土壤微生物是土壤有机质和养分转化、循环的动力，是维持土壤质量的重要因素，自然条件下土壤内部的变化是一个复杂而密切联系的过程，而微生物学指标能敏感地反映土壤质量的变化，是土壤质量评价体系中不可缺少的组成部分^[1]。但在农业生产中，施肥措施不仅直接影响作物的生长状况和产量，同时也明显影响土壤理化性质，并由此导致土壤微生物数量、活性和群落结构发生改变^{[2, 3]}。近年来，研究长期施肥措施^[4]和有机无机肥料配施^[5]等施肥制度对土壤微生物的影响尚有报道，主要涉及土壤微生物群落多样性的研究。土壤微生物多样性反映群落总体的动态变化，研究方法较多，而不同方法反映土壤微生物多样性的情况不同，其中磷脂脂肪酸法可以分析土壤微生物群落结构的多样性。因为不同种类微生物体内磷脂类化合物中的脂肪酸组成及含量存在极大的差异，可以区分出土壤革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、细菌、真菌、放线菌、原生动物和藻类等。缓控释肥料作为一类新型肥料已成为近年来的研究热点，然而迄今的研究集中在养分释放、作物和环境效应等方面^{[6, 7, 8]}，缺少对这类肥料的土壤肥力质量综合效应评价，特别是当前大量施肥现象严重，肥料种类和施用量对土壤微生物的影响较大，而有关缓控释肥料对土壤微生物群落多样性影响规律的研究较薄弱，以致在农田推广应用缓控释肥料尚缺乏强有力的理论支撑。有鉴于此，在前期对缓释复合肥料不同形态氮素养分释放和生物效应研究的基础上^[9]，本文采用室内恒温培养试验和磷脂脂肪酸法(Phospholipid Fatty Acid,PLFA)，研究该缓释复合肥不同施用水平对菜园土壤微生物生物量和群落结构多样性的影响，旨在进一步揭示缓控释肥料提高氮素利用效率和改善土壤肥力质量的实质，为农业生产上一次性简化施肥和应用该肥料提供科学依据。

供试土壤采自重庆市璧山县七塘镇蔬菜(茄子)基地，其基本理化性质为pH值 6.8，有机质13.8 g/kg，碱解氮99.7 mg/kg，有效磷22.6 mg/kg，速效钾134 mg/kg。供试肥料：化肥有尿素(N 46%)，磷酸二氢铵(N 11%; P₂O₅ 44%)，硫酸钾(K₂O 50%)；普通复合肥由尿素、磷酸二氢铵和硫酸钾按氮磷钾质量分数为14%、8%和8%复合造粒而成；缓释复合肥系西南大学研制的一种以快速有效化处理的优质有机肥为基础，与经缓释技术处理的化学肥料复合而制得的养分结构型非包膜缓复合肥，该肥料氮磷钾质量分数为14%、8%和8%，有机质为15.7%^[10]。

土壤恒温培养试验设置6个处理，3次重复；各处理施肥量见表 1。在适量施肥的基础上，设计缓释复合肥高量(增加1倍量)和超高量(增加3倍量)处理，目的在于探讨缓释复合肥高量施用条件下土壤微生物群落的适应性，为生长期长的覆膜栽培茄果类蔬菜以及果树等木本农作物一次性简化施肥奠定基础。

试验时称取过1 mm筛的风干土壤100 g和相应用量的肥料，逐次加入去离子水，使土壤和肥料充分混匀，将土壤装入玻璃培养管(长度150 mm，直径35 mm)内，然后用滴管加入剩余水量使之达到土壤田间持水量的80%左右，最后用保鲜膜封住管口，并在保鲜膜上均匀扎20个0.1 mm的小孔保证其通气条件，于恒温箱中25 ℃培养90 d，为保证整个培养过程中作用条件(水分、通气等)的一致性，每隔4 d采用重量法加水。到达预定培养时间后，每处理取3次重复的培养管，将其土壤全部取出充分混匀。一部分土壤用于土壤微生物量碳氮的分析；另一部分用无菌塑料袋装入，冷冻干燥后-70 ℃保存，用于PLFA分析。

