全球工业化引起的重金属污染，已成为人们关注的环境与社会突出问题^{[1, 2]}；水体中的重金属污染问题也随着冶炼、电镀、采矿等各种工业废水和固体废物渗滤液的直接排入而日益突出^[3]。重金属污染物因不能自然降解或被微生物分解，易沉积到水域底部或在水中被水生生物吸收，一方面通过食物链积累而损害动物和人类健康^[4]，另一方面可影响植物的生长和植物体内活性氧代谢系统的平衡，导致一系列有害的生理生化变化^[5]。镉、铜均为水体重金属污染物中最典型的污染元素^[6]，会对水生植物细胞造成极大破坏^[7]，极低浓度即可使细胞核仁解体、线粒体和叶绿体空泡化、高尔基体和内质网解体等，甚至导致植物无法正常生长^[8]。沉水植物作为水生生态系统中最主要的初级生产者之一，不仅可以去除N、P等营养物质和有机污染负荷，对重金属也具有一定的吸附和积累能力^[9]，对Cd和Cu等均具较强的富集作用，可用来去除水中的Cd、Cu^[10]，沉水植物的这种对重金属的吸附、转移或者将其固定在体内的富集特性可被运用于重金属污染水域的治理^[11]，沉水植物在湖泊污染治理中的应用已日趋广泛^{[12, 13, 14]}。近年来，国内外学者对于重金属污染下沉水植物的生态毒理效应进行过研究，主要集中在植物对重金属的富集作用^{[15, 16, 17, 18]}、生理生化的伤害反应^[19]、细胞内部亚显微结构变化^[20]等方面，但对于重金属胁迫下黑藻等沉水植物的光合荧光和荧光成像等影响变化的研究尚较缺乏。研究镉、铜对黑藻生理特性和光合荧光特性，可直接获得镉、铜污染胁迫下黑藻活体光合作用的变化，进而探究其耐受程度和胁迫机理，为水体重金属污染的治理、恢复和重建水生植物群落提供实践指导，对于研究沉水植物作为重金属等各种污染物的指示生物等具有重要意义。

叶绿素荧光测定技术是一种简便、快捷、可靠、无损伤的光合作用研究方法。自Kautsky和Hirsch^[21]首次发现光合作用与叶绿素荧光间的联系后^[22]，叶绿素荧光在植物的光合作用、胁迫生理学、水生生物学、海洋学和遥感等方面已得到广泛的应用^{[23, 24]}。脉冲幅度调制方式(PAM,Pulse Amplitude Modulation)下测量Kautsky效应，可以非常详细地调查植物光合作用从暗适应状态到光适应状态，然后又到暗适应状态的转变。叶绿素荧光成像技术是1987年由Omasa等人开发^[25]，PAM技术于1996年由光子系统仪器首次介绍到叶绿素荧光成像^[26]，当实验对象受到胁迫后(如受重金属侵害)，其荧光发射具有明显异质性，事实证明采用叶绿素荧光成像技术已是必不可少^[27]。目前，叶绿素荧光成像技术不仅用于光合作用的研究，还用于病毒和其他病原体局部监测(在可见症状出现之前)以及重金属胁迫等方面^[28]。叶绿素荧光成像可呈现出植物受到胁迫的荧光状态，能更全面地了解植物的光合作用状态，为诠释其生长和耐受机制提供新的、直观可见的手段。

黑藻(Hydrilla verticillata)是多年生大型淡水沉水植物，具有生长范围广、耐污能力和适应性强等特点，在国内外富营养化水体治理和生态修复中已得到广泛应用，并对重金属具有较强的吸收积累能力^[29]，可作为重金属污染环境修复植物和水体污染的指示植物^{[30, 31]}。黑藻对Cd、Cu两种重金属污染物均具有比较敏感的反应^[32]，超过一定浓度的Cd、Cu会抑制和伤害黑藻的生长。本文将通过不同浓度镉、铜胁迫对黑藻株高、生物量、成活率和叶绿素含量的影响，以及对黑藻叶片光合荧光参数及其荧光成像的影响，结合前人的研究探讨黑藻受胁迫后的生长和光合生理状态，以及黑藻耐受和调节光能利用效率的内在机制，为修复和指示重金属污染的生态环境、重建水生植物群落及修复湖泊生态系统提供科学依据。

