许多重金属(例如Cu、Zn等)是生物代谢必需的微量元素,但是当环境中重金属数量超过某一阈值时,就会对生物产生一定的毒害作用^{[1, 2]}。

我国土壤重金属污染物主要源于工业废物、废渣,城市垃圾及污水灌溉和大气沉降。土壤受污染面积已达上千万公顷,污染物中有Cd、Hg、Cu、Zn、Cr等^[3]。重金属在生态系统中会沿着食物链传递和富集,进而深刻的影响整个生态系统各营养阶层的生物^[4]。重金属污染不仅影响种子萌发,还会通过质体流作用和扩散作用进入植物体中,进而影响作物代谢。前期研究结果表明,Zn、Cu、Cd能显著影响被其污染的土壤中生长的植物上取食的蚜虫的生长发育与繁殖^{[5, 6]},且小麦中重金属的含量在800 mg/kg的Zn²⁺浇灌浓度范围内随着土壤中含量的增加而增加^[7]。长期以来,昆虫和植物存在着协同进化的关系^[8],因此昆虫的取食行为势必会产生相应的变化。

麦长管蚜Sitobion avenae (Fabricius)广泛分布在全世界各麦区,其通过刺吸汁液影响作物的产量。取食行为的改变则是麦长管蚜应对重金属胁迫的重要方式之一。镉胁迫麦长管蚜一代之后,取食适合度有所下降^[9],但在重金属长期胁迫下,蚜虫取食行为和相关机制的研究尚未见相关报道,而这些内容可以用于探讨外界环境胁迫条件下植物与蚜虫协同进化关系,同时可以为土壤污染治理提供理论基础。

刺探电位技术(EPG)是用于研究刺吸类昆虫取食行为的一项重要技术^{[10, 11, 12]}。应用此技术展开研究的昆虫包括蚜虫类^{[13, 14, 15]}、蝽类^{[16, 17]}、飞虱和粉虱类^{[18, 19]}等。在这些研究中,根据昆虫刺吸植物的刺探电位波形,结合植物组织内部位置,研究昆虫对寄主的适应性和环境条件对昆虫取食行为的影响。本研究采用EPG技术,选取np波、C波、E1波和E2波四类关于“寻找”、“刺探”、“取食营养”关键过程的指标^[19],蚜虫口针没有插入到叶片时的波形为np波；在蚜虫刺探食物,启动口针,尝试穿透植物真皮和叶肉时会形成C(A+B+C)波,蚜虫的口针在刺入韧皮部筛管后,在被动吸食植物汁液之前会分泌水溶性唾液,形成唾液鞘,这个过程的EPG波形为E1波；麦长管蚜被动吸食营养时所呈现出的波形是E2波^{[11, 20]}。本文在不同浓度Zn²⁺长期处理寄主植物土壤后,测定不同代数麦长管蚜各个取食阶段刺吸电位的变化,从而明确重金属Zn²⁺长期胁迫条件下,麦长管蚜取食行为的变化规律,为重金属长期胁迫后昆虫的遗传进化理论以及昆虫与植物协同进化理论的研究提供理论依据。

麦长管蚜单克隆系由本实验室获得。所有蚜虫均在养虫室内饲养,温度为(20±0.5)℃；相对湿度为(60±10)%；光周期为16 L:8 D、光强为3000 lx。连续饲养15代单克隆系蚜虫。

饲养蚜虫的寄主小麦品种和供试小麦品种均为矮抗58,种植前清水避光催芽,露白后种植在6 cm×7 cm×8 cm的塑料花盆中,每盆种植3粒种子,出苗后每盆选留1株长势一致的麦苗。用沙,腐殖质,黑壤土体积以1:3:3比例混合作为培养基,每盆严格称量250 g培养基(干重)。放入光照培养箱内培养,根据麦苗生长的需求定时定量浇水。