土壤微生物量碳和氮采用氯仿熏蒸一硫酸钾浸提法测定^[11]。土壤微生物PLFA按照Bligh-Dyer^[12]方法提取后，用Agilent 6850气相色谱仪分析PLFA的成分。色谱条件为：HP-5柱(25.0 m×200 μm×0.33 μm)，进样量1 μL，分流比10∶1，载气H₂，尾吹气高纯N₂，助燃气是空气，流速0.8 mL/min。汽化室温度250 ℃，检测器温度300 ℃，柱前压10.0 psi。升高柱温：170 ℃起始，5 ℃/min升到260 ℃，而后40 ℃/min升至310 ℃，保持1.5 min。各成分脂肪酸通过美国MIDI Sherlock微生物鉴定系统(Version 6.1,MIDI,Inc.,Newark,DE)进行，标准品购于美国MIDI公司的C9—C20的脂肪酸甲酯，PLFA用C19:0做内标，换算PLFA的绝对含量。

细菌标记性脂肪酸有12:0，13:0，14:0，i14:0，15:0，i15:0，a15:0，16:0，i16:0，16:1 2OH，16:1w5c，i17:0，a17:0，cy17:0，18:0，cy19:0w8c等，其中i14:0，i15:0，a15:0，i16:0，i17:0，a17:0等代表革兰氏阳性细菌，16:1w5c，cy17:0，cy19:0w8c等代表革兰氏阴性细菌；真菌标记性脂肪酸有18:1w9c；放线菌标记性脂肪酸有10Me17:0和10Me18:0。一般饱和脂肪酸以12:0，13:0，14:0，16:0，18:0等之和计；单烯不饱和脂肪酸以16:1 2OH，16:1w5c，cy17:0等之和计。异构磷脂脂肪酸以i14:0，i15:0，i16:0，i17:0等之和计；反异构磷脂脂肪酸以a15:0，a17:0等之和计^{[13, 14, 15, 16]}。

试验数据用Microsoft Excel 2003整理，SPSS 13.0(Statistical Product and Service Solutions)软件进行方差分析(P < 0.05)、主成分分析和聚类分析，其中多重比较采用Duncan 法计算检验差异显著性(3次重复)，不同处理差异显著性用One-way ANOVA(单因素方差分析)检验。

土壤微生物量碳和氮是评价土壤养分有效性和土壤微生物状况随环境变化的敏感指标^[17]。施用缓释复合肥、化肥和普通复合肥提高了土壤微生物量碳0.5%—36.9%(表 2)，缓释复合肥土壤微生物量碳较CF1(化肥适量)显著增加8.2%—36.2%(表 2)，较CCF1(普通复合肥适量)提高了1.1%—27.3%(表 2)，缓释复合肥3个处理以SRF2和SRF3土壤微生物量碳最高，且显著高于其它处理。缓释复合肥处理较CK、CF1和CCF1显著增加土壤微生物量氮，施缓释复合肥3个处理土壤微生物量氮随着施肥水平增加而增加。土壤微生物量碳氮比可反映微生物群落结构信息，一般情况下细菌碳氮比在5∶1左右，放线菌在6∶1左右，真菌在10∶1左右^[18]。各处理土壤微生物碳氮比在5—7左右，缓释复合肥3个处理土壤微生物量碳氮比在5∶1左右，低于CK和CCF1。综上可知，缓释复合肥增加了土壤微生物量碳和氮，其中适量施肥水平以缓释复合肥高于化肥和普通复合肥。

表 3可知，室内恒温培养土壤分别检出18种PLFA，包括代表细菌的15种11—19碳PLFA，代表放线菌的10Me17:0和10Me18:0，代表真菌的18:1w9c。施肥增加了土壤PLFA种类，CK和CCF1检测出15种PLFA，CF1和SRF3有16种，SRF1有17种，SRF2有18种，缓释复合肥处理中以SRF1和SRF2最多。可见同一施肥量水平的3种肥料以SRF1的PLFA种类最多，而缓释复合肥施肥量大量增加(倍量增加)减少了微生物种类，可能是施肥量过高易对土壤微生物产生毒害作用。在所有PLFA中含量最低的是i14:0，变化范围为0.0520—0.129 nmol/g，缓释复合肥处理较CK显著增加，CF1和CCF1没有检测到。含量较高的PLFA是16:0，含量变化是1.04—1.54 nmol/g，缓释复合肥处理显著大于CK、CF1和CCF1。适量施肥水平SRF1土壤微生物总PLFA含量显著高于CF1和CCF1，增幅分别为19.1%和14.3%，且缓释复合肥处理较CK、CF1和CCF1显著增加土壤微生物总PLFA含量7.4%—26.7%、17.6%—38.7%和12.8%—33.0%。缓释复合肥提高了土壤微生物PLFA种类，且总PLFA含量最高，缓释复合肥3个处理以适量和高量表现最好。

