文章信息
- 周嘉聪, 刘小飞, 郑永, 纪宇皝, 李先锋, 徐鹏程, 陈岳民, 杨玉盛
- ZHOU Jiacong, LIU Xiaofei, ZHENG Yong, JI Yuhuang, LI Xianfeng, XU Pengcheng, CHEN Yuemin, YANG Yusheng.
- 氮沉降对中亚热带米槠天然林微生物生物量及酶活性的影响
- Effects of nitrogen deposition on soil microbial biomass and enzyme activities in Castanopsis carlesii natural forests in subtropical regions
- 生态学报[J]. 2017, 37(1): 127-135
- Acta Ecologica Sinica[J]. 2017, 37(1): 127-135
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201608181684
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文章历史
- 收稿日期: 2016-08-18
- 修订日期: 2016-11-04
2. 福建师范大学湿润亚热带山地生态国家重点实验室培育基地, 福州 350007
2. State Key Laboratory of Subtropical Mountain Ecology (Founded by Ministry of Science and Technology and Fujian Province), Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China
由于化石燃料与农业化肥的使用, 使得大量的活性N进入大气[1], 与工业革命初期相比, 其氮沉降量增长了近2倍, 预计到2050年, 许多地区氮沉降量会再翻一番[2]。当前, 我国继欧洲, 美国之后成为世界三大高氮区之一, 尤其在工业化和农业集约化程度高的华北、东南和西南地区[3]。土壤微生物是土壤有机质和养分转化和循环的动力, 土壤酶直接参与土壤生态系统的C、N、P等许多重要的生态过程。因此, 氮沉降背景下, 可能首先影响土壤微生物的活性及其反馈方式, 进而影响生态系统的结构和功能。
当前, 氮沉降的研究主要开展于欧洲与北美的北方森林与温带森林, 对于热带与亚热带的研究较少[4], 由于热带与亚热带的养分循环较快, 对氮沉降的响应可能更加剧烈。当前温带森林关于酶活性的研究结果取得一定进展:施氮促进水解酶的活性, 但是氧化酶则表现出促进、无影响或抑制多种结果[5-8]。Treseder和Vitousek[9]研究表明土壤养分有效性的不同可能是各地研究结果差异的主要原因。而对于氮限制的北方森林和温带森林, 提高土壤氮的有效性将显得至关重要。许多研究表明, 氮的有效性将会影响酶活性, 进而改变凋落物及土壤有机质的分解速率[10-11]。然而, 相比于温带森林, 亚热带森林土壤的有效氮相对富集[12]。持续氮沉降, 可能会造成土壤氮饱和现象而产生抑制土壤微生物活性的现象。并且, 磷限制问题可能在亚热带地区更加突出, 其限制作用可能随着氮的添加而加剧[13]。因此, 土壤微生物酶活性对氮沉降的响应结果及机制可能不同于温带。
我国中亚热带地区, 由于其雨水充沛, 森林群落种类丰富, 是全球同纬度地带上的“绿洲”, 有着旺盛的能量转化和物质循环的能力, 以及极强的生物生产力与生态效应, 是全球碳循环重要的组成部分[14]。氮沉降对土壤微生物的扰动必将会影响中亚热带土壤的养分循环, 然而关于中亚热带天然林土壤微生物对氮沉降的响应鲜有报道。因此, 本试验以米槠天然林为样地, 探究土壤微生物量和土壤酶活性对长期氮沉降的响应情况, 为氮沉降背景下中亚热带天然林的土壤养分循环的响应提供依据。