根据徐勤松等学者的研究结果，黑藻对Cd、Cu等两种重金属污染物具有比较敏感的反应，且Cd、Cu是重金属污染水体中极常见的两种元素，Cd、Cu对黑藻的毒害较大，致死浓度分别为0.5—1 mg/L和1—2 mg/L^[7]。分别选取Cd、Cu等两种重金属元素作为水体重金属胁迫污染物，选择沉水植物黑藻(H. verticillata)作为供试植物材料，材料采自江西师范大学校园内湖水域。选取长势相似的黑藻植株，截取生长状况相似的10cm顶尖作为实验材料^[32]。

2013年11月初将采回的黑藻放入盛有未经曝气的自来水盆中(为防止绿藻滋生而严重影响黑藻生长，自来水不能曝气)，在室内驯养3—4 d后，采用培养盆(49 cm×36.5 cm×19 cm)，在盆底铺上洗净的河砂约3.5 cm厚，加入等体积1/40 Hoagland植物培养液，每个培养盆内加培养液30 L，盆内水深15 cm，河沙约3.5 cm，将截取的顶尖10 cm的黑藻扦插于培养盆中，每个盆中扦插35株，2 d后分别于11月12日和28日8:00在培养盆中分别加入不同浓度的CdCl₂溶液和CuSO₄溶液进行处理，分别设置Cd²⁺和Cu²⁺的浓度梯度依次为0.5、1、3 mg/L和5 mg/L 等4个，另外设置0 mg/L Cd²⁺或Cu²⁺的对照培养组，相当于每种重金属浓度梯度共有5个，每个浓度下分别设置3个重复组。培养盆均放置室内，采用空调控温18—21 ℃，并采用LED灯补光，实际功率红光 ∶ 蓝光=3 ∶ 1(光照强度约为5000 lx)，光周期为14 h ∶ 10 h，水温为17 ℃左右，第7天8:00 分别取植株进行分析。

采用TES-1339专业照度计测定水面光照强度。自8:00到22:00每隔2h分别采用温度计和水温计测定1次空气温度和水温。

每组样品加入不同浓度重金属溶液培养7 d后，记录每个培养盆中活体黑藻的株数，计算成活率；用直尺(精确到0.1 cm)测量15个培养盆中活体黑藻的株高；每个培养盆中取出10株黑藻，晾干表面水分，将用来垫着植物的两层滤纸完全浸湿后，称量其鲜重，于空气中自然风干15 d后称量其干重。

随机选取培养盆中黑藻测量，获得3个以上的平行数据。用100%二甲基亚砜(DMSO)分光光度法^{[33, 34]}测定黑藻叶片的叶绿素含量，用DMSO在研钵中研磨植物叶片萃取，根据所得溶液在645 nm和663 nm的吸光值，运用Arnon公式^[35]计算叶片的叶绿素总量(C_t)、叶绿素a (C_a)、叶绿素b (C_b)和C_a/C_b值。

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每个培养盆中随机选取黑藻测量，获得3个以上的平行数据。运用FluorCam叶绿素荧光成像仪测定黑藻的荧光参数和活体荧光成像。取黑藻装入广口瓶中，包裹锡箔纸暗处理20 min，设定快门Shutter=0，敏感度Sensitivity=20，光照Act2=100，Act1=100，Super=70，测定荧光参数，包括暗适应状态下的最小荧光(Fo)、暗适应状态的最大荧光(Fm)、潜在光合活性(Fv/Fo,Potential photosynthetic activity)、最大PSⅡ量子产率(QY_max)、稳态下PSⅡ反应中心关闭程度(1-Qp_Lss)、稳态下的非光化学淬灭(NPQ_Lss)等指标及对应的植物荧光成像。

实验结果均为3次以上平行数据的平均值和标准差，实验数据采用统计软件SPSS进行单因素方差分析(One-way,ANOVA)和最小显著差异法(LSD)，Pearson相关关系分析,采用多重方差法分析显著性，对黑藻在不同镉、铜浓度下反应数据进行差异性比较；采用Origin 8.0进行作图。

