东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)是近年来中国东海大规模赤潮的主要种类。据统计，2002—2008年间福建沿岸海域共发生东海原甲藻赤潮25起，其中2004年5月初发生的赤潮面积达 10000 km^{2[1, 2]}。东海原甲藻赤潮不仅造成巨大的经济损失，同时也带来严重的生态、资源和环境问题^{[1, 3]}。研究显示，东海原甲藻对低光照、较低温度(10—20 ℃)、变化盐度的适应能力及其独特的营养竞争策略可能是其形成赤潮的重要原因^{[3, 4, 5, 6, 7]}。

随着全球有机氮肥使用的不断增加，大量尿素进入近岸水体，成为溶解有机氮(DON)库的重要组成成分。有报道指出，切萨皮克湾海域夏季的尿素N浓度高达25—50 μmol/L，占DON的比例最高可达90%^[8]。我国大亚湾的尿素N浓度平均为28.2 μmol/L^[3]。有研究表明，许多甲藻利用尿素的能力胜过NO₃^-[9]。如美国加利福利亚的Newport海滩附近的多边舌甲藻(Lingulodinium polyedrum)赤潮期间，尿素的吸收率就高于NO₃^-和NH₄^+[10]。东海原甲藻以尿素为氮源条件下的最大比生长速率也高于NO₃^-[4]。此外，尿素对浮游植物群落吸收总氮的贡献率与甲藻所占比例高度相关，因此高水平浓度的尿素可能诱发甲藻赤潮暴发^{[11, 12, 13]}。

研究表明，浮游植物通过主动或被动运输途径吸收尿素后，必须由脲酶将其转化为CO₂和NH₄⁺才能供细胞利用^[14]。近几十年，已经发现许多浮游植物具有脲酶基因，但是关于微藻脲酶活性的研究仍然很有限。本文以东海原甲藻为实验对象，研究了温度、光照、盐度和营养盐对其种群生长及脲酶活性的影响，为深入了解尿素在赤潮藻生长及赤潮形成的作用提供一定的实验依据。

东海原甲藻(JX-1)采自我国东海赤潮高发海区，经毛细管分离培养成单细胞株系，保存于暨南大学水生生物研究中心藻种库。

试验藻种于室内光照培养箱(广东省医疗器械厂，LRH-400-G)中培养，除特殊说明外，温度(23±1)℃，辐照强度约100 μmol m^-2 s^-1，光暗比12 h∶12 h。选用 f/2培养基，基础介质为人工海水(盐度psu为30.5)^[15]。

预培养 将指数生长期的东海原甲藻细胞接种至无氮、磷的f/2培养基，另添加CO(NH₂)₂500 μgN/L，NaH₂PO₄ 100 μgP/L，培养3轮以上。

实验方法 将东海原甲藻转接至含600 mL培养基(同上)的三角瓶中，分别设置不同的光照(2、30、100 μmol m^-2 s^-1)、温度(15、20、25 ℃)或盐度psu(20、25、30、35、40)条件，置于室内光照培养箱中培养，每组3个平行。每隔24 h取5 mL藻液观察并测定其吸光值OD₆₈₀。每隔48 h取10 mL藻液观察、计数，并测定脲酶活性^[16]。取指数增长期后期(第6天)的藻液收集部分藻粉，测定其细胞碳氮比(CHNS/O 2400,Perkin Elmor)。脲酶活性测定方法：尿酶活性方法测定参照徐宁等^[16]，并以单个细胞单位时间内所产生氨的量来表示脲酶活性。

预培养 设置如下6种氮源组成：NaNO₃(a组)，CO(NH₂)₂(b组)，NH₄Cl(c组)，NaNO₃和CO(NH₂)₂各占1/2(d组)，NH₄Cl和CO(NH₂)₂各占1/2(e组)，NaNO₃、NH₄Cl、CO(NH₂)₂各占1/3(f组)。设置氮浓度为500 μgN/L，磷浓度为100 μgP/L。将处于指数生长期的东海原甲藻分别接种至上述培养基中进行3轮预培养。