1 材料与方法 1.1 研究区概况研究地位于福建省三明格氏栲自然保护区(26°11′N, 117°28′E)内, 样地海拔为315 m, 年均气温19.4℃, 年均降雨量1700 mm (主要集中在3-8月份), 年均蒸发量1585 mm, 相对湿度79%, 属于中亚热带季风气候, 土壤为黑云母花岗岩发育的红壤。群落植物种类丰富且分层明显。其中乔木主要有米槠(Castanopsis carlesii)、木荷(Schima superba)马尾松(Pinus massoniana)、虎皮楠(Daphnipnyllum oldhami)等, 且优势种为米槠。
1.2 试验设计2012年11月, 在米槠天然林内选取坡面平坦且一致的地段设置氮沉降长期试验样地, 包括对照(CT)、低氮(LN)和高氮(HN)3种施氮处理, 每个处理4个重复, 共设置了12块大小为10 m×10 m的样地, 各样地间相隔在10 m左右。
氮沉降处理:在12块样地内, 以三明地区年平均氮沉降量(36.2 kg hm-2 a-1)为参考值, 设置CT (0 kg hm-2 a-1)、LN (40 kg hm-2 a-1)和HN (80 kg hm-2 a-1), 施氮采用NH4NO3(分析纯), 溶于20 L去离子水中, 每月月初以溶液的形式在样方内均匀喷洒, 全年分12次模拟氮沉降。对照处理喷洒等量去离子水以减少因外加水对生物地球化学循环的影响。
1.3 土壤样品采集2016年1月, 在12个样方内按照“S”型随机设置5个取样点, 去除表面凋落物, 按土壤的发生层划分为淋溶层(A层), 取土深度约为8 cm;淀积层(B层), 取土深度约为8-20 cm层, 用土钻钻取。将采集的土壤迅速带回实验室, 迅速用冰块冷藏带回实验室, 去除可见根系等动植物残体, 一部分样品置于4℃冰箱中保存, 用于微生物生物量、土壤酶活性的测定;另一部分土壤室温风干保存, 用于测定土壤有机碳等基本理化指标。
1.4 测定指标及方法土壤有机碳、全氮用碳氮元素分析仪(Elementar Vario EL III, Elementar, 德国)测定, 土壤pH通过玻璃电极pH计(STARTER 300, OHAUS, 美国)测定, 水土比为2.5:1, 土壤矿质氮测定, 称取5g鲜土加入20 mL 2 mol/L KCl进行浸提, 振荡离心后, 上清液经定量滤纸过滤, 用连续流动分析仪(Skalar san++, Skalar, 荷兰)测定滤液中的NH4+-N、NO3--N[15]。土壤DOC测定, 用去离子水浸提5 g鲜土, 水土比为4:1, 振荡离心后, 经0.45 μm滤膜抽滤, 用总有机碳分析仪(TOC-VCPH/CPN, Shimadzu, 日本)测定滤液中有机碳含量。土壤DON测定, 取5 g鲜土加入20 mL 0.5 mol/L K2SO4, 振荡0.5 h后4000r/min离心10 min, 经定量滤纸过滤, 用连续流动分析仪(Skalar san++, Skalar, 荷兰)测定滤液中的TN、NH4+-N和NO3--N, 其计算公式为:DON=TN-NH4+-N-NO3--N[16]。
微生物量碳、氮采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提法[17], 用总有机碳分析仪(TOC-VCPH/CPN, Shimadzu, 日本)测定提取液中有机碳含量, 用连续流动分析仪(Skalar san++, Skalar, 荷兰)测定总氮含量。土壤微生物磷采用氯仿熏蒸-NaHCO3浸提法[18], 用连续流动分析仪测定磷酸根含量。土壤微生物量碳计算公式:BC=ΔEC/kC, 式中ΔEC为熏蒸与未熏蒸土壤有机碳含量的差值, kC为转换系数, 取值0.38。土壤微生物量氮计算公式:BN=ΔEN/kN, 式中ΔEN为熏蒸与未熏蒸土壤有机氮含量的差值, kN为转换系数, 取值0.45;土壤微生物量磷计算公式为:BP=ΔEP/kP, 式中ΔEP为熏蒸与未熏蒸土壤磷含量的差值, 转换系数kP取值0.4。
微生物熵按照Anderson等[19]的方法计算, 即微生物量碳(MBC)与有机碳(SOC)的比值。
土壤酶活性参照Saiya-Cork和Sinsabaugh[7]的方法提取和培养土壤中6种与碳、氮、磷循环相关的水解酶和氧化酶。方法如下:取1 g新鲜土壤, 用125 mL 50 mmol/L的醋酸盐缓冲液(pH=5)提取, 用磁力搅拌器搅拌5 min使其均质化, 用移液器取200 μL移于96孔微孔板。
