2017, Vol. 37文章信息
- 周健, 王亚男, 马丹炜, 黄素, 辛文媛, 张红
- ZHOU Jian, WANG Ya'nan, MA Danwei, HUANG Su, XIN Wenyuan, ZHANG Hong.
- 土荆芥挥发性化感物质诱导蚕豆保卫细胞死亡及信号调节
- Volatile allelochemicals from Chenopodium ambrosioides L. induced guard cells apoptosis and its signal regulation in Vicia faba L.
- 生态学报. 2017, 37(17): 5713-5721
- Acta Ecologica Sinica. 2017, 37(17): 5713-5721
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201606011058
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文章历史
- 收稿日期: 2016-06-01
- 网络出版日期: 2017-04-24
入侵植物土荆芥(Chenopodium ambrosioides L.)为藜科藜属1年生或多年生芳香性草本植物, 原产热带美洲, 现广泛分布于我国20多个地区, 严重破坏了我国生态系统的结构与功能[1]。土荆芥全株富含挥发油, 当这些挥发油释放到周围环境后, 对受体植物具有强烈的化感作用, 可诱导受体植物根细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)爆发, 干扰细胞有丝分裂和基因表达, 导致微核率和畸变率增加, 引起氧化损伤和细胞死亡[2-5], 表现出较强的遗传毒性和细胞毒性。植物释放到环境中的挥发性化感物质除了一小部分通过淋溶[6]、根系分泌[7]或腐解[8]进入土壤外, 很大一部分会挥发进入大气作用于植物的地上器官, 尤其是叶片。气孔是存在于植物茎和叶表面由一对保卫细胞围成的小孔, 是大气中物质进入植物体的主要门户, 控制着外界环境和植物内部的气体交换[9]。气孔保卫细胞能够接受和整合一系列内外刺激并做出准确的响应[10], 以此减轻环境胁迫程度和提高植物的抗性[11], 是研究环境胁迫的良好材料, 也是研究单个细胞内信号转导的模式系统[12]。研究表明, 气孔保卫细胞对植物的化感胁迫十分敏感, 在马缨丹(Lantana camara)[13]和狗牙根(Cynodon dactylon)[14]的化感胁迫下, 受体植物的气孔导度显著下降。本研究室前期研究发现, 土荆芥挥发油及其两个主要成分α-萜品烯和对伞花素处理导致蚕豆(Vicia faba L.)气孔保卫细胞发生Caspase依赖性的细胞凋亡[15]。信号分子NO、ROS和Ca2+在胁迫诱导的植物程序性细胞死亡中起着重要的调节作用, 如参与了SO2诱导气孔保卫细胞凋亡的信号转导过程[16-17], 但是否参与土荆芥化感物质诱导保卫细胞凋亡的信号转导过程却知之甚少。本研究模拟土荆芥挥发途径产生的化感作用, 使土荆芥挥发油及其主要成分α-萜品烯和对伞花素与蚕豆叶片表皮条充分接触, 通过分析叶片保卫细胞活性并运用ROS、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthetase, NOS)和Ca2+的组织化学定位法, 进一步研究了土荆芥挥发途径化感胁迫诱导蚕豆保卫细胞死亡相关的信号调控机制, 为深入揭示土荆芥化感作用机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试材料供试植物土荆芥采自四川省成都市包江桥。采用水蒸气蒸馏法[18]提取挥发油, 用无水Na2SO4除去水分, 得到淡黄色具有强烈芳香味的挥发油, 测得密度为843 mg/mL。4 ℃保存备用。经四川大学测试中心分析鉴定, 该挥发油中α-萜品烯和对伞花素的含量分别为151 mg/mL和156 mg/mL；试验用α-萜品烯和对伞花素的标准品购自成都市锐可思生化试剂公司。
受体植物蚕豆种子(成胡14#)购于成都市五块石种子市场。
1.2 试验方法 1.2.1 材料培养和准备挑选大小均一、饱满的蚕豆种子, 用0.5%KMnO4浸泡15 min, 浸种24 h, 避光25 ℃催芽2—3 d, 出芽后播种于盛有石英砂的花盆(直径10 cm, 高度6 cm)中, 置于光暗周期14 h/10 h(光周期25 ℃, 暗周期18 ℃)的条件下培养。培养期间盆内Hoagland营养液(CaNO3·4H2O 945 mg/mL, KNO3 506 mg/mL, NH4NO3 80 mg/mL, KH2PO4 136 mg/mL, MgSO4·7H2O 493 mg/mL, 铁盐溶液2.5 mL, 微量元素液5 mL, pH 6.0) 保持在0.2%。待蚕豆生长4—5周时取顶端完全展开的叶片, 撕取1 cm×0.5 cm的叶下表皮, 置于含有5 mL MES缓冲液[50 mmol/L KCl, 0.1 mmol/L, 0.1 mol/L Tris, 10 mmol/L 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid(MES), pH 7.0]的EP管中。
1.2.2 试验处理用二甲基亚砜(DMSO)配制挥发油、α-萜品烯和对伞花素处理母液。将10 μL挥发油用DMSO稀释至100 μL得到0.1 μL/μL的挥发油处理母液。根据10 μL挥发油中α-萜品烯和对伞花素的含量, 配制二者的处理母液, 其终浓度分别为0.0169 μL/μL和0.0186 μL/μL。