实验方法 经预培养的东海原甲藻等量接种于装有600 mL f/2培养基(氮磷如上添加)的三角瓶中，每组3个平行。将三角瓶置于室内光照培养箱中培养。每隔24 h取5 mL藻液观察并测定其吸光值OD₆₈₀。每隔24 h取10 mL(3份)的藻液观察、计数，并测定脲酶活性。

预培养 调整f/2培养基氮源为NaNO₃(A组)或NH₄Cl(B组)，氮浓度为500 μg N/L，同时调整磷浓度为100 μg P/L，将处于指数生长期的东海原甲藻分别接种至上述培养基中预培养三轮。

实验方法 将经过预培养的东海原甲藻离心清洗后，等量接种于装有1500 mL培养基(培养基成分同预培养)的三角瓶中，每组3个重复。将三角瓶置于室内光照培养箱中培养，至培养基中无氮时，加入500 μg N/L的 CO(NH₂)₂和100 μg P/L的 NaH₂PO₄，继续以相同条件培养。每隔24 h取5 mL藻液观察并测定其吸光值OD₆₈₀。每隔24 h取10 mL(3份)的藻液观察、计数，并分别测定脲酶活性。

使用 SPSS 17.0 软件进行数据统计分析，Origin 7.5绘图。

实验结果显示，东海原甲藻在20—40盐度范围和15—25 ℃水温范围内均能够快速生长(图 1)。盐度为25和30条件下的细胞密度显著高于其它3组(P<0.05)。20 ℃和25 ℃实验组的最大细胞密度和最大比生长速率都显著大于15 ℃实验组(P<0.05)。在2 μmol m^-2 s^-1光照强度下，东海原甲藻细胞密度基本不变，在30 μmol m^-2 s^-1和100 μmol m^-2 s^-1光照条件下，东海原甲藻的生长显著高于2 μmol m^-2 s^-1(P<0.05)(图 1)。

图1 盐度、温度和光照强度对东海原甲藻生长的影响 Fig.1 Effects of salinity,temperature and light intensity on the growth of Prorocentrum donghaiense

图选项

所有实验组均能检测到脲酶活性，且变化趋势相似：接种后第3天活性最高，然后随着处理时间的延长而下降(图 2)。从图 2可以看出，水温对东海原甲藻脲酶活性影响最大。25 ℃组具有最高脲酶活性(12.81 fmol h^-1 个^-1，)，其次是20 ℃组(11.02 fmol h^-1 个^-1)，而15 ℃组最高脲酶活性仅为7.055 fmol h^-1 个^-1，约为25 ℃实验组的50%，显著低于其他两组(P<0.05)。光照是除温度外影响东海原甲藻脲酶活性的重要因素。光照在大于30 μmol m^-2 s^-1时对脲酶活性无显著影响(P>0.05)。但当光照强度为2 μmol m^-2 s^-1，其脲酶活性9.405 fmol h^-1 个^-1，显著低于其它两组(P<0.05)(图 2)。盐度对藻细胞脲酶活性的影响较小。盐度为25—35实验组最大脲酶活性均高于11 fmol h^-1 个^-1，显著高于盐度20和40的实验组(P<0.05)(图 2)。东海原甲藻细胞碳氮比(C/N)实验结果显示： 15 ℃实验组C/N比值为11.06，远小于20和25 ℃实验组(P<0.05)。而 2 μmol m^-2 s^-1光照组C/N值为8.15，显著小于30 μmol m^-2s^-1和100 μmol m^-2s^-1光照组其他两组(P<0.05)(表 1)。不同盐度实验组C/N比值差异不显著。

图2 盐度、温度和光照强度对东海原甲藻脲酶活性的影响 Fig.2 Effects of salinity,temperature and light intensity on urease activity of P. donghaiens