用伞形酮(MUB)作为底物标示水解酶活性, 用L-二羟苯丙氨酸(DOPA)为底物标示氧化酶活性。微平板置于暗环境下经过20℃恒温培养后, 用多功能酶标仪(SpectraMax M5, Molecular Devices, 美国)测定其荧光度(水解酶)或吸光度(氧化酶)。6种土壤酶的名称、缩写、类型及所用标定底物见表 1。各种酶都通过预实验确定获得最大酶活性所需要的底物浓度和培养时间。
酶Enzyme | 缩写Abbreviation | 类型Type | 底物Substrate |
β-葡萄糖苷酶 | βG | C-targeting hydrolytic | 4-MUB-β-D-glucoside |
纤维素水解酶 | CBH | C-targeting hydrolytic | 4-MUB-β-D-cellobioside |
多酚氧化酶 | PHO | C-targeting oxidase | L-DOPA |
过氧化物酶 | PEO | C-targeting oxidase | L-DOPA |
β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(几丁质降解酶) | NAG | N-targeting hydrolytic | 4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide |
酸性磷酸酶 | ACP | P-targeting hydrolytic | 4-MUB-phosphate |
用Excel 2013和SPSS 19.0软件对数据进行处理。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD进行显著性检验;采用Canoco Software 5.0软件, 以6种酶活性为响应变量进行主成分分析(PCA);以6种酶活性为响应变量, 同时以土壤基本理化性质及微生物生物量为解释变量做冗余分析(RDA);绘图由Origin 9.0软件完成。
2 结果 2.1 土壤基本理化性质经过3年的氮沉降模拟实验, 处理间的土壤有机碳、总氮均无显著性差异(表 2)。施氮后土壤pH均有变小的趋势, 但只有在A层土壤达到差异显著性。高氮处理显著提高了B层土壤NH4+-N与NO3--N的浓度(P < 0.05)。A层土壤中, 低氮处理的可溶性有机碳(DOC)的浓度为66.80 mg/kg, 显著高于其他两个处理。可溶性有机氮(DON)浓度则随着施氮量的增加而上升, HN与CT之间差异达到显著水平(P < 0.05)。
土层 Soil horizon |
处理 Treatments |
土壤有机碳 SOC/ (g/kg) |
总氮 Total N/ (g/kg) |
酸碱度 pH |
铵态氮 NH4+-N/ (mg/kg) |
硝态氮 NO3--N/ (mg/kg) |
可溶性有机碳 DOC/ (mg/kg) |
可溶性有机氮 DON/ (mg/kg) |
A | 对照处理Control (CT) | 36.6±7.5a | 2.7±0.3a | 4.1±0.1a | 10.8±2.5a | 1.4±0.3a | 41.9±12.4b | 50.0±5.3b |
低氮处理Low nitrogen (LN) | 39.2±13.0a | 2.7±0.5a | 4.0±0.1ab | 7.2±1.0a | 1.6±0.5a | 66.8±3.4a | 58.7±7.0b | |
高氮处理High nitrogen (HN) | 33.3±8.0a | 2.5±0.3a | 4.0±0.09b | 9.6±4.2a | 1.6±0.6a | 39.9±8.0b | 132.3±12.9a | |
B | 对照处理Control (CT) | 13.6±1.1a | 1.4±0.1a | 4.2±0.0a | 0.2±0.1b | 0.9±0.6b | 17.2±1.1a | 26.4±3.0c |