分别取处理母液2, 4, 6, 8, 10 μL(分别记为梯度1、2、3、4、5), 用DMSO补充至10 μL, 分别加入1.2.1的EP管中处理表皮条, 其中MES缓冲液和DMSO作为对照；缓解组在1.2.1的EP管中分别加入0.5 mmol/L和2.5 mmol/L的活性氧清除剂抗坏血酸(AsA)、Ca2+螯合剂乙二醇双四乙酸(EGTA)和硝酸还原酶抑制剂NaN310 μL, 10 min后加入梯度4的处理液母液, 以MES缓冲液和梯度4处理液为对照。所有处理均置于25 ℃光照30 min。每处理重复3次。
1.2.3 细胞活性检测和细胞核形态观察细胞活性检测采用马丹炜等[19]的方法略有改进。处理结束后将表皮条用MES缓冲液清洗后, 平铺在载玻片上, 滴加少许吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)染液, 避光染色3 min, 用LEICA DM300荧光显微镜观察并拍照。具有绿色荧光的为活细胞, 具有橘红色荧光的为死细胞。每个处理组观察1000个细胞, 统计保卫细胞的存活率。
细胞核形态检测采用Feulgen染色法[19]。用Schiff试剂对处理后的表皮条避光染色30 min, 光学显微镜下观察细胞核形态并拍照。
1.2.4 保卫细胞内ROS、NOS和Ca2+组织化学定位ROS定位参照焦成瑾[20]的方法, 用0.1%二氨基联苯胺(DAB)[10 mmol/L MES(pH 6.5), 0.01%Tween-20]和0.1%硝基四唑氮蓝(NBT)[50 mmol/L MES(pH 6.4), 0.01%Tween-20]分别对表皮条中的H2O2和O2·-进行染色, 染色后用95%的乙醇90 ℃水浴脱去叶绿素。
Ca2+定位参照Li等[21]的方法, 用0.01 mmol/L Ca2+荧光指示剂(Fluo-3/AM)暗孵育60 min。
由于NO半衰期短, 对其定位较难, 因此本研究在胁迫处理后, 通过对NOS染色来推测保卫细胞内NO的生成。参照曹冰等[22]的方法略有改进, 用含有0.05%β-NADPH、0.01%NBT、0.3% triton x-100的100 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.4) 孵育60 min, 用100 mmol/L的磷酸缓冲液清洗。
上述定位试验均用LEICA DM300荧光显微镜观察拍照。
1.3 数据统计与分析采用SPSS17.0对数据进行ANOVA方差分析和Duncan法进行多重比较, Microsoft Excel 2007作图。
2 结果与分析 2.1 土荆芥挥发油及其两种主要成分对蚕豆保卫细胞活性的影响经AO/EB染色后, 对照组中保卫细胞细胞核呈均匀的亮绿色荧光(图 1d), 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素3个处理组中保卫细胞细胞核出现橘红色荧光(图 1e, f), 表明保卫细胞活性丧失。随着处理剂量的增加, 呈橘红色荧光的细胞核数目也随之增加(图 1a—c), 且细胞核出现明显的畸变特征, 如碎裂(图 2b, f)、畸形(图 2c, g)和降解(图 2d, h)等, 由此推测保卫细胞可能发生了细胞程序性死亡。
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| 图 1 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素对蚕豆保卫细胞活性的影响 Fig. 1 Effects of volatile oil from Chenopodium ambrosioides L., cymene and α-terpinene on guard cell viabilities in Vicia faba L. a:对照组；b:低剂量药物处理；c:高剂量药物处理；d:对照组；e:气孔单保卫细胞活性丧失；f:气孔双保卫细胞活性丧失 |
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| 图 2 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素对蚕豆保卫细胞核形态的影响 Fig. 2 Effects of volatile oil from Chenopodium ambrosioides L., cymene and α-terpinene on guard cell nucleus morphology in Vicia faba L. |
从图 3可以看出, DMSO处理组保卫细胞存活率与对照组相比无显著差异, 而土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素处理组中, 保卫细胞存活率不同程度的降低。挥发油处理组中, 细胞存活率随着挥发油处理剂量的增加呈显著下降的趋势, 在最高剂量处理下细胞存活率为5.0%, 仅为对照组的5.5%；α-萜品烯和伞花素处理处理组中, 随处理剂量的增加保卫细胞存活率与挥发油处理组相似均呈显著下降的趋势, 在最高剂量处理下, α-萜品烯处理组中细胞存活率为18.0%, 对伞花素处理组中细胞存活率为34.8%, 分别为对照组的19.7%和38.1%。由此可见, 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素对蚕豆保卫细胞产生了明显的细胞毒性, 且具有剂量依耐性, 其中土荆芥挥发油的毒性最大, α-萜品烯次之, 对伞花素的毒性最小。
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| 图 3 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素对蚕豆保卫细胞活性的影响 Fig. 3 Effects of volatile oil from Chenopodium ambrosioides L., α-terpinene and cymene on guard cell viabilities in Vicia faba L. |