图选项

实验结果表明，东海原甲藻能以尿素、NO₃^-和NH₄⁺为唯一氮源正常生长。第2天进入指数生长期，第5—6天进入稳定期。铵氮组(500 μg NH₄Cl -N/L)最高细胞密度显著高于其它实验组(P <0.05)(图 3)。

图3 氮源组成对东海原甲藻生长的影响 Fig.3 Effects of nitrogen sources on the growth of P. donghaiense a：500 μg NaNO3-N/L; b：500 μg CO(NH2)2-N/L; c：500 μg NH4Cl-N/L; d：250 μg NaNO3-N/L，250 μg CO(NH2)2-N/L; e：250 μgNH4Cl-N/L，250 μg CO(NH2)2-N/L; f：167 μg NaNO3-N/L，167 μg NH4Cl-N/L，167 μgCO(NH2)2-N/L

图选项

如图 4所示，各实验组均可检测出脲酶活性。b组(尿素)第1天的脲酶活性显著高于其它组(P <0.05)，第3天(指数生长初期)的脲酶活性达到最大值，为11.27 fmol h^-1 个^-1，而后下降并趋于平稳，与接种时相近。含1/2—1/3 尿素氮的d、e、f组第3天(指数生长初期)脲酶活性略下降而后升高，到第7天(指数生长末期)达最大值，分别为9.48、8.82、8.25 fmol h^-1 个^-1，且d组(1/2尿素氮)显著大于f组(1/3尿素氮)(P <0.05)。培养基中不含尿素的a、c组脲酶活性在实验期间保持不变，且显著小于其他4组(P <0.05)，但a组(硝氮组)的脲酶活性略大于c组(铵氮组)。实验结果表明，氮源组成是影响东海原甲藻细胞脲酶活性的重要因素。最大脲酶活性与尿素浓度呈显著正相关(R=0.977)。

图4 氮源组成对东海原甲藻脲酶活性的影响 Fig.4 Effects of nitrogen sources on urease activity of P. donghaiense a：500 μg NaNO3-N/L; b：500 μg CO(NH2)2-N/L; c：500 μg NH4Cl-N/L; d：250 μg NaNO3-N/L，250 μg CO(NH2)2-N/L; e：250 μgNH4Cl-N/L，250 μg CO(NH2)2-N/L; f：167 μg NaNO3-N/L，167 μg NH4Cl-N/L，167 μgCO(NH2)2-N/L

图选项

实验结果显示，东海原甲藻在以硝氮(A组)和铵氮(B组)为唯一氮源时均能快速生长，且铵氮组细胞密度显著高于硝氮组(P <0.05)。在培养基中补充尿素后，硝氮组比铵氮组(停滞1d)早1d重新进入指数生长期，且前期细胞密度显著高于铵氮组(P <0.05)，但后期两组细胞密度相近(P >0.05)(图 5)。

图5 氮源转换对东海原甲藻生长的影响 Fig.5 Effects of nitrogen source conversion on the growth of P. donghaiense A：500 μg NaNO3-N/L；B：500 μg NH4Cl -N/L

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A、B两组均可检测出东海原甲藻脲酶活性。在加入尿素前(第8天前)，A、B两组脲酶活性都趋于稳定，但A组显著高于B组(P <0.05)。加入尿素后(第8天后)，两组脲酶活性均迅速升高。A、B组分别在第10和11天达到最大值，分别为10.47、9.82 fmol h^-1 个^-1，且A组显著高于B组(P <0.05)，其后均开始下降(图 6)。

图6 氮源转换对东海原甲藻脲酶活性的影响 Fig.6 Effects of nitrogen source conversion on urease activity of P. donghaiense A：500 μg NaNO3-N/L；B：500 μg NH4Cl-N/L