低氮处理Low nitrogen (LN) | 15.4±2.6a | 1.5±0.1a | 4.2±0.1a | 0.3±0.1ab | 1.8±0.4ab | 15.5±4.0a | 42.3±9.8b | |
高氮处理High nitrogen (HN) | 14.8±1.7a | 1.5±0.1a | 4.2±0.1a | 0.4±0.1a | 2.0±0.7a | 17.6±4.15a | 89.0±10.2a | |
表中数值为平均值±标准差, 不同小写字母表示同一土层, 不同处理间差异显著(P < 0.05) |
如表 3, 低量氮沉降(LN)提高了A层和B层土壤的MBC和MBN含量。然而, 施氮后A层的土壤的MBP显著减少, 其数量关系为CT > LN > HN (P < 0.05)。
土层 Soil horizon |
处理 Treatments |
微生物量碳 Microbial biomass carbon (MBC)/(mg/kg) |
微生物量氮 Microbial biomass nitrogen (MBN)/(mg/kg) |
微生物量磷 Microbial biomass phosphorus (MBP)/(mg/kg) |
A | CT | 538.0±37.9ab | 43.2±7.8ab | 37.9±3.6a |
LN | 560.5±12.0a | 48.2±3.6a | 25.1±4.8b | |
HN | 500.5±39.5b | 37.3±5.0b | 13.3±4.2c | |
B | CT | 203.45±51.1b | 20.8±2.4b | 25.5±12.6a |
LN | 362.1±59.7a | 25.7±2.0a | 17.4±3.6a | |
HN | 285.3±53.7a | 20.2±2.5b | 6.1±3.2b | |
表中数值为平均值±标准差, 不同小写字母表示同一土层, 不同处理间差异显著(P < 0.05) |
如图 1, A层的微生物熵对于施氮的响应均无显著性差异。LN提高了B层土壤的微生物熵, 其微生物熵值显著大于CT (P < 0.05)。
2.4 土壤酶活性如表 4, LN和HN处理均明显提高了A层土壤中β-葡萄糖苷酶(βG)活性, 但对B层中βG无显著影响。LN处理后, 纤维素水解酶(CBH)活性显著高于HN与CT (P < 0.05), 分别是HN与CT的2.26倍与2.84倍。LN和HN处理分别显著提高了A层土壤中多酚氧化酶(PHO)和过氧化物酶(PEO)的活性, 但两种酶在B层土壤中并未发生明显变化(P > 0.05, 表 4)。在A层土壤中, LN显著提高β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性(P < 0.05), 而在B层土壤中则显著降低了NAG活性(P < 0.05)。LN和HN显着提高各土层酸性磷酸酶(ACP)活性(P < 0.05)。
土层 Soil horizon |
酶 Enzyme |
对照 CT |
低氮 LN |
高氮 HN |
土层 Soil horizon |
酶 Enzyme |
对照 CT |
低氮 LN |
高氮 HN |
A | ACP | 123.8±24.5b | 295.6±83.3a | 187.5±60.9ab | B | ACP | 34.9±15.6c | 126.6±14.2a | 84.2±12.7b |
βG | 22.6±9.6b | 55.8±13.0a | 40.6±12.0ab | βG | 36.0±11.2a | 41.5±3.8a | 45.5±7.0a | ||
CBH | 5.4±1.8b | 15.3±2.7a | 6.8±1.9b | CBH | 7.86±1.9a | 7.9±1.3a | 5.8±0.5a | ||
NAG | 44.9±26.3b | 93.6±19.1ab | 116.6±44.3a | NAG | 122.1±14.5a | 92.5±13.0b | 45.1±5.8c | ||
PEO | 9.6±1.8b | 18.8±3.9a | 14.9±1.0a | PEO | 22.2±5.1a | 21.8±3.9a | 19.4±1.4a | ||
