草地生态系统是陆地上最重要的生态系统, 具有防风、固沙、保土、调节气候、净化空气和涵养水源等生态功能, 对于地球生物圈的稳定与平衡和人类社会可持续发展具有重要意义。我国是世界第二大草原国家, 草地资源在国土资源中占据相当重要的地位, 具有极其重要的生态价值、经济价值和社会价值^[1]。但是, 近年来, 随着居民生活水平的提高以及对肉、奶等畜产品和草原旅游文化需求的不断提升, 人类对草地资源进行过度开发和利用, 草地生态系统的平衡遭遇严重破坏。目前, 我国已成为世界上草原退化最严重的国家, 90%的可利用草原都出现了不同程度的退化^[2]。草地退化的同时也引发了一系列严重问题, 包括地上植物群落物种组成和比例发生变化, 牧草品质和产量下降, 草畜矛盾突出, 草地碳储量降低, 温室气体排放增加, 物种多样性失衡和减少, 灾害天气频发等, 草地退化已经成为影响我国草地生态、经济稳步发展的限制因子。

近些年, 随着研究和实践的深入, 越来越多的研究者和管理者认识到草地退化不仅是地表植被的退化, 更与土壤退化具有密切联系。植被退化是草原土壤退化的直接原因, 而土壤退化也必然引起植被退化, 二者互为因果。侯扶江、南志标等^[3]认为草地退化过程不但是植被和土壤层面的退化, 更是这两个系统耦合关系的丧失和系统相悖所导致的。笔者课题组在研究高寒草地退化机理时发现, 伴随着草地植被退化, 草地土壤的微生物群落结构等都发生了显著的变化^[4-5]。

事实上, 在草原生态系统中, 土壤微生物的活性直接影响着土壤肥力, 进而控制着土壤健康状况和草地植物生长发育。同时, 土壤微生物受土壤环境和生物多样性的影响, 并随草地健康状况变化而改变, 揭示和指示草地生态系统现状和发展趋势。固氮菌是土壤中一类重要的功能微生物, 在土壤氮素循环中发挥着无可替代的作用, 对于土壤系统乃至整个生态系统的健康有序发展具有极其重要的意义^[6-7]。因此, 土壤固氮菌是衡量土壤质量的重要指标, 但目前有关草地退化对土壤固氮菌群落影响的研究还未见报道。本研究选取不同退化程度的高寒草地为研究对象, 探讨土壤固氮菌群特性与草地植被特性之间的关系, 以期从功能微生物的角度分析草地退化机理, 为高寒草地生态系统的保育及恢复工程提供理论依据和科技支撑。

1 材料与方法 1.1 研究区自然概况

研究区位于甘肃省武威市天祝藏族自治县抓喜秀龙沟甘肃农业大学高山草原试验站(坐标为37°11′—37°13N′, 102°29′—102°33′E), 海拔为2960—2990 m, 气候寒冷潮湿, 年均温-0.1℃, ＞0℃年积温1380℃, 水热同期, 年平均降水量416 mm, 多为地形雨, 集中于7—9月, 年蒸发量1592 mm。年日照时数2600 h；无绝对无霜期, 仅分冷、热2季。植被以早熟禾(Poa)、嵩草(Kobresia bellardii)、苔草(Carex)、针茅(Stipa capillata)、金露梅(Potentilla fruticosa)、珠芽蓼(Polygonum viviparum)、棘豆(Oxytropis)、委陵菜(Potentilla chinensis)、甘肃马先蒿(Pedicularis kansuensis)等为主。土壤以亚高山黑钙土、亚高山草甸土为主, 有机质含量10%—16%, 水分含量40%—80%, 全磷含量0.056%-—0.071%, 全氮含量0.5%—0.8%, pH为7.0—8.2^[4]。

1.2 样地植物特性调查

以《天然草地退化、沙化、盐渍化的分级标准》(GB19377—2003)^[8]为依据, 在综合考虑植被、土壤等各因子的基础上, 将研究区内草地划分为重度退化、中度退化、轻度退化3个退化等级(表 1), 在每种退化程度草地上随机选取3个的样方, 调查并准确记录每个样方内的植物种类、盖度、高度等指标。植被盖度采用针刺法测量, 高度采用样方内群落自然高度的平均值^[9]。

1.3 样品采集

采样时间为2015年7月, 刈割1.2所述样方内植物的地上部分, 除去杂质后封装。然后分0—10、10—20 cm和20—30 cm 3个深度分别采集样方内土壤样品, 装入无菌容器密封后低温运输至实验室进行测定。