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实验室研究结果表明，在20—27 ℃温度范围内东海原甲藻的生长速率大于0.60 d^-1[4]。野外调查发现，东海原甲藻赤潮期间水温为18.5—21.3 ℃^{[17, 18]}，类似地,本研究结果显示，20—25 ℃水温条件下东海原甲藻细胞密度较高，15 ℃时细胞密度有所下降，与野外调查结果一致(图 1B)。本研究采用以尿素为唯一氮源的低氮培养条件，在培养至第八天后东海原甲藻的生长出现衰退现象(图 1)。王宗灵等的研究也发现，在N限制条件下，东海原甲藻的生长在第5天就出现衰退现象^[19]。由此可见东海原甲藻的生长受到环境条件尤其是营养状况的调控。

本研究结果显示，25 ℃实验组的最大脲酶活性显著高于20 ℃和15 ℃组(图 2B)。前期研究发现，东海原甲藻的脲酶活性在15—70 ℃之间随着温度的升高而增强，当温度达到80 ℃以后，脲酶活性急剧降低^[16]。可能的原因是脲酶是一个热稳定性的酶^[20]。野外调查也表明，脲酶活性最高出现在夏季，比春秋季高出5倍^{[21, 22]}。并且，在河口尿素的最高吸收率也出现在夏季，最低吸收率出现在冬季^[22]。这些报道与本实验结果一致。东海原甲藻脲酶活性与温度的正相关关系可能是在长期进化中形成的适应特征。水温较低时，浮游植物生长缓慢，水体营养盐含量较高，东海原甲藻对尿素的吸收不是必要的。而水温较高时，浮游植物生长迅速，对营养盐的竞争加剧，无机氮源已经无法满足其生长的需要。此时，对尿素的吸收能够有效补充氮源，成为东海原甲藻重要的竞争策略。然而，有研究指出，在硅藻为优势种的水体中尿素的吸收率与温度呈负相关^[23]。另外，在Chesapeake湾和Neuse 河口的现场研究发现，10—25 ℃范围内微小原甲藻(Prorocentrum minimum)对尿素的吸收率保持不变^[24]。因此，海洋微藻脲酶活性对温度的响应关系可能是因种而异的。

实验室研究发现，东海原甲藻在30 μmol m^-2 s^-1的光照强度下，种群生长接近饱和^[4]，即光照需求显著低于其他赤潮藻，因此在高混浊海水中具有形成赤潮的优势^[25]。本研究也证实，在30 μmol m^-2 s^-1和100 μmol m^-2 s^-1的光照强度下东海原甲藻生长并无显著差异，但在2 μmol m^-2 s^-1的低光照条件下无法生长(图 1)。可能的原因是，东海原甲藻对尿素的吸收需要消耗能量通过尿素转移酶完成，而低光强不足以支持藻细胞对尿素的吸收^{[8, 26, 27]}。另一方面，低光照强度下东海原甲藻光合作用速率降低，脲酶将尿素转化为氨，使氨在藻体内被大量积累，进而抑制藻脲酶活性^[8]。有趣的是，即使在低光照(2 μmol m^-2 s^-1)条件下，东海原甲藻细胞脲酶活性仍维持在较高水平(9.405 fmol h^-1 个^-1)表明藻细胞在不利于生长的条件下能够持续吸收、积累尿素(图 2)。此时藻细胞的碳氮质量比为8.15，显著高于其它处理组(表 1)，表明低光照对光合作用的影响大于对氮吸收的影响。东海原甲藻在低光照条件下对尿素的吸收能力对于维持种群的生存具有重要生态意义。

东海原甲藻盐度适应范围较广，为20—40，适宜生长的盐度介于25—35之间^[16]。藻细胞在高盐度下生长需要更多能量，脂肪含量也相应增加，而当盐度适当降至其原环境的盐度2/3时，对其生长有明显的促进作用^[28]。本研究表明，盐度对东海原甲藻脲酶活性影响不大(图 2)。盐度为25—35条件下东海原甲藻脲酶活性较高，盐度20和40的实验组脲酶活性有所降低(图 2)。沿海水体的盐度范围一般介于25—35之间，有利于东海原甲藻对尿素的吸收和利用。