小麦刚出芽后长至3—4 cm出苗时,每盆同时分别浇灌不同浓度处理的Zn²⁺溶液(七水合硫酸锌)使每1kg干重土壤中分别含200、400、800 mg的重金属Zn²⁺,浓度根据Irena在污染地区的调查结果稍作修改而设定^[21],以浇灌相同体积的蒸馏水为对照。根据高欢欢研究结果,浇灌浓度在800 mg/kg 以内,土壤重金属浓度会随浇灌浓度的增加而升高。当麦苗生长至14d时,将同一天出生的单克隆系初龄若蚜接种在重金属处理过的小麦上饲养,若蚜长至成蚜虫并产仔时,同样将同一天出生的初龄仔蚜转移至新处理过的小麦叶片上,此为第二代,采用同样的方法连续饲养15代。分别取第1、5、10、15代的羽化24h内的无翅成蚜用于实验。

试验在(25±2)℃的室温下进行,刺探电位仪为DC-EPG Giga-4 (荷兰瓦赫宁根大学制造)。选择体型大小较一致的无翅成蚜与出苗后14d小麦苗分别连入刺探电位仪生物电流放大器的昆虫电极和植物电极。在与养虫室内相同的环境条件下,昆虫饥饿1h后开始EPG记录,连续8 h,每个处理用20头蚜虫重复20次^{[22, 23, 24]}。

用EPG自动分析软件Probe 4.3将连续记录的EPG按不同的波形进行分类统计各项指标。运用SPSS17.0软件进行单因素方差分析,采用SNK(Student-Newman-Keuls)方法进行多重比较,各处理间的显著性差异均设为P＜0.05水平。

麦长管蚜在重金属锌胁迫下的刺吸电位图与标准图谱一致,将np波、C波、E1波和E2波共9种指标进行统计分析。

第1、5代时,随着浇灌浓度的增加非刺探波的总持续时间呈先减少后增加的趋势,且经过200、400 mg/kg的Zn²⁺处理后,np波的时间显著减少而800 mg/kg的则显著增加。到第10、15代时,200、800 mg/kg的Zn²⁺处理下np波的时间显著长于对照,但二者间无显著差异。Zn²⁺浓度为200、400、800 mg/kg时均从第10代开始np波时间显著高于对照。说明,高剂量重金属Zn²⁺处理后蚜虫增加了植物体外寻找适宜刺探植物细胞的时间,第10代为关键世代。

统计np波次数分析可知(表 1),各世代随着处理浓度的增加变化趋势不同,第1代时,非刺探波的数量出现先减少后增加的变化趋势,200 mg/kg的Zn²⁺处理下np波的出现次数显著少于对照,800 mg/kg的则高于对照。第5代时,与对照相比,200、800 mg/kg的Zn²⁺显著增加了np波的个数。Zn²⁺连续处理麦长管蚜10代后,各浓度Zn²⁺处理后np波的个数均显著多于对照,800 mg/kg的Zn²⁺处理后的结果显著高于其他3组。

15代时与对照相比,np波出现次数并不明显,是因为np波持续时间相比其它世代均较长。在不同处理浓度下,随着世代的增加np波数量均呈现先减少后增加又减少的波状趋势,但第10代时np波出现次数最多。综上所述,经过多代高剂量Zn²⁺处理后会增加取食难度。

对C波的总持续时间研究发现(表 2),随着世代的增加,C波持续时间的变化规律不相同。第1代时,C波的总持续时间先缩短后延长,200 mg/kg的Zn²⁺则显著缩短了该时间,400 mg/kg的Zn²⁺处理与对照无显著差异,而800 mg/kg的Zn²⁺显著延长了C波的时间。第5代时,各处理浓度与对照之间差异不显著。到第10代时,200 mg/kg与800 mg/kg的Zn²⁺增加了C波的时间但二者间无显著差异。400 mg/kg处理后的指标与对照差异不明显。第15代时,800 mg/kg的Zn²⁺处理后C波时间显著高于其他3组,而3组间无显著差异。对3个浓度下不同世代的数据分析,第10代时C波总时间最长。说明,高剂量Zn²⁺处理后蚜虫的刺探时间和难度增加,第10代为关键世代。