DAB溶液染色结果显示(图 4), 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素处理后保卫细胞中生成的棕色化合物明显多于对照组, 表明土荆芥挥发油及其两种主要成分诱发了蚕豆保卫细胞中大量生成H2O2。其中, 挥发油处理组中棕色化合物分布最多, α-萜品烯和对伞花素处理组中差异不明显。
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| 图 4 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素处理后保卫细胞内H2O2的定位 Fig. 4 Location of H2O2 in guard cell under treatment by volatile oil from Chenopodium ambrosioides L., α-terpinene and cymene |
NBT溶液染色结果(图 5)与DAB染色结果类似, 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素处理后的保卫细胞中生成的蓝色化合物要明显多于对照组, 表明土荆芥挥发油及其两种主要成分处理导致蚕豆保卫细胞中O2·-的大量生成。
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| 图 5 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素处理后保卫细胞内O2·-的定位 Fig. 5 Location of O2·- in guard cell under treatment by volatile oil from Chenopodium ambrosioides L., α-terpinene and cymene |
经AsA预处理的蚕豆表皮条中, 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素诱导的保卫细胞死亡明显减少(图 6)。不同浓度的AsA均能减少细胞死亡, AsA浓度越高, 这一效应更为显著。由此可见, 土荆芥挥发油、α-萜品烯、对伞花素诱导的保卫细胞死亡与H2O2和O2·-水平升高有关。
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| 图 6 AsA对土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素诱导的蚕豆保卫细胞死亡的缓解效应 Fig. 6 The alleviated effects of AsA on volatile oil from Chenopodium ambrosioides L., α-terpinene and cymene induced guard cell death in Vicia faba L. |
Ca2+定位显示(图 7), 对照组中保卫细胞呈现较弱的绿色荧光, 挥发油处理组绿色荧光最强, 而α-萜品烯和对伞花素处理组的荧光强度介于对照组和挥发油处理组之间。表明在土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素胁迫下蚕豆保卫细胞内Ca2+水平升高。由图 8可以看出, Ca2+螯合剂EGTA减少了土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素诱导的保卫细胞死亡。其中, 0.5 mmol/L的EGTA有效地提高了挥发油和α-萜品烯胁迫下保卫细胞的存活率(P＜0.05), 但对伞花素处理组细胞存活率变化不明显；2.5 mmol/L的EGTA对3个处理组细胞死亡均具有抑制效应。由此可见, 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素诱导的细胞死亡与细胞内Ca2+水平的升高有关。
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| 图 7 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素处理后保卫细胞内Ca2+的定位 Fig. 7 Location of Ca2+ in guard cell under treatment by volatile oil from Chenopodium ambrosioides L., α-terpinene and cymene |
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| 图 8 EGTA对土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素诱导的蚕豆保卫细胞死亡的缓解效应 Fig. 8 The alleviated effects of EGTA on volatile oil from Chenopodium ambrosioides L., α-terpinene and cymene induced guard cell death in Vicia faba L. |
由图 9可以看出, 处理组中蓝色颗粒要明显多于对照组, 说明保卫细胞内NOS活性升高。因此, 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素可能诱发了蚕豆保卫细胞中NO的大量生成。其中挥发油处理组蓝色颗粒最多, α-萜品烯处理组次之, 对伞花素处理组最少。
