氯苯类有机化合物(chlorobenzenes，CBs)是一类在合成染料、芳香剂、农药、制药、油漆等工农业生产中有着广泛用途的化工产品,因此广泛存在于环境中。这类疏水性有机化合物因不易降解，以及对人的致突变性、致癌性和致畸性^[1]，已先后被美国环境保护局(U.S. Environmental Protection Agency简称EPA)、欧洲、中国列入优先控制污染物名单^{[2, 3]}。据统计，每年排入英国南部亨伯流域工业废水中氯苯总量为133 kg，美国2001年向土壤中排放了1,2,4-TCB 3497 kg，累计已排放53023 kg。美国、英国和加拿大等国城市污泥中CBs的含量通常为0.1—50 mg/kg，主要在1—10 mg/kg之间，少数在50 mg/kg以上，有的甚至高达1700 mg/kg^{[4, 5, 6, 7]}。中国部分城市污泥中CBs化合物的总含量(CBs)在0.01—6.92 mg/kg之间^[8]，珠三角、长三角、环渤海湾等地区和沈阳、兰州、西安等城市的污泥、土壤及地下水中都可检测出1,2,4-TCB，其中在水中浓度可达1.55 μg/L，污泥中含量高达2.93 mg/kg^{[9, 10]}。

三氯苯(TCB)有3种同分异构体1,2,4-TCB、1,2,3-TCB和 1,3,5-TCB，其中1,2,4,-TCB应用最为广泛。三氯苯对生态环境的影响在国内外已经引起广泛关注，以往的研究主要集中在氯苯污染物的生态效应^{[11, 12, 13]}，水生植物和动物的毒性毒理机制^{[14, 15, 16]}以及污染物修复方面^{[17, 18]}，而对高等植物尤其是农作物的毒性机理及其生态效应研究较少。水稻是我国第一大粮食作物，而且又是消耗水分较多的作物，而水是三氯苯迁移的主要载体，因此水稻易受到三氯苯的危害。灌浆期是水稻品质和产量的形成期，以往相关的研究多数为1,2,4-TCB短期胁迫且主要集中在苗期^{[19, 20, 21, 22, 23, 24, 25]},分蘖盛期^[26]以及品种筛选上，抽穗期也有少量报道^[27],至今未见灌浆期的相关报道，这样难以了解1,2,4-TCB对水稻生长的长期伤害效应和对产量形成的影响。本文在前期筛选出对1,2,4-TCB胁迫耐性显著差异的代表性水稻品种^[26]基础上，研究不同基因型水稻灌浆期对1,2,4-三氯苯胁迫的响应，进一步比较耐性、敏感类型的生理特点及产量的差异性，为耐1,2,4-三氯苯水稻品种的筛选和稻米安全生产提供参考。

供试品种：宁粳1号(Ning Jing1简称NJ，敏感基因型)和扬辐粳8号(yang Fujing8简称YFJ，耐性基因型)为前期筛选出的代表品种^[26]。

1,2,4-三氯苯(TCB)化学纯，含量≥98.5%，购自国药集团化学试剂有限公司。

试验于2013年5—10月份在扬州大学实验农场(东经119.42°，北纬32.39°)，该地属亚热带季风气候，5—10月份平均气温24℃，月降水量88 mm，月日照时数168 h。在大棚内盆栽，塑料盆钵直径25 cm、高30 cm，装土15 kg。土壤取自农场稻田耕层土壤，砂壤土，经3 mm孔径过筛，土壤pH(H₂O)值 6.89、全氮0.14%、速效磷35.62 mg/kg、速效钾88.12 mg/kg、有机质14.9 g/kg。每盆施尿素2 g，磷酸二氢钾0.5 g作为基肥，稀硫酸调节pH值在5.0—5.5之间。

根据前人相关研究^{[23, 24, 28]}和预备性试验，设置0(对照)、10、20、40、80 mg/kg土的 1,2,4-三氯苯(TCB)5个浓度处理，每个处理重复8次。按处理浓度将1,2,4-TCB溶液(丙酮作为溶剂)加入到土中，充分搅拌均匀，加水浸泡放置3d后，于7月1号移栽，每盆栽3穴，每穴双本。水稻秧苗3叶1心，秧龄18d。整个生长季在通风透光避雨玻璃棚，以防氯苯淋失，其他栽培管理同大田。

在水稻灌浆期(抽穗后20d)，各品种各处理取代表性植株 5 穴(10株)，测量株高后，按茎、叶片、穗和根分组，并在 105℃烘箱内杀青 15 min，然后 80℃烘至恒重称取干重。

