样性分析

α—多样性可用于AM真菌群落丰富度分析, 多样性指标包括均匀度指数ACE、丰度指数Chao1、多样性指数Simpson和Shannon。由表 4可知, 同一土层, 除乌海样地20—40 cm土层白刺较蒙古沙冬青AM真菌丰度高外, 蒙古沙冬青AM真菌ACE指数和Chao1指数均显著高于伴生植物;乌海样地蒙古沙冬青AM真菌Simpson指数和Shannon指数均低于伴生植物, 磴口样地蒙古沙冬青AM真菌Simpson指数和Shannon指数均显著高于伴生植物。同一植物, 深土层ACE指数和Chao1较浅土层高, Simpson指数和Shannon指数浅土层高于深土层;样地间总体呈现磴口>乌海。

表 4 AM真菌多样性分析 Table4 Diversity analysis of AM fungi
样品编号
Samples
物种丰度和多样性指数 Species richness and diversity index
ACE指数
ACE Index
Chao 1指数
Chao 1 Index
Simpson指数
Simpson Index
Shannon指数
Shannon Index
SWL 65.192A 65.125A 0.690A 2.657A
BWL 59.211B 58.167C 0.692A 2.671A
HWL 61.459B 61.417B 0.708A 2.793A
SWD 68.554A 67.369B 0.685A 2.608A
BWD 63.555B 70.222A 0.686A 2.627A
HWD 63.565B 62.876C 0.693A 2.685A
SDL 69.716a 75.444a 0.699a 2.734a
BDL 60.946b 60.417c 0.675a 2.555a
HDL 62.566b 64.233b 0.688a 2.644a
SDD 66.922a 67.667a 0.689a 2.651a
BDD 62.786b 61.548b 0.668b 2.498b
HDD 63.230b 62.500b 0.685a 2.608a
  不同大写字母表示乌海样地同一土层3种植物差异显著(P < 0.05);不同小写字母表示磴口样地同一土层3种植物差异显著(P < 0.05)
2.6 多样品比较分析

PERMANOVA分析可得, AM真菌群落组成(Bray-Curtis距离)在样地及寄主植物与土壤深度共同作用下差异显著(表 5)。基于OTU水平的无度量多维标定法(NMDS, Non-Metric Multi-Dimensional Scaling)统计分析结果(图 5), 四合木浅土层、沙蒿深土层和磴口样地蒙古沙冬青浅土层样品组内和组间差异显著;其他土壤样品相似度较高, 无明显差异。

表 5 基于Bray-Curtis距离的AM真菌群落PERMANOVA分析 Table5 PERMANOVA analysis of AM fungal community based on Bray-Curtis distance
因子
Factor
F R2 P
植物 Plant 1.4086 0.0635 0.202
样地 Site 3.2067 0.0723 0.033*
土壤深度  Depth 1.709 0.0385 0.172
植物×样地 Plant×Site 0.9307 0.042 0.455
植物×土壤深度 Plant×Depth 3.6607 0.1651 0.003**
样地×土壤深度 Site×Depth 1.8226 0.0411 0.117
植物×样地×土壤深度
Plant×Site×Depth
0.8021 0.0364 0.555
  *:表示P < 0.05;**:表示P < 0.01

图 5 AM真菌群落NMDS分布图 Fig. 5 NMDS plot of AM fungal community composition
2.7 AM真菌与土壤因子相关性分析

Pearson相关性分析可知(表 6), AM真菌ACE指数和Chao1指数与土壤碱解N显著正相关, 与ACP显著负相关;Simpson指数和Shannon指数与土壤速效P、ALP显著正相关, 与pH显著负相关。综上可知, pH、速效P、磷酸酶和碱解N对AM真菌多样性有显著影响。CANOCO 4.5生物统计软件进行RDA分析(图 6)可知, 两轴累积解释信息量达94.7%, 可反映采样点、土壤因子与AM真菌多样性的关系。AM真菌丰度、均匀度和多样性指数沿第一轴从左至右依次增加, 两样地蒙古沙冬青丰度和多样性指数均高于伴生植物, 其中, 磴口蒙古沙冬青0—20 cm土层AM真菌多样性最丰富。

表 6 AM真菌物种多样性与土壤因子的pearson相关性分析 Table6 Pearson analysis between AM fungal diversity and soil factors
土壤因子
Soil factor
菌群多样性指数
ACE Index
Chao1多样性指数
Chao1 Index
辛普森指数
Simpson Index
香农-威纳指数
Shannon Index
OTU数量
The number of OTUs
pH -0.433 -0.414 -0.559* -0.553* -0.083
有机碳 Organic carbon 0.330 0.212 0.460 0.453 0.269
有效磷 Available P 0.251 0.386 0.398 0.432 -0.086
碱解氮 Available N 0.755** 0.499* 0.165 0.142 0.497
易提取球囊霉素
Easily extractable glomalin
0.088 -0.009 0.686 0.677 -0.203
总球囊霉素
Total extractable glomalin
-0.084 -0.168 0.306 0.292 0.018
酸性磷酸酶 Acid phosphatase -0.728** -0.644* 0.343 0.343 -0.543
碱性磷酸酶 Alkaline phosphatase -0.039 -0.110 0.725** 0.737** -0.31