不同世代,随着处理浓度的增加,麦长管蚜的刺探波次数表现出不同的变化趋势。第1、10代分别与C波的总持续时间变化趋势相同,只是第1代400 mg/kg的Zn²⁺处理后C波的数量显著少于对照,第5代各浓度的Zn²⁺处理可以使C波显著少于对照但处理间差异不显著。第15代,C波的数量变化趋势与差异性与C波的时间相同。对不同世代的数据分析发现虽不同浓度下,随着世代的增加变化趋势有异,但第10代时C波的数量最多。说明,低剂量Zn²⁺的短期处理减少了麦长管蚜刺探波的数量,长期高剂量的Zn²⁺处理不仅延长了刺探波的持续时间,也增加了刺探次数,可见麦长管蚜的取食受到严重的阻碍。且第10代对长期胁迫下麦长管蚜的取食行为有着重要的影响。

对E1波的持续时间研究发现(表 3),第1代时随着Zn²⁺浓度的增加,单独E1波的持续时间呈现先延长后缩短的趋势,第5代时各处理与对照间无明显差异,第10代该指标随着Zn²⁺浓度的升高而升高,各处理间差异显著且均高于对照。400 mg/kg与800 mg/kg处理下指标差异不显著。第15代的变化趋势及差异性与第1代相同。

随着Zn²⁺浓度和处理世代的增加,伴随E2波的E1波时间呈现先缩短后延长的规律,在Zn²⁺处理第1代时,3种浓度的Zn²⁺使其均显著低于对照,随着浓度的增加而不断缩短,800 mg/kg的Zn²⁺使其缩短至最低。但处理10代和15代之后,400 mg/kg和800 mg/kg的Zn²⁺胁迫下与对照差异并不显著。

第1、5代时伴随稳定E2的E1波的总持续时间的变化趋势及差异性与伴随E2波的E1波总持续时间相同。第10代时,200 mg/kg的Zn²⁺处理后的伴随稳定E2的E1时间与其他3组有显著差异,但3组间差异不明显,第15代时各处理组的时间较对照减少,400、800 mg/kg的Zn²⁺处理后的指标间无显著差异,但二者显著多于200 mg/kg的Zn²⁺处理后的时间。说明重金属锌处理后会延长蚜虫分泌唾液的时间,且会缩短伴随稳定E2的被动取食营养的时间,高浓度处理下随着世代的增加会体现出一定的适应性。稳定E2波即时间超过10min的E2波更能反映出实际有效取食营养的情况。

研究E2波的数量(表 4)发现,第1代时200 mg/kg的处理下E2波出现的个数与其他3组有显著差异,且3组间差异不明显。第5代时800 mg/kg的Zn²⁺显著减少了E2波出现的次数,另外两各处理组与对照则无差异。第10代,各处理浓度会减少E2波的个数但处理组间的E2波数量无差异。第15代,200、800 mg/kg的Zn²⁺可显著减少E2波的个数,而400 mg/kg的结果则相反,由此可见,400 mg/kg是重金属胁迫麦长管蚜时比较关键的浓度。

进一步研究稳定E2波的数量发现第1代,所有处理组与对照加无显著差异,第5、10、15代稳定E2波的出现个数的变化趋势及差异性与E2波的数量相同。说明,麦长管蚜的被动取食明显受到了总金属Zn²⁺影响,而且重金属对其有一定的累积效应。