根据Cd²⁺或Cu²⁺污染胁迫中所设置的5个不同浓度梯度，测定黑藻生长中的株高、鲜重、干重以及成活率等数据，分别统计其变化特征及其相关显著性，结果如图 1所示。

图1 不同浓度重金属胁迫下黑藻成活率、生物量和株高的变化及其相关显著性 Fig.1 Varieties and correlations of survival rate,biomass and plant heights of Hydrilla verticillata under the stress of different heavy metal concentrations 图中不同小写字母表示不同处理之间达到Sig<0. 05水平的显著差异，不同大写字母表示不同处理之间达到Sig<0. 01水平的极显著差异

图选项

图 1显示，采用CdCl₂ 和CuSO₄溶液处理过的各培养组，Cd²⁺胁迫对株高的影响表现出显著下降趋势，浓度为3 mg/L 的Cd²⁺处理后的黑藻株高平均值最低，比对照组的降低6.72%，Cu²⁺胁迫对黑藻的株高无显著影响。Cd²⁺和Cu²⁺胁迫对鲜重均无显著影响，这可能与水生植物的自由水含量有关^[36]。Cd²⁺和Cu²⁺胁迫对干重的影响均表现出显著下降趋势，其中Cu²⁺胁迫的影响更突出；浓度为5 mg/L 的Cu²⁺或Cd²⁺处理后的黑藻干重分别达到最低值，分别比对照组的干重降低41.31%和14.9%。0.5 mg/L Cd²⁺和Cu²⁺胁迫对成活率的影响均未表现出显著差异，说明低浓度的Cd²⁺或Cu²⁺胁迫对黑藻的成活率影响不明显，1 mg/L Cd²⁺胁迫下黑藻的成活率首先表现出显著下降，不同Cd²⁺浓度梯度处理后黑藻的成活率分别比对照组的降低了2.02%、5.72%、16.16%和3.70%，而3 mg/L和5 mg/L Cu²⁺胁迫下黑藻的成活率急剧下降，不同Cu²⁺浓度梯度处理后黑藻的成活率分别比对照组的降低了0.97%、3.88%、67.96%和26.21%(图 1)。

根据Cd²⁺或Cu²⁺ 5个不同浓度梯度胁迫下黑藻的各种叶绿素含量测定数据，分别统计叶绿素总量(C_t)、叶绿素a(C_a)量、叶绿素b(C_b)量、叶绿素a/b(C_a/ C_b)及其显著相关性，结果如图 2所示。

图2 不同浓度重金属胁迫下黑藻叶绿素总量 (Tc) ，叶绿素a (Ca) ，叶绿素b (Cb) 和Ca/Cb及其相关性 Fig.2 Varieties and correlations of total chlorophyll (Tc) ,chlorophyll a (Ca) ,chlorophyll b (Cb) and Ca/Cb of Hydrilla verticillata under the stress of different heavy metal concentrations 图中不同小写字母表示不同处理之间达到Sig<0. 05水平的显著差异，不同大写字母表示不同处理之间达到Sig<0. 01水平的极显著差异

图选项

图 2显示，不同浓度Cu²⁺处理下的黑藻叶绿素各值均显著下降，且同浓度的Cu²⁺处理比Cd²⁺处理后黑藻的叶绿素各值下降更明显。Cu²⁺溶液处理过的培养组中，0.5 mg/L Cu²⁺处理下的叶绿素总量、叶绿素a、b等值均达到最低值，与对照组相比分别下降了48.7%、52.2%、39.4%；3 mg/L Cu²⁺处理后的黑藻C_a/C_b达到最低值，与对照组相比下降了45.2%。而不同浓度Cd²⁺处理过的培养组中，Cd²⁺浓度为5 mg/L处理下的黑藻叶绿素总量、叶绿素a、b、C_a/C_b等各值指标达最低值，与对照组相比分别下降24.1%、29.9%、5.5%、26.5%。0.5—3 mg/L浓度Cd²⁺胁迫下的黑藻叶绿素b呈现逐渐上升趋势，但Cd²⁺浓度为5 mg/L胁迫下黑藻的叶绿素b呈现下降(图 2)。