图 6 AM真菌多样性与土壤因子的RDA分析 Fig. 6 Results of redundancy analysis of AM fungal diversity index and soil factors 图中1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12分别代表SWL, SWD, BWL, BWD, HWL, HWD, SDL, SDD, BDL, BDD, HDL, HDD样品; C:有机质, organic matter; N:碱解氮, Available N; P:速效磷Available P; ALP:碱性磷酸酶, alkaline phosphatase; ACP:酸性磷酸酶, acid phosphatase; EEG:易提取球囊霉素, Easily extrated glomalin; TEG:总提取球囊霉素, Total extrated glomalin.
3 讨论 3.1 AM真菌群落组成和物种多样性

本试验利用高通量测序技术在乌海、磴口两个样地共分离鉴定AM真菌5目6科9属, 有7个OTU鉴定到种, 即Glomus perpusillum, Funneliformis mosseae, F. coronatum, Rhizophagus intraradices, Diversispora spurca, Scutellospora aurigloba, Ambispora leptoticha, 尚有Glomus sp.和Diversispora sp.未确定, 其中Rhizophagus, AmbisporaParaglomus 3个属利用孢子形态特征进行分类鉴定时没有发现[15]。另外, Diversispora共有16个OTU, 在所测样品中优势度最大, 为两样地共有优势属, Diversispora spurca为优势种。Glomus共检测出36个OTU, 虽然相对丰度最大, 但相对多度低于Diversispora。一方面是由于AM真菌分类系统的不断更新, 使得部分AM真菌种类分类地位发生了变化[6];另一方面由于形态学鉴定以及一些传统分子手段存在缺陷, 研究结果会出现不稳定性和局限性, 不能真实反映环境中AM真菌群落结构和多样性[23]。而采样高通量测序方法能够检测到孢子数量和DNA含量少、生态地理变异大、利用孢子形态特征难以分类鉴定的AM真菌种属, 丰富了AM真菌种属组成, 说明分子生物学对AM真菌形态学分类有重要补充意义[7]

3.2 寄主植物与AM真菌物种多样性的关系

两样地中, 乌海蒙古沙冬青AM真菌Simpson指数和Shannon指数较伴生植物四合木低, 磴口蒙古沙冬青AM真菌Simpson指数和Shannon指数均高于伴生植物。说明蒙古沙冬青AM真菌物种多样性高于伴生植物, 大多数AM真菌能与其形成密切的共生关系。研究证实, AM真菌对寄主植物没有严格专一性, 但AM真菌与不同寄主植物间的亲和力存在差异[21]。Kiers等[24]报道了AM真菌与寄主植物存在“相互奖励”机制, 即寄主植物分配碳源给为其提供更多磷素的菌根真菌。Tawaraya等[25]研究发现, 不同寄主植物对同种AM真菌的依赖性差异明显。由于AM真菌具有功能多样性, 在长期进化过程中, 寄主植物可选择性促进或抑制某些AM真菌孢子生长发育, 从而保留具有特定功能的AM真菌与之共生[24-25]。蒙古沙冬青与AM真菌都具有古老的生长史和发展史, 它们在长期协同进化过程中, 相互选择形成良好共生关系, 这对蒙古沙冬青适应生态环境有重要意义。四合木也具有古老进化史, 形态结构与蒙古沙冬青相似, 其根围土壤AM真菌多样性高于其他伴生植物, 这与AM真菌协同进化有着密切联系。王同智等[26]关于AM真菌对四合木抗旱性的研究也证实, AM真菌能显著提高幼苗成活率和酶活性, 增加生物量适应干旱胁迫。

3.3 环境异质性与AM真菌物种多样性的关系

很多研究发现, 土壤理化性质和环境条件对AM真菌群落的影响比寄主植物更大[26-27]。本试验中, 同一植物, 深土层比浅土层AM真菌ACE指数高, Simpson指数和Shannon指数在浅土层高于深土层, 说明土壤深度影响着AM真菌的生态分布。AM真菌为好氧性真菌, 土壤通气性是影响其群落分布的重要因素。相关性分析表明, AM真菌ACE指数和Chao1指数与土壤碱解N显著正相关, 与酸性磷酸酶显著负相关;Simpson指数和Shannon指数与速效P和碱性磷酸酶显著正相关, 与pH显著负相关, 说明土壤理化性质对AM真菌群落结构和多样性有显著影响。研究表明, 低pH可直接抑制外生菌丝和根系生长, 从而抑制AM真菌生长和功能发挥[9]。研究发现, AM真菌分泌磷酸酶可将土壤有机磷转化成无机磷, 增加植物根系对磷素的吸收[28]。贺超等[29]研究发现, 不同水肥因子对AM真菌促生效应和营养吸收能力有显著影响。

另外, 海拔、温度、土壤含水量、土壤质地等都会影响AM真菌群落结构和种群分布[30-31]。磴口样地AM真菌多样性明显高于乌海样地, 这可能与经纬度和海拔高度不同有关。不同海拔会造成温度、降水等环境条件的差异, 进而影响AM真菌群落结构与物种组成[32-33]

综合表明, AM真菌群落组成和物种多样性与寄主植物和生态环境密切相关, 蒙古沙冬青AM真菌物种多样性较伴生植物更为丰富, 具有更强的生态适应性。同时, 形态学特征与分子特征有机结合, 才能科学客观地阐明AM真菌群落组成和物种多样性特征。

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