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| 图 9 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素处理后保卫细胞内NOS的定位 Fig. 9 Location of NOS in guard cell under treatment by volatile oil from Chenopodium ambrosioides L., α-terpinene and cymene |
NaN3可减少土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素诱导的保卫细胞死亡(图 10)。低浓度的NaN3有效地缓解了挥发油和α-萜品烯诱导的细胞死亡(P＜0.05), 而对对伞花素诱导细胞死亡的缓解效果并不显著；高浓度的NaN3处理显著提高了3个处理组的细胞存活率。由此可见, 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素诱导的细胞死亡与细胞内NO水平的升高有关。
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| 图 10 NaN3对土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素诱导的蚕豆保卫细胞死亡的缓解效应 Fig. 10 The alleviated effects of NaN3 on volatile oil from Chenopodium ambrosioides L., α-terpinene and cymene induced guard cell death in Vicia faba L. |
入侵植物能够通过根系分泌、淋溶、挥发和腐解等途径将酚酸、生物碱、萜类等化感物质释放到环境中, 其中部分化感物质具有明显的细胞毒性[23-25]。在白花丹素等萘醌类化感物质的作用下, 细胞出现了典型的凋亡特征, 如核畸形、碎裂和降解等[26-27]。酚酸类化感物质阿魏酸通过破坏细胞膜和增加O2·-含量等抑制藻细胞的生长[28]。此外, 化感物质还具有强烈的遗传毒性, 导致受体细胞DNA损伤、染色体畸变和有丝分裂受阻等[29]。如入侵植物香丝草[Conyza bonariensis (L.) Cronq.]水浸提液干扰了受体植物根尖细胞有丝分裂, 造成染色体的多种畸变和不可逆的遗传损伤[30]。又如土荆芥挥发油干扰蚕豆根尖细胞有丝分裂过程, 导致微核率和畸变率增加[3]。本研究结果表明, 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素导致蚕豆叶片保卫细胞活性显著下降, 细胞出现了核畸形、碎裂和降解等特征。因此, 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素具有细胞毒性和遗传毒性。
3.2 ROS、NO和Ca2+参与土荆芥挥发油及其两种主要成分诱导的保卫细胞死亡植物体受到各种生物或非生物胁迫时细胞内平衡的自我调节就会被扰乱, 同时伴随着ROS的大量生成。当细胞内ROS的水平超出机体所承受的范围时, 细胞就处于氧化胁迫状态, 并引发脂质过氧化、酶失活、核酸损伤, 甚至是激活细胞的程序性死亡[31-32]。酚酸类化感物质肉桂酸和咖啡酸导致莴苣(Lactuca sativa)体内大量产生和积累ROS, 使其根尖细胞的死亡数明显增加[33]。ROS能激活质膜上的Ca2+通道, 使胞外Ca2+内流, 引起胞内Ca2+水平升高, 从而激活了Ca2+依赖性的核酸内切酶, 切割DNA在核小体的连接点, 致使细胞发生程序性死亡[34-35]。本研究结果表明, 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素处理组中蚕豆保卫细胞内ROS和Ca2+水平明显升高, 同时细胞存活率显著降低, 当加入外源性ROS清除剂AsA和Ca2+螯合剂EGTA时, 保卫细胞的死亡得到了有效遏制, 细胞存活率显著上升。这些现象说明, 在土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素的胁迫下保卫细胞内ROS的爆发引起了胞内Ca2+水平升高, 诱发了蚕豆保卫细胞的死亡。
NO是一个气体型的信号分子, 可修饰ROS信号。当细胞受到外界胁迫时随着ROS瞬间爆发, NOS活性随之增强而使NO合成到达高峰, 因此大多情况下ROS和NO几乎是在细胞的同一个区室内同时爆发的[36-37]。NO和ROS及抗氧化剂之间的化学反应会形成大量的活性氮(reactive nitrogen species, RNS), 当细胞内平衡失控, ROS和RNS信号不受控制的自我放大可能会激起氮化应激, 最终导致程序性细胞死亡[35-37]。本研究结果表明, 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素处理组中蚕豆保卫细胞内NOS的活性明显高于对照组, 表明NO的合成量增加, 当加入外源性的硝酸还原酶抑制剂NaN3时, 保卫细胞死亡得到了有效遏制, 细胞存活率显著上升, 表明NO参与了土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素诱导蚕豆保卫细胞的死亡。
植物体通过复杂的信号调控网络控制着细胞内的各种生理过程, 其中ROS和NO通过Ca2+信号系统调控程序性细胞死亡是植物体抵御环境中非生物或生物胁迫的一种基本机制[37]。由此可见, 土荆芥挥发油、α-萜品烯和对伞花素诱导的保卫细胞死亡, 可能是通过ROS和NO调控保卫细胞内Ca2+水平的变化而引起的。
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