分别测定上述5个不同浓度梯度Cd²⁺或Cu²⁺胁迫处理一周后黑藻的各种荧光参数：暗适应状态的最小荧光Fo和最大荧光Fm、潜在光合活性F_V /Fo、最大PSⅡ量子产率QY_max、稳态下PSⅡ反应中心关闭程度(1-Qp_Lss)、稳态下的非光化学淬灭NPQ_Lss等指标，分析不同浓度重金属胁迫对黑藻叶绿素荧光各参数的影响，结果如图 3或表 1所示。

图3 不同浓度重金属胁迫对黑藻叶绿素荧光参数的影响 Fig.3 Influences on chlorophyll fluorescence parameters of Hydrilla verticillata under the stress of different heavy metal concentrations 不同小写字母表示不同处理之间达到Sig<0.05水平的显著差异，不同大写字母表示不同处理之间达到Sig<0.01水平的极显著差异

图选项

图 3结果显示，Cd²⁺或Cu²⁺胁迫处理后，黑藻的Fo、Fm、QY_max和Fv/Fo均呈下降趋势。Cd²⁺胁迫对黑藻叶片的Fo有显著影响，而Cu²⁺胁迫则无显著影响。在浓度为0.5 mg/L，Cd²⁺或Cu²⁺胁迫处理后黑藻的Fm分别显著下降43.0%和17.9%，Cd²⁺胁迫后黑藻的Fm下降更突出(图 3)。Cd²⁺或Cu²⁺胁迫下黑藻叶片的Fv/Fo均呈显著下降，受Cd²⁺胁迫后的效果相对非常突出，5 mg/L Cd²⁺胁迫下黑藻叶片的Fv/Fo最低，比对照组下降了90.4%，而5 mg/L Cu²⁺胁迫下黑藻叶片的Fv/Fo也最低，但比其对照组只下降24.5%。同样，Cd²⁺或Cu²⁺处理后黑藻叶片的QY_max均呈显著下降，5 mg/L Cd²⁺胁迫下黑藻叶片的QY_max最低，下降25.2%，而5 mg/L Cu²⁺胁迫下黑藻叶片的QY_max也最低，下降8.5%(图 3)。黑藻叶片QY_max和Fv/Fo值的下降表明，重金属离子使PSⅡ反应中心受损，抑制光合作用的原初反应，阻碍光合电子的传递过程。图 3中Cd、Cu对黑藻叶片荧光参数的影响均是先显著降低，之后随着重金属浓度的增加有少量回升，最后呈现较平稳趋势。反映出重金属对黑藻的胁迫较明显，且随着重金属浓度的上升而上升，而黑藻体内光合机制的改变，使得黑藻能在重金属环境下仍然保持光合活性。

表 1显示，与空白对照组相比，Cd²⁺或Cu²⁺胁迫后的黑藻叶片稳态下PSⅡ反应中心关闭程度(1-Qp_Lss)、非光化学淬灭系数(NPQ_Lss)上升，表明Cd²⁺或Cu²⁺胁迫改变了黑藻叶片的光能利用分配。

Cd²⁺或Cu²⁺不同浓度梯度胁迫处理后的黑藻叶片PSⅡ最大量子产率时的荧光成像分别如图 4。结果显示，Cd²⁺胁迫下的黑藻叶片荧光成像强度由高变低，浓度在3 mg/L及以上的Cd²⁺胁迫处理后，黑藻叶片大部分失去光合作用活性，只有茎秆(黑藻叶片中间为少量茎秆横截面)附近的少量区域有光合活性(图 4)。而浓度为0.5 mg/L和1 mg/L的Cu²⁺胁迫对黑藻叶片光合活性的影响并不显著，但随着Cu浓度的再升高呈显著下降趋势(图 4)。另一方面，Cd²⁺或Cu²⁺对照组中的黑藻能运用整个叶面进行光合作用，而受Cd²⁺、Cu²⁺胁迫后的黑藻叶片光合活性降低，且较高的光合活性位于茎秆处和叶脉处，Cd²⁺、Cu²⁺胁迫对黑藻叶片光合活性的伤害从叶片边缘开始达到最严重，而茎秆和叶脉处最轻，这可能与茎和叶脉的维管束结构有一定关联性。