重金属Zn²⁺严重影响蚜虫的取食行为。表现在非刺探波的总持续时间与对照组有显著的差异。非刺探波的增加表明取食难度也相应的增加。研究E1波时间与E2波数量的共5类指标发现,虽然随着浇灌浓度的增加取食波形变化趋势不同,但与对照有显著差异。综合各类指标表明重金属严重影响蚜虫的取食行为^[25],尤其是高剂量的Zn²⁺多代处理后取食难度增加。这与武晶晶研究麦长管蚜在镉胁迫下的取食适合度的结论一致^[9]。

低剂量的Zn²⁺促进麦长管蚜对小麦的取食,高剂量的Zn²⁺则对其有抑制作用。200 mg/kg的Zn²⁺处理后,非刺探过程的np波、尝试穿透表皮和叶肉细胞的C波这两类过程波的总持续时间和数量都显著少于对照,表明其有效取食过程增加,而800 mg/kg的高浓度Zn²⁺处理后这两类波的时间和出现次数显著高于对照,表明有效取食过程减少。蚜虫通过增加寻找合适位置的时间与次数来选择合适寄主。研究韧皮部取食的3类E1波的时间以及两类E2波的次数均有低浓度促进取食、高浓度抑制取食的结论,这可能是因为低浓度的Zn²⁺有效的补充了蚜虫体内的必需元素Zn²⁺,而较高浓度的重金属Zn²⁺改变了植物膜通透性,叶片细胞发生变化^[26],从而减少了刺探的几率,增加了寻找合适刺探位置的时间。高欢欢对经过长期镉处理的麦长管蚜进行酶活力测定也得出了类似的结论,低剂量的胁迫会促使超氧化物歧化酶和乙酰胆碱酯酶表达量增加而高剂量的则会抑制两种酶,从而限制防御作用^[7]。低浓度处理时出现单独E1波时间、E2波的个数由起初与对照无显著差异到15代时显著减少的现象可能是由重金属Zn²⁺在蚜虫体内的积累效应引起的^[27]。有关过量重金属胁迫昆虫生理、生化及分子生物学研究已经有不少报道^{[28, 9]},但是如何将取食行为变化与生理生化及分子生物学联系起来有待于进一步的研究。

本研究发现,第1代麦长管蚜在重金属Zn²⁺胁迫下np波和C波的总持续时间及数量随着浓度的增加均呈现先减少后增加的趋势。E1时间的3类指标以及E2数量的两类指标的变化趋势不相同。长期胁迫后虽各类指标变化不同,但发现400 mg/kg的Zn²⁺处理后非刺探波和刺探波的时间和出现次数与对照相当或略少,有关韧皮部取食的E1和E2波的指标均增加,高于此浓度非刺探和刺探波时间与数量增加,但涉及有效取食营养的E类波却减少,即取食难度增加。由此可知关键浓度为400 mg/kg。对多代数据的分析可知,np波和C波类指标从10代开始增加。伴随E2波的E1波时间、E2类指标则是从第5代开始出现变化。由此可知,关键世代为5代和10代。这可能是因为400 mg/kg的Zn²⁺处理土壤,通过食物链影响到麦长管蚜的取食,这个处理浓度是蚜虫的极限耐受浓度,高欢欢研究发现40 mg/kg对于镉长期胁迫下的麦长管蚜是关键浓度^[28]。起初蚜虫通过增加非刺探波的时间、数量等方法逃避重金属胁迫,而长期以重金属胁迫后的小麦为食,经过10代的诱导,蚜虫伴随着小麦协同进化,可能因受到遗传、可传承的环境因素或学习行为的调控通过改变取食的偏嗜行为以达到逐渐适应胁迫环境的目标^[29],这还需要进行基因组测序等技术手段来进一步明确,因昆虫主要依靠嗅觉和味觉系统来识别一些信息化合物,因而可以辅助其他电生理及化学方法来探究^[30]。

研究表明昆虫唾液成分可以诱导植物的抗性反应^[31],蚜虫取食行为是否从第5代或第10代开始发生相应的防御行为的变化,还需要对其唾液内各种酶活性以及基因的变化情况等进行进一步的研究。