1.4 土壤固氮菌的测定 1.4.1 好气性自生固氮菌的测定

采用改良阿须贝(Ashby)无氮培养基, 平板涂布法测定好气性自生固氮菌^[10]。阿须贝无氮培养基配方为：葡萄糖10 g、K₂HPO₄ 0.2 g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、K₂SO₄ 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaCO₃ 5 g、琼脂18 g、蒸馏水1000 mL。

1.4.2 嫌气性自生固氮菌的测定

采用玉米面培养基, 平板涂布法测定嫌气性自生固氮菌^[10]。培养基配方为：玉米面5 g、CaCO₃ 0.5 g、自来水1000 mL。

1.5 土壤固氮菌nifH基因的测定

采用real-time PCR方法测定土壤中固氮菌的含量相对于土壤总细菌的量, 以百分比表示^[11]。

1.5.1 基因组DNA的提取及检测

土壤总DNA的提取釆用OMEGA Soil DNA isolation kit(OMEGA, USA), 步骤参照说明书。Total DNA质量及浓度检测使用紫外分光光度计(Beckman DU 640, USA)法测定。

1.5.2 Real-time PCR引物

土壤总细菌16S rRNA基因片段扩增采用的引物是341F (5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和518R (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)^[12]。固氮菌nifH基因扩增所采用的引物是的Pol F (5′-TGCGAYCCSAARGCB GACTC -3′)和Pol R(5′-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3′)^[13]。引物由上海派森诺生物科技有限公司合成。

1.5.3 Real-time PCR程序

用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa Shuzo, Osaka, Japan)建立反应体系, 具体为：DNA模板2 μL、上游和下游引物各0.5 μL、SYBR Green Ⅰ荧光染料预混试剂10 μL、ddH₂O 12 μL。

扩增条件为：95℃预变性30 sec, 95 ℃变性5 sec, 60℃退火和延伸20 sec并采集荧光信号, 45次循环。

1.5.4 Real-time PCR数据分析

根据以下公式计算土壤中固氮菌的含量相对于土壤总细菌的量：

目标菌(%总菌16S rDNA)= 2^{-(Ct target -Ct total bacteria)} × 100, Ct target为目标菌引物所测Ct值, Ct total bacteria为以总细菌为引物所得的Ct值^[11]。

1.6 数据分析

采用Excel 2007整理数据, DPS v 7.65软件进行统计分析。

2 结果与分析 2.1 不同退化草地植被特征 2.1.1 植物种类

如表 2所示, 草地退化程度对植物种类有强烈的影响, 退化程度越严重, 植物种数越少, 轻度退化草地有高达20种植物, 而重度退化草地仅有11种。另外, 由表还可以发现, 随着退化程度的加剧, 草地上出现了醉马草、狼毒等毒杂草, 这些毒杂草的出现也是草地质量变差、生产力下降的标志。就优势种来看, 无论哪种退化程度, 披碱草都是主要优势种之一。而随着退化程度加深, 可以发现, 委陵菜逐渐成为了优势种。

2.1.2 植物群落高度和盖度

植物群落是特定环境下各植物种群在长期的演替过程中通过复杂的种间关系而形成的具有特定结构的集合体, 是反应环境条件的重要指标。如表 3, 随着退化的加深, 植物的高度逐渐降低, 在重度退化的草地上, 平均高度仅有1.8 cm, 植物贴伏地面生长, 而轻度退化的草地则高达44.1 cm, 差异十分明显。植被的盖度也呈现相似规律, 但随退化的加剧下降幅度较低。研究结果反应草地退化对植物群落从垂直结构和水平结构两个层面都有明显的影响, 垂直结构层面的影响更为剧烈。

2.1.3 草地地上生物量

地上生物量是反应草地农业生态系统生产力的最重要、最直观的指标。如表 3, 与群落高度和盖度两个指标相似, 随退化的加剧, 草地的地上生物量急剧下降, 草地地上生物量与群落高度及盖度变化一致, 随退化程度的加深而数量递减。与轻度退化草地相比, 中度退化的草地地上生物量下降了47.2%, 而重度退化草地则高达92%。