图4 不同浓度重金属胁迫对黑藻叶绿素荧光 (QY_max) 成像的影响 Fig.4 Varieties of chlorophyll fluorescence (QY_max) imagings under the stress of different heavy metal concentrations

图选项

叶绿素是与植物光合作用最密切相关的一种色素，Cd²⁺、Cu²⁺胁迫分区均造成黑藻叶绿素含量下降，黑藻在Cu²⁺胁迫下的叶绿素含量比Cd²⁺胁迫下的减少更多，说明Cu²⁺胁迫比Cd²⁺胁迫对叶绿体的毒害作用更大，可能原因是Cu²⁺胁迫对内膜、类囊体片层和光合色素等的损害更严重^[32]。当用0.5—3 mg/L Cd²⁺ 浓度胁迫处理黑藻时，叶绿素总量下降并不十分明显，当Cd²⁺浓度达到5 mg/L时叶绿素总量下降最多，但是在0.5 mg/L Cd²⁺胁迫下的叶绿素a/b(C_a/C_b)会立刻显著下降，后随着Cd²⁺浓度的升高并未产生显著下降。黑藻的叶绿素b在Cd²⁺浓度为0.5—3 mg/L间的胁迫下有所上升，而Cd²⁺浓度为5 mg/L时出现下降，有研究认为叶绿素b含量的减少会影响到光系统的稳定性，最终导致整个光合机构的不稳定，具体表现在对逆境的耐受性降低^{[37, 38]}。反之推测，Cd²⁺胁迫下黑藻叶绿素b含量增加，可能是黑藻对Cd²⁺胁迫耐受能力的增强，Cu²⁺胁迫下黑藻叶绿素b也在0.5 mg/L下降到最低后上升，与黑藻对这两种金属的耐受机制有关。以上说明在Cd²⁺胁迫导致黑藻叶绿素含量减少的情况下，黑藻通过调整叶绿素C_a/C_b的比值以适应逆境^[39]，具体机制尚需进一步探究。

叶绿素a荧光动力学在植物生理领域得到广泛应用，QY_max反映了 PSⅡ反应中心光能转化效率，可作为植物对不良环境耐受性等方面的重要指标^[40]。Cd²⁺胁迫的黑藻Fm比Cu胁迫下降得明显更多，Fo下降的差别较小，因此，Cd²⁺胁迫下的QY_max值也比Cu²⁺胁迫下的降低得更多，说明黑藻光合活性能力对重金属的耐受能力：Cu²⁺耐受>Cd²⁺耐受。研究表明在对黑藻细胞的损害中，Cd²⁺对叶绿体的破坏较小^[8]，但Cd²⁺胁迫下黑藻的潜在光合活性(Fv/Fo表示PSⅡ的潜在活性)比受Cu²⁺胁迫后下降得更多，反映出Cd²⁺对黑藻内部光合作用结构的破坏比Cu²⁺更彻底，并且Cd²⁺、Cu²⁺胁迫对黑藻光合活性的伤害是不可逆的^{[8, 10]}。1-Qp_Lss是 PSⅡ反应中心关闭的程度，在一定程度上反映 QA的氧化还原状态，1-Qp_Lss越大，PSⅡ反应活性越小。与对照组相比，Cd、Cu胁迫后的黑藻叶片1-Qp_Lss 增加表明电子由PSⅡ的氧化侧向PSⅡ反应中心的传递受阻，改变了黑藻叶片的光光能利用分配，将原本用来获得量子产量的部分光能热耗散等用于增强自我保护，这有可能是造成非光化学淬灭系数(NPQ_Lss)上升和PSⅡ最大量子产率(QY_max)下降的原因，之后非光化学淬灭减小的原因可能在于PSⅡ的部分失活，黑藻的正常生理功能被严重破坏。