土壤中的细菌、放线菌和真菌等微生物在土壤中占有极其重要的地位，对土壤中有机化合物的分解及腐殖质合成等起着重要作用^[19]。缓释复合肥较CF1和CCF1显著增加土壤细菌PLFA含量14.9%—36.1%和77.6%—27.5%(表 4)。对土壤放线菌的PLFA含量，SRF1和SRF2较CK、CF1和CCF1显著增加，SRF3显著降低，表明施肥量过高不利于放线菌的生存。土壤革兰氏阳性菌的PLFA含量以SRF2最高，施肥量一致的化肥和缓释复合肥对土壤革兰氏阴性菌的PLFA含量影响无显著差异。缓释复合肥3个处理以SRF2对提高土壤细菌、放线菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的作用最好。

细菌/真菌和革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌的比值常用来表征土壤中各菌群生物量的变化和两个种群的相对丰富程度及土壤生态系统的稳定性^[20]。表 4可知，缓释复合肥处理较CK、CF1和CCF1显著降低细菌/真菌值；与CF1和CCF1处理相比，缓释复合肥处理中SRF1和SRF2显著增加革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌值。一般饱和脂肪酸/单烯不饱和脂肪酸和异构磷脂脂肪酸/反异构磷脂脂肪酸被用作反映环境胁迫或营养限制^[21]。缓释复合肥处理较CF1和CCF1增加一般饱和脂肪酸/单烯不饱和脂肪酸值，而在低碳源和氧浓度、低pH和高温情况下，异构磷脂脂肪酸/反异构磷脂脂肪酸比率会增大^[21]，较CF1和CCF1，缓释复合肥处理异构磷脂脂肪酸/反异构磷脂脂肪酸比率较低。

通过对18种PLFA进行主成分分析(图 1)，前两个主成分可以解释总变异的83.9%。绝大多数细菌和放线菌PLFA在载荷图的上部，其中a11:0，i15:0，i16:0，a17:0，10Me18:0和cy19:0w8c在主成分二上有较高的载荷值。从施肥处理的主成分分析结果看(图 1)，缓释复合肥、化肥和普通复合肥较不施肥有明显的种群优势。SRF1和SRF2与主成分一和二均表现出极度正相关关系，两处理PLFA的结构差别较小，优势种群有a11:0，a17:0，i16:0；SRF3与主成分一表现出负相关，与主成分二显现出正相关关系。结合PLFA主成分和施肥处理主成分综合分析可知，大部分PLFA分布在施肥区，缓释复合肥超高量施肥水平与适量和高量施肥水平对土壤PLFA影响差距大。

图 1 土壤微生物主成分分析 Fig.1 Analysis of principal components about soil microorganism x1,a11:0;x2,i14:0;x3,14:0;x4,i15:0;x5,a15:0;x6,i16:0;x7,16:1w5c;x8,16:0;x9,i17:0;x10,a17:0;x11,cy17:0;x12,16:12OH;x13,10Me17:0;x14,18:1w9c;x15,18:0;x16,17:0 2OH;x17,10Me18:0;x18,cy19:0w8c

图选项

图 2是以欧式距离为尺度，用最小距离法对土壤微生物PLFA含量进行的聚类分析。不同施肥处理可分为5类，第1类包括CF1和CCF1，CK、SRF1、SRF2和SRF3各为一类。可见缓释复合肥不同用量对土壤微生物的影响不同。

图 2 土壤微生物聚类分析 Fig.2 Cluster analysis of soil microorganism

图选项

土壤是微生物生活的场所，土壤营养状况、酸碱性、质地、温度、水分和通气性等将会影响微生物的种类、数量和动态分布^[22]。其中肥料进入土壤后对土壤微生物的数量、组成与活性可产生显著影响，进而导致土壤微生物群落结构发生改变等。有研究认为施肥(有机质和氮肥等)有利于土壤微生物的丰富度和均匀度，尤其是对真菌^[23]。长期大量施用化肥虽然可以增加土壤养分，但降低了土壤酸碱度即pH值，破坏了土壤结构，使土壤微生物的生命活动减弱，不利于微生物生存^[24]。而氮肥用量不同对土壤微生物的影响不同，合理的氮肥用量不仅不会影响微生物量碳和细菌多样性，而且还会增强微生物的功能，氮肥用量过高会减少微生物量碳^[25]。在等氮量下，土壤微生物量碳和氮以有机无机肥配施显著高于氮磷钾配合施用，并且明显增加玉米整个生育期的微生物总生物量^[26]。而另有研究指出用有机肥料取代部分无机肥料对土壤微生物群落结构和功能产生短期效应，相对于无机肥，综合的施肥制度能刺激微生物生长，改变土壤微生物群落结构以及增加酶活性^[27]。