PHO | 0.9±0.2b | 7.9±4.9a | 2.9±0.8b | PHO | 4.2±1.6a | 3.7±2.1a | 2.8±0.6a | ||
表中数值为平均值±标准差, 不同小写字母表示同一土层, 不同处理间差异显著(P < 0.05) |
以土壤A层6种酶活性数据作为响应变量, 进行PCA分析, CT、LN、HN都按照一定的规律进行了很好的聚类(图 2a), 说明施氮处理后显著的影响了A层土壤的酶活性变化。以A层土壤酶活性为响应变量, 以A层土壤的理化性质为解释变量进行RDA分析(图 2b), 其中选择了贡献值靠前的4个理化性质作为解释变量, 其第一轴解释了变量的59.82%, 第二轴解释了6.50%, 且DOC与MBP分别解释了土壤酶活性变异的39.6%和20.0%(P < 0.05)。其中MBP、pH与第一轴呈正相关, DOC、DON与第一轴呈负相关。
B层土壤中的HN与CT表现出一定的差异, 而LN则处于HN和CT的过渡(图 2c)。图 2d表明, 两轴共同解释了土壤酶活性变异的54.99%, 而MBN、DON、DOC是解释度最高的3个环境因子, 其中MBN解释了B层土壤酶活性变异的28.9%, 且3个环境因子都与第一轴呈正相关。MBN、DON与NAG均有很强负相关性。
3 讨论 3.1 土壤微生物生物量、微生物熵对氮沉降的响应土壤微生物量是土壤活性有机质中最活跃与易变的部分, 反映着参与调控土壤中能量流动和养分循环以及有机物质转化的微生物数量[20]。MBC由于具有高的敏感性, 可以反映出土壤环境的细微变化[21]。LN处理后, 提高了土壤中氮的有效性, 土壤中的C/N比降低, 有利于微生物对土壤有机质的分解与利用, 从而增加土壤中MBC含量。但是, 随着施氮量的增加, A层土壤的MBC含量受到抑制(P < 0.05)。这与前人多数研究结果一致[22], HN处理后, 大量的NH4+会取代土壤中与有机质结合的碱性阳离子(如:K+、Ca2+、Na+), 导致碱性阳离子容易被淋洗出土壤, 降低了土壤的酸性缓冲能力。同时由于土壤酸化, 土壤中的多价水解性阳离子(Fe3+、Al3+)的溶解性提高, 从而对土壤微生物群落产生一定的抑制作用[23]。A层MBN对氮沉降的响应与A层MBC具有相同的趋势。然而毒害作用在B层并不明显, 施氮提高了氮的有效性促进MBC积累。
MBP反映着土壤中有机-无机磷素的转化过程。本地区土壤属于酸性红壤, 含有大量的铁和铝氧化物, 对土壤中的P具有很强的固定能力[24], 造成P的有效性较低。而氮沉降加快了土壤的养分循环[25], 释放出一定的磷被植物吸收, 进而减少了土壤中微生物可利用的磷。
土壤微生物量碳MBC与土壤总有机碳SOC的比值被称为微生物熵, 是一个评价土壤有机碳增加或缺失的指标[26]。然而施氮后, A层土壤各处理间并未产生显著性差异。张帆等[27]认为, 由于冬季的温度较低, 微生物熵敏感性下降。因此, A层土壤中各处理间表现出的差异不显著, 可能与微生物熵的季节性动态有关。而在B层土壤中, LN显著提高了微生物熵, LN处理下, 微生物利用SOC的能力增强, 与LN提高B层土壤MBC、MBN的结论一致。
3.2 土壤酶活性对氮沉降的响应土壤酶是土壤生物化学过程的积极参与者, 在生态系统物质循环和能量流动过程中扮演着重要的角色, 主要来源于土壤微生物、根系的分泌物及动植物残体分解释放的过程[28]。
底物以碳为主的多糖(纤维素)、芳香族化合物(木质素)和脂肪族化合物[29], 其分解酶主要为纤维素水解酶类(βG和CBH)和木质素分解酶类(PHO和PEO)。
LN处理显著提高了纤维素分解酶的活性。Fog[30]研究中发现高水平的无机氮添加显著提高纤维素含量高的凋落物分解速率。而Sinsabaugh等[31]在温带森林的研究中发现, 纤维素酶的活性随着氮素可利用性的提高而增强。本研究中HN处理中纤维素酶活性虽然提高, 但与CT相比并不显著, ,这可能是因为本试验中HN可能已经达到了土壤的氮饱和点, 而过量的N对纤维素分解酶产生抑制作用, 从而减弱了纤维素等有机质的分解, 这与HN处理下MBC的含量较低的结论具有一致性。而在温带森林氮的有效性远低于亚热带森林, 氮沉降氮促进纤维素酶活性的幅度高于本试验样地。