Govindjee和Nedbal用“百闻不如一见”来表达并强调叶绿素荧光成像如何获得科学实验的信念^[27]。QY_max表示植物PSⅡ最大量子产率，其叶绿素荧光成像最能反映重金属胁迫对光系统Ⅱ的损害，荧光成像表明Cd²⁺、Cu²⁺重金属胁迫使黑藻叶片PSⅡ反应中心受到严重损害，光合活性减弱。Cd²⁺、Cu²⁺对黑藻叶片的损害都是从边缘开始的，黑藻叶片是由单层细胞组成，Cd²⁺、Cu²⁺对黑藻的毒害是对植物细胞的膜结构和非膜结构、生理活动和生化反应的整体伤害^{[8, 10]}，但是叶脉、茎和叶片结构不同，因此推测维管束结构更难被Cd²⁺、Cu²⁺破坏。

从植物形态上可以判断植物的生长和受胁迫情况，Cd²⁺胁迫下黑藻株高比Cu²⁺胁迫下的下降率更高，说明Cd²⁺胁迫对黑藻株高的影响大于Cu²⁺胁迫对黑藻株高的影响；3 mg/L 的Cu²⁺胁迫对黑藻的成活率影响最大，随着浓度的升高，黑藻的成活率反而有所上升，Cd²⁺胁迫的下降率更低；Cu²⁺胁迫下黑藻干重比Cd²⁺胁迫下降率更高。在3 mg/L Cu²⁺胁迫下，黑藻成活率、C_a/C_b、QY_max最低；5 mg/L Cu²⁺胁迫下株高、鲜重、干重最低，表明5 mg/L Cu²⁺胁迫下黑藻长势差，有机物和无机物含量减少，叶绿素增加，C_a增加而C_b减少了。图 2中可以看出，Cu²⁺胁迫下叶绿素b只在0.5 mg/L时下降显著，其他浓度的胁迫和对照组都没有显著差异，说明Cu²⁺胁迫对黑藻叶绿素a的影响比叶绿素b大，可能的原因有：Cu²⁺促进叶绿素的生物合成^[41]，或者破坏叶绿素酶活性，使叶绿素降解减少^[42]，叶绿素a的主要功能是吸收和传递光能，加强黑藻的光合作用能力，因此最大量子产率(QY_max)也增加，光合作用的增强对黑藻的成活率有较大的影响。图 2中5 mg/L Cd²⁺胁迫下与3 mg/L Cd²⁺胁迫下相比可以看出，黑藻的叶绿素a和叶绿素b均呈显著下降，但是光合能力指标Ca/Cb并无显著差异，说明光合作用能力并未下降，图 3中的量子最大产率QY_max无显著差异也印证了这一点。光合作用无明显差异的情况下，有机物和无机物的累积也无明显变化，干重无显著差异。而5 mg/L Cd²⁺胁迫下与3 mg/L Cd²⁺胁迫下相比，表 1中NPQ_Lss的降低说明黑藻的光保护能力下降，图 4可以看出，黑藻叶片的成活面积变小，活体细胞大多集中于中间叶脉部分，光合作用得到的有机物用来维持活体细胞的生长，即很大一部分用于叶脉的生长，叶脉的生长使得株高增加，而由于叶脉比叶片更难被Cd²⁺破坏，因此成活率得以上升。

Cd²⁺是黑藻的非必须营养元素，研究表明，Cd²⁺使黑藻体内活性氧减少、影响细胞壁的形成、破坏细胞器和细胞、损伤类囊体^[8] ，Cd²⁺胁迫下黑藻光合活性显著下降，3 mg/L及以上浓度的Cd²⁺对黑藻的伤害极大，黑藻因此会失去大部分光合能力，无法长时间生存，表明黑藻可作为Cd污染水环境的指示种。Cu²⁺是黑藻生长必须的微量营养元素，所以一定浓度的Cu²⁺对黑藻的生长是有利的，但是超过一定范围就会造成黑藻细胞核消解、线粒体空泡化、类囊体片层排列混乱甚至溶解、叶绿体膨胀成球形然后解体、蛋白质和脂类失活等损害^[32]。本研究中，浓度为0.5和1 mg/L 的Cu²⁺胁迫对黑藻光合活性的抑制不显著，表明在低浓度的Cu²⁺环境中黑藻可以进行比较正常的生理活动，可推测将黑藻用于低浓度Cu²⁺污染水域的修复与水生生态系统的沉水植物重建。本研究得出的结论能否用于实践，尚需要更多研究来确定其可靠性和实用性。