本研究的试验结果显示，缓释复合肥处理较化肥和普通复合肥提高了土壤微生物量碳、氮以及土壤微生物PLFA种类和含量，对土壤中细菌、放线菌等各类群有明显的增加作用。因为一般在不施有机肥的条件下，长期不施肥或养分不平衡供应会使土壤微生物多样性下降等^[28]，而本试验中的缓释复合肥携带的有机肥带入了大量可被微生物分解利用的碳源和氮源，为微生物的繁殖提供了物质基础，对微生物数量的增加作用明显；此外，缓释复合肥中的有机肥成分本身也带有大量活的微生物，在某种程度上起到了“接种”作用，增加了土壤中微生物的活动^{[29, 30]}。

土壤微生物群落相对丰度可以反映土壤微生物生存的生态环境。试验中检测到土壤中的细菌含量远远高于真菌含量，但其两者的比值能反映土壤生态系统的稳定性，比值越低土壤生态系统越稳定^[20]；而且外界胁迫越大，微生物就越能合成更多的单不饱和脂肪酸，使得一般饱和脂肪酸/单烯不饱和脂肪酸的比值越低^[21]。本研究中缓释复合肥较化肥和普通复合肥显著降低细菌/真菌PLFA值，且显著增加一般饱和脂肪酸/单烯不饱和脂肪酸的PLFA值。由此认为，缓释复合肥可能因缓慢释放养分对土壤微生物生存环境的扰动小，进而提高了土壤生态系统的稳定性。这是因为缓释复合肥在土壤中前期养分释放量较少，而化学肥料养分在前期释放较多、较快。缓释复合肥料氮素养分缓慢释放、转化和氮素多形态组合的协调效应，避免了普通化学肥料氮素施入土壤后短期内NH⁺₄-N含量大量增加而导致氨中毒和作物不能及时吸收利用的氮素养分进入生态环境所产生的副作用^[31]。

主成分分析是一种数学降维的方法，可以将多个变量通过变换以选出较少个数重要变量;而聚类分析能够按照各变量取值上的总体差异程度在没有事先指定的分类标准的情况下进行自动分类，两者均可以分析解释不同处理对土壤微生物群落结构的影响是否存在差异。从土壤微生物主成分和聚类分析可知，施肥处理土壤微生物较多，这是因为其提供了土壤微生物生存的营养物质。且不同施肥处理对土壤微生物群落结构的影响差距大，这主要是因为施肥改变了土壤的pH值导致了微生物群落结构的变化^[18]；另一方面，由于缓释复合肥施肥水平差距较大，致使缓释复合肥3个处理对土壤微生物群落结构的影响不同，尤其是施肥水平达到3倍量时不利于土壤微生物的生存。

施用缓释复合肥、化肥和普通复合肥可提高土壤微生物量碳和氮，其中以缓释复合肥处理最高，适量施肥水平的3种肥料以缓释复合肥较化肥和普通复合肥提高土壤微生物量碳8.2%和1.1%，以及显著提高土壤微生物量氮8.3%和28.2%。缓释复合肥较化肥和普通复合肥增加土壤微生物PLFA种类，且显著增加总PLFA含量17.6%—38.7%和12.8%—33.0%。土壤细菌、放线菌和真菌等各类群的PLFA均以缓释复合肥处理较高，其中以缓释复合肥高量处理表现最好。缓释复合肥缓慢释放养分的特性较化肥对土壤微生物生态系统的胁迫较小，为土壤微生物提供了更适宜生存的微环境。主成分分析和聚类分析显示施肥处理分布较多的PLFA，且缓释复合肥不同用量对土壤微生物群落结构的影响不同。缓释复合肥适量和高量施肥水平较化肥和普通复合肥改善土壤微生物群落结构，当缓释复合肥施肥水平达到3倍量时对土壤微生物有毒害作用。