水稻抽穗后20d，各品种各处理取代表性植株3穴测定相关生理指标。取冲洗干净根系根尖0.5 g，采用α-萘胺法测定根系活力(μg g^-1 h^-1鲜重)；采用SPAD-502型叶绿素计测定剑叶叶绿素含量。测定剑叶蛋白质含量、酶及其活性，其中：蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定(mg/g鲜重)^[29]；丙二醛(Malondialdehye 简称MDA)含量采用硫代巴比妥酸(Tertiary Butanol 简称TBA)法测定(μmol/g鲜重)^[30]；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase 简称SOD)活性采用氮蓝四唑(Nitrotetrazolium Blue Chloride 简称NBT)光还原法^[31]测定，以抑制反应50%的酶量为一个酶活性单位(U)，酶活性(U g^-1 min^-1鲜重)表示；过氧化物酶(Peroxidase 简称POD)的活性采用愈创木酚法^[29]，以每分钟A470值变化0.01作为一个酶活性单位(U)，酶活性(U g^-1 min^-1鲜重)表示；过氧化氢酶(Catalase 简称CAT)采用紫外吸收法^[32]测定活性(U g^-1 min^-1 鲜重)。

成熟期，各品种各处理取两盆水稻用于考种测产，测定每盆水稻产量及其穗数，每穗粒数，结实率和千粒重。

用Excel 2007进行数据整理，用SPSS 17.0软件进行方差分析与多重比较。

方差分析表明(表 1)，产量在基因型间、1,2,4-三氯苯处理(TCB)浓度间差异均达极显著水平，并且二者存在极显著的互作效应。产量构成各因素在基因型间的差异达极显著水平，在TCB浓度间除对千粒重的影响不显著外对其他产量三因素的影响达极显著水平，且每盆穗数还存在基因型间与TCB处理极显著的互作效应。

随着TCB浓度的增加，敏感基因型宁粳1号的产量呈现递减趋势，而耐性基因型扬辐粳8号呈低浓度下产量增加高浓度下产量显著降低的趋势。在10 mg/kgTCB浓度处理时，宁粳1号产量与对照差异不显著，扬辐粳8号产量比对照提高5.7%，每盆穗数，每穗粒数，结实率分别提高6.19%、2.75%、2.17%。在20 mg/kgTCB浓度处理时，宁粳1号产量极显著低于对照，且每盆穗数极显著低于对照，每穗粒数和结实率也显著低于对照，而扬辐粳8号产量、每盆穗数，每穗粒数，结实率变化不明显，随着TCB浓度的进一步增加，两个基因型品种每盆穗数，每穗粒数，结实率均极显著下降，且宁粳1号降幅较大，在不同浓度的TCB处理下两个基因型品种千粒重的变化均不显著。

如表 2所示敏感基因型宁粳1号株高、地上部和地下部干物重在10 mg/kg TCB浓度处理时与对照差异不显著，在20 mg/kg TCB浓度处理时，株高、地上部和地下部干物重比对照降低9.48%、9.54%、11.9%，差异达显著水平。耐性基因型扬辐粳8号在(10，20 mg/kg)TCB浓度处理时，株高与对照差异不显著，甚至略有增加，如在20 mg/kg TCB浓度处理时，株高，地上部干物重，地下部干物重分别增加0.46%，5.6%，4.5%，其中地上部干物重显著高于对照，随TCB浓度进一步增加，两个基因型品种株高，地上部干物重，地下部干物重均显著降低，且宁粳1号降幅较大。低浓度TCB对耐性基因型品种扬辐粳8号具有一定的刺激作用，促进其株高生长，干物质积累，敏感基因型品种宁粳1号，耐性较差，在中低浓度TCB处理时即出现明显抑制作用，根系抑制作用明显，植株矮小，叶色偏黄。

如图 1所示，未进行TCB处理时，两个基因型品种根系活力差异不显著，随着TCB浓度的升高，敏感基因型宁粳1号根系活力呈下降趋势，而耐性基因型扬辐粳8号根系活力呈先上升后下降的趋势，在20 mg/kg TCB浓度处理时宁粳1号根系活力极显著低于对照，而扬辐粳8号根系活力极显著大于对照，在40 mg/kg TCB浓度处理时，宁粳1号根系活力极显著降低，而扬辐粳8号根系活力变化不明显，在80 mg/kg TCB浓度处理时，两个基因型品种根系活力均极显著低于对照，且宁粳1号降幅较大，极显著低于扬辐粳8号。

图 1 1,2,4三氯苯对两种基因型水稻灌浆盛期根系活力的影响 Fig.1 Effect of 1,2,4-TCB (trichlorobenzene) on root activity in the two rice genotypes at the grain filling period 柱上标以不同大、小写字母时分别表示0.01和0.05差异显著水平

图选项

由图 2可以看出，随着TCB浓度的增加，敏感基因型宁粳1号叶片叶绿素含量呈下降趋势，在20 mg/kg TCB浓度处理时，极显著低于对照，并随进一步TCB浓度增加而明显降低，达极显著水平。耐性基因型扬辐粳8号叶片的叶绿素含量在(10，20 mg/kg)TCB浓度处理时呈上升趋势，在20 mg/kg TCB浓度处理时显著高于对照，随进一步TCB浓度增加而明显低于对照，达极显著水平。未进行TCB处理时,两种基因型水稻的叶片叶绿素含量差异不显著; 相同浓度TCB(20、40 mg/kg和80 mg/kg)处理时，扬辐粳8号叶片叶绿素含量极显著高于宁粳1号。