2.2 不同退化草地土壤固氮菌组成 2.2.1 好气固氮菌

如图 1所示, 在同退化程度草地, 不同土层中好气性自生固氮菌的数量不同, 土层越深, 好气固氮菌的数量越少, 如轻度退化草地, 0—10 cm土层好气固氮菌的数量达9.25×10⁴ cfu/g, 而10—20 cm土层的土壤则减少为5.84×10⁴ cfu/g, 20—30cm土层则更少, 仅为3.21×10⁴ cfu/g, 其他各退化程度草地土壤也呈相似规律。好气性自生固氮菌的生长需要氧气, 而土层越深, 土壤中的含氧量越低, 因而好气性自生固氮菌的生长受到抑制。就同一土层不同退化程度来看, 退化程度越重, 土壤中好气性自生固氮菌的数量就越低。以0—10cm土层土壤为例, 轻度退化草地0—10 cm土层好气固氮菌的数量达9.25×10⁴ cfu/g, 而中度退化草地的土壤则减少为6.26×10⁴ cfu/g, 重度退化草地土壤中则更少, 仅为2.75×10⁴ cfu/g, 其他各土层也呈相似规律。

2.2.2 嫌气固氮菌

如图 2所示, 同一退化程度草地, 不同土层土壤中嫌气性固氮菌的数量不同, 基本都呈现土层越深, 数量越少的规律, 但随土层加深而减少的幅度比好气性自生固氮菌低, 以轻度退化草地为例, 0—10 cm土层土壤中为3.59×10⁴ cfu/g, 20—30 cm土层为3.22×10⁴ cfu/g, 而20—30 cm土层则减少为2.66×10⁴ cfu/g, 其他各退化程度草地都呈这一趋势。而不同退化程度草地同一土层中的嫌气性固氮菌数量不同, 以0—10 cm土层为例, 轻度退化草地土壤中嫌气性自生固氮菌数量为3.59×10⁴ cfu/g, 中度退化草地为1.41×10⁴ cfu/g, 而重度退化草地仅为0.56×10⁴ cfu/g。由此可见, 随着退化的发生, 植被的退化和好气性固氮菌、嫌气性固氮菌数量的减少是一个统一的过程。

2.3 草地退化对土壤固氮菌nifH的影响

从基因的层面研究草地退化过程中固氮菌的变化, 得到的结果与纯培养法得到的结果类似, 都是随着退化程度的增大而减少, 固氮菌是土壤中的重要功能菌, 对于土壤中的氮素循环具有重要作用, 图 3的结果显示了草地退化过程中土壤中固氮菌相对于土壤总细菌的比例在降低, 如0—10 cm的土壤中, 中度退化草地固氮菌的比例相对于轻度退化草地固氮菌的比例下降了26.9%, 而重度退化草地又较中度退化草地下降了13.2%, 因此, 土壤中固氮菌的含量受草地退化程度的影响十分显著。另外, 还可以发现, 土壤中固氮菌的分布是随土层深度的加深而减少的, 各退化程度草地都呈同样规律, 好气性自生固氮菌和嫌气性自生固氮菌的纯培养实验结果也支持这一结论。

2.4 草地退化过程植被与土壤固氮菌相关性分析。

如表 4所示, 植被各特性之间存在显著的相关性, 如盖度和高度, 以及盖度、高度和地上生物量之间均为极显著正相关关系, 说明草地退化过程并不是某一个层面上的退化, 是多层面、全面的过程。而固氮菌群各指标之间也存在显著的相关性, 这也证明了运用nifH基因丰度为研究土壤固氮菌群结构是准确合理的。另外, 植被特性与固氮菌特性之间也具有相关性。说明了在草地生态系统中, 植物和土壤中的功能微生物是息息相关的, 也说明土壤固氮菌可以作为草地退化的监控和评价指标。

3 讨论 3.1 土壤自生固氮菌和nifH 基因

本研究发现土壤自生固氮菌和nifH基因的变化规律能很好的吻合, 目前发现的土壤固氮菌不仅有自生固氮菌, 还有共生固氮菌和联合固氮菌, 分属于59个属, 但它们都是原核生物^[14]。所有的固氮菌都含有固氮酶, 该酶由nifD和nifK基因编码的钼铁蛋白和由nifH基因编码的铁蛋白构成的^[15], 即所有的固氮菌都含有nifH基因, 另一方面, nifH基因也是长期进化过程中最古老的功能基因, 其只存在于固氮微生物中^[16], 系统进化关系与16S rDNA相一致。因此, nifH基因是研究固氮菌群落结构最好的标记基因, 前人在此方面进行了大量的研究, 众多的研究资料显示, 在不同自然环境中的nifH基因呈现出差异性和多样性, 固氮菌的群落结构也表现出明显的差异^[17], 本研究验证了nifH基因在研究高寒草地和草地退化方面具有优势, 是草地退化的监控和研究工作中的有力工具。