近年来的研究普遍认为, 氮沉降会抑制木质素分解酶的活性, 这主要是由于:(1)大多数真菌属于贫营养型, 对氮源的需求量并不高, 外加氮源的条件下, 其竞争力低于富营养型的细菌[32]; (2) NO3-影响了白腐担子菌对氧化酶基因的表达, 而抑制了木质素分解酶[33]。然而, 本试验结果表明:LN促进了两种木质素分解酶的活性。Carriero等[5]研究认为, 氮沉降对木质素分解酶等氧化酶活性的影响主要取决于凋落物的性质, 木质素含量较高的凋落物对木质素分解酶产生抑制作用, 而易分解的凋落物则对其产生促进作用或者无影响。Hogervorst等[34]对松树凋落物分解的研究中发现:适量的有效性氮可以促进真菌生长达到最大值, 这表明施氮并不一定抑制真菌活性。这与本试验中, LN促进A层土壤微生物量积累的结果具有一致性。真菌作为善于分解木质素的一类, 在LN处理下活性达到最高, 提高了木质素分解酶活性。B层土壤中, 纤维素水解酶与木质素分解酶活性在各处理间差异并不显著, 这可能与底层土壤有机质含量及养分有效性较低有关。
底物以氮为主的氨基化合物、缩氨酸和非缩氨基化合物[29], 分解酶β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶, NAG。在B层土壤中, 施氮处理抑制了土壤NAG的活性。当土壤中N的有效性低时, 微生物需要以消耗自身生长及代谢为代价而生产NAG, 以便将土壤中的几丁质分解成可利用的无机氮[35]。然而, 施氮提高了土壤中的氮有效性, 满足了微生物的生长需求, 因此并不需要产生过多NAG而造成酶活性相对降低。
磷主要存在于单酯和多脂中[36], 分解酶主要有酸性磷酸酶, ACP。施氮促进土壤中ACP的活性。这与大多数的研究结果一致[5, 7, 37]。孙翠玲等[38]研究则表明, ACP活性与土壤中全氮和碱解氮的含量呈正相关。土壤氮增加, 增加了微生物对磷素的需求, 因此促进了ACP的活性, 进而水解更多有机磷被吸收利用。
3.3 酶活性变化的关键驱动因子DOC是影响A层土壤酶活性变化的主要环境因子, 并且与纤维素水解酶、木质素分解酶及酸性磷酸酶的活性具有正相关关系(图 2b)。LN处理下, 土壤DOC显著提高, 这与Pregitzer等[39]的研究结果一致。而DOC作为微生物最主要的能源[40], 反映着土壤中微生物的活性变化[41]。微生物活性提高则需要从土壤中摄取更多的营养元素供其生长。因此, 本研究表明, 氮沉降背景下, DOC驱动A层土壤纤维素水解酶类、木质素分解酶类及酸性磷酸酶活性, 促进微生物更好地利用土壤中碳、磷元素。然而由于矿质土壤对DOC的吸附作用与土层的滞留性[42], 造成B层土壤的DOC含量相对较低, 并且其含量不受施氮影响。与A层驱动因子不同, MBN和MBC是驱动B层土壤酶活性的主要因子(图 2d), 这与Zhou等[43]的研究结果一致。Schimel和Weintraub[33]建立的一个关于“微生物-酶活性”的模型中表明, 土壤微生物量在土壤的C、N周转中起着关键的作用。Allison等[44]也强调气候变化下, 土壤微生物生理及生物量在碳氮循环中的重要性。因此, 在养分有效性较低的B层, 微生物量是驱动酶活性的关键因子。
4 结论经过3a的氮沉降模拟实验, LN处理促进了A层土壤纤维素水解酶、木质素分解酶及酸性磷酸酶活性。RDA表示DOC是驱动A层土壤酶活性的主要环境因子, LN提高了A层土壤DOC含量, 促进了土壤微生物生物量。同时提高纤维素水解酶和木质素分解酶活性。A层土壤的碳含量占土壤碳库的比例较高, 施氮处理后促进了土壤的碳循环, 因此在氮沉降背景下, 中亚热带米槠天然林土壤作为碳源汇的问题值得注意。由于模拟氮沉降的时间长短对土壤微生物群落组成也有一定的影响, 因此本试验样区氮沉降模拟试验还需持续进行, 以便更好地探究土壤微生物量及酶活性对氮沉降的长期响应, 为长期氮沉降对森林生态系统土壤微生物的影响以及探索中亚热带天然林土壤碳源汇问题提供科学依据。
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