在本研究设置的6种不同单一或混合氮源条件下，东海原甲藻的生长速率和细胞密度均差异不大(图 3)，表明东海原甲藻对于不同氮源具有灵活的吸收、利用机制。类似地研究发现，微小原甲藻具有多种氮源利用机制，其中对NH₄⁺的吸收速率最大，对NO₃^-、尿素和混合氨基酸的吸收速率无明显差异^[24]。另外，利马原甲藻(Prorocentrum. lima)分别以NO₃^-、NH₄⁺、尿素为唯一氮源时，其最大比生长速率无显著性差异^[29]。

本研究发现，在不同氮源条件下东海原甲藻的脲酶活性显示出不同的变化趋势(图 4)。首先，东海原甲藻脲酶活性取决于环境中是否存在尿素，且活性高低与尿素浓度呈正相关关系。如在氮源实验中，尿素组具有最高的脲酶活性，NO₃^-、NH₄⁺组的脲酶活性始终维持在最低水平，而混合氮源组介于二者之间(图 4)。其次，相对于尿素水体中无机氮源NH₄⁺ NO₃^-的存在对东海原甲藻脲酶活性具有显著的抑制作用(图 4)。在氮源实验中，混合氮源组脲酶活性在第7天才达到最高值。这可能是因为东海原甲藻优先利用无机氮，而当无机氮不足以满足其氮需求时，脲酶活性才会增加。而且，比之NO₃^-，NH₄⁺对脲酶的抑制作用更为明显。如实验结果显示，单独氮源NH₄⁺组脲酶活性始终显著低于NO₃^-组(图 4)。而在氮源转换实验中，即使实验后期添加了等量尿素，较之NO₃^-组，NH₄⁺组脲酶活性仍然显著偏低，且响应速度较慢(图 6)。另外，注意到在氮缺乏条件下东海原甲藻脲酶活性明显增强。在实验后期，所有实验组东海原甲藻脲酶活性均有所回升(图 6)。此时种群生长已进入衰亡期，水体氮浓度已显著降低并抑制了东海原甲藻的生长。

Solomon和Glibert的研究显示，在含有脲酶的浮游植物中，脲酶总有基础活性，而活性高低却受氮源的调控，如微小原甲藻和卡罗藻(Karlodinium veneficum)在NO₃^-和尿素中的脲酶活性要比在NH₄⁺中高^[30]。另有研究发现，在N饥饿时亚历山大藻脲酶活性会增加^[14]。野外调查显示，浮游植物脲酶活性高低与NO₃^-、NH₄⁺浓度呈负相关^[8]。这与本文对东海原甲藻的研究结果一致。因此，NO₃^-和NH₄⁺可能是脲酶活性的下行调节物^[8]。然而，不同来源的研究结果也显示出明显的差异性。如涡鞭藻(Heterocapsa triquetra)在NH₄⁺中的脲酶活性要比在NO₃^-和尿素中高^[30]。类似地，较早的研究也指出，氮缺乏或尿素培养的丰迪亚历山大藻(Alexandrium fundyense)脲酶活性最高，NH₄⁺次之，而NO₃^-中没检测到脲酶活性^[14]。另外有报道指出，一株威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)脲酶活性不受氮源调节^[31]，而同种的其它藻株中NO₃^-可下行调节^[32]。因此，氮源对浮游植物脲酶活性的调节作用可能具有种间特异性，有待进一步研究。

最近二、三十年以来，全球尿素的使用量迅速增加，大量尿素进入近岸水体，成为溶解有机氮库的重要组成成分。越来越多的证据显示，这些来源于人类活动的有机氮可能改变浮游植物群落结构，甚至诱发甲藻赤潮的发生^{[4, 33]}。本研究证实，在无机氮源缺乏的环境条件下，东海原甲藻脲酶活性显著增强，而且与水体尿素浓度呈正相关关系。有理由相信，东海原甲藻对尿素的利用是一种重要的营养竞争策略，使其在无机氮源不足时得以转而利用有机氮源，从而有效拓展营养生态位，在资源竞争中占据有利地位。