3.2 土壤固氮菌与草地退化

土壤固氮菌是一种具有特殊功能的菌群, 可以将空气中的N₂在固氮酶的作用下还原为植物可以吸收和利用的离子态氮, 研究这类具有特殊功能的菌群有助于揭示功能微生物在草地植被演替中的作用, 如氮循环等。本研究发现, 在草地退化过程中, 土壤好气性自生固氮菌、嫌气性自生固氮菌的数量都随退化程度的加深而下降, 固氮菌nifH丰度也在显著下降。这表明草地退化对土壤固氮菌存在严重的抑制作用, 且退化程度越高, 抑制作用越大。谭红妍^[18]、文都日乐^[19]等研究了放牧对草地微生物的影响, 结果都显示随放牧压力的增大, 土壤固氮菌群数量在减少, 这与本文的结论吻合。生物固氮的固氮量每年可达200—300 kg/hm^2[20], 对于没有额外人工氮素施入的天然草地来说, 意义极为重大, 可以说, 生物固氮是草地农业可持续发展的基础。而退化却严重抑制了固氮菌的生长, 直接危害是导致固氮量的下降, 固氮量下降的直接结果是流入系统的氮素减少, 植物生长进一步受到抑制, 退化加重。草地的发展陷入恶性循环。因此, 本研究提示我们, 固氮菌不仅可以作为草地退化程度的指标, 而且研究和治理草地退化也必须重视土壤功能菌群尤其是固氮菌群的作用。

3.3 草地退化过程中植被演替与土壤微生物

本研究对植被和土壤固氮菌群相关性分析的结果表明：草地植被的演替与土壤微生物菌群的变化具有显著相关的关系。草地退化最直观的表现就是天然植被的演替, 而地表植物群落与土壤微生物群落多样性的关系是生态学研究中重要的方面^[21]。有研究表明, 肥沃程度较低的草原土壤微生物生物量高于肥沃程度较高的草原土壤, 这一变化的实现是通过调控土壤中氮(N)元素的含量来完成的^[22-23], 在此过程中起直接作用的便是土壤固氮菌群。与此相应, 土壤的微生物群落结构也同时发生了变化, 肥沃程度较高的草原土壤中细菌含量高于肥沃程度低的土壤, 而真菌含量低于肥沃程度低的土壤^[24]。这些结果表明了土壤微生物的结构和群落数量与草原土壤基质的性质相关。Grayston等^[25]利用群落DNA技术、PLFA技术和CLPP技术相结合的方法细致的分析探讨了温带草原生态系统土壤微生物群落的功能和结构, 得到了相似的结论。但也有相反的例子, 如Chabrerie.^[26]研究了法国西北部人工草原的土壤微生物和植物群落的关系, 结果显示了微生物群落的变化并不依赖于植物群落的演替, 微生物群落的趋异程度与土壤湿度、糖及可溶性碳的含量正相关, 而与木质素的含量负相关, 综合而言植被和环境因子表现出了复杂的相互关系。Kowalchuk等^[27]等的报道中也得到了相似的结论。因此, 土壤微生物与草原植物群落的关系并不是简单的对应关系, 而是一个非常复杂的关系。本研究结果初步显示了固氮菌群与植物群落的重要性, 但其互作的机理, 还需要进一步的研究。

4 结论

草地退化过程中, 随着退化程度的加深, 草地植物种类逐渐减少, 并且优势植物发生变化, 毒杂草逐渐增多, 植被的高度、盖度、地上生物量都逐渐降低。对土壤固氮菌的研究则表明, 土壤好气性固氮菌和嫌气性固氮菌的含量受到退化程度和土层深度的影响, 退化程度越深, 固氮菌含量越低, 土层越深, 固氮菌含量越低。对土壤固氮菌nifH基因扩增的结果也表明随着退化加剧, 土壤固氮菌相对于土壤总细菌的比例在降低, 进一步说明草地退化过程中土壤固氮菌不仅是数量上的下降, 更是群落结构层面的变化。对植被特性和土壤固氮菌含量的相关性分析表明, 植被特性和固氮菌含量呈显著相关。因此, 研究和治理草地退化就必须重视土壤功能菌群尤其是固氮菌群的作用。