图 2 1,2,4-三氯苯胁迫对灌浆盛期水稻叶片叶绿素含量(SPAD 值)的影响 Fig.2 Effect of 1,2,4-TCB on chlorophyll content (value of SPAD) of leaves in the two rice genotypes at the grain filling period 标以不同大、小写字母时分别表示0.01和0.05差异显著水平

图选项

1,2,4-三氯苯处理下，水稻叶片蛋白质含量存在明显的基因型差异，如图 3所示，未进行TCB处理时，两个基因型品种叶片可溶性蛋白质含量差异不显著，相同浓度的TCB处理下，耐性基因型扬辐粳8号叶片可溶性蛋白质含量显著或极显著大于敏感基因型宁粳1号。

图 3 1,2,4-三氯苯胁迫对灌浆盛期水稻叶片可溶性蛋白质含量的影响 Fig.3 Effect of 1,2,4-TCB on the soluble protein content in rice leaves at the grain filling period 标以不同大、小写字母时分别表示0.01和0.05差异显著水平

图选项

随着TCB浓度的升高，两个基因型品种均呈现先增后减的趋势，当1,2,4-三氯苯浓度大于20 mg/kg时，宁粳1号叶片可溶性蛋白质含量下降，而扬辐粳8号叶片可溶性蛋白质含量上升，在80 mg/kg TCB浓度处理时，宁粳1号极显著低于对照，而扬辐粳8号极显著高于对照。

如图 4所示未进行TCB处理时两个基因型品种叶片MDA含量差异不显著，随着TCB浓度的升高，两个基因型品种叶片MDA含量均总体呈升高趋势，且敏感基因型品种宁粳1号增幅较大，在10 mg/kg TCB浓度处理时，敏感基因型宁粳1号叶片MDA含量变化不明显，而耐性基因型扬辐粳8号叶片MDA含量显著低于对照，在20 mg/kg和40 mg/kg TCB浓度处理时，宁粳1号显著或者极显著大于对照，而扬辐粳8号与对照差异不显著，在80 mg/kg TCB浓度处理时，两个基因型品种均极显著大于对照，在TCB浓度(20—80 mg/kg)处理下，宁粳1号叶片MDA含量极显著大于扬辐粳8号。

图 4 1,2,4-三氯苯胁迫对灌浆盛期水稻叶片丙二醛含量的影响 Fig.4 Effect of 1,2,4-TCB on the producing velocity of content of MDA in rice leaves at the grain filling period 标以不同大、小写字母时分别表示0.01和0.05差异显著水平

图选项

如图 5所示，两个基因型品种叶片SOD活性在未进行TCB处理时，差异不明显，随着TCB处理浓度的升高，均呈现先升高后降低的趋势且存在基因型差异，在0—20 mg/kg TCB浓度处理时，敏感基因型品种宁粳1号SOD活性显著或极显著低于耐性基因型品种扬辐粳8号，在60 mg/kg TCB浓度处理时，宁粳1号叶片SOD活性极显著低于对照，而扬辐粳8号极显著高与对照，在80 mg/kg TCB浓度处理时，均极显著低于对照且宁粳1号叶片SOD活性极显著低于扬辐粳8号。

图 5 1,2,4-三氯苯胁迫对灌浆盛期水稻叶片SOD活性的影响 Fig.5 Effect of 1,2,4-TCB on the activity of SOD rice leaves at the grain filling period 标以不同大、小写字母时分别表示0.01和0.05差异显著水平

图选项

如图 6所示，随着TCB浓度的增加，宁粳1号和扬辐粳8号叶片SOD活性均呈先上升后下降的趋势，且均在20 mg/kg TCB浓度处理时达最大值。敏感基因型宁粳1号SOD活性在80 mg/kg TCB浓度处理时极显著低于对照，而扬辐粳8号叶片SOD活性在不同浓度TCB处理时均极显著高于对照。在20、40 mg/kg和80 mg/kg TCB浓度处理时，宁粳1号叶片POD活性均极显著低于扬扬辐粳8号。

图 6 1,2,4-三氯苯胁迫对灌浆盛期水稻叶片POD活性的影响 Fig.6 Effect of 1,2,4-TCB on the activity of POD rice leaves at the grain filling period 标以不同大、小写字母时分别表示0.01和0.05差异显著水平

图选项

如图 7所示，随着TCB浓度的增加，两个基因型品种叶片CAT活性均呈现先增后减趋势，都在20 mg/kg TCB浓度时达到最大值。敏感基因型品种宁粳1号叶片CAT活性在10、20 mg/kg TCB浓度处理时与对照差异不显著，随着进一步TCB浓度的增加而明显降低，达极显著水平。耐性基因型品种扬辐粳8号叶片CAT活性在10、20 mg/kg TCB浓度处理时极显著大于对照，在40、80 mg/kg TCB处理时与对照差异不显著。未进行TCB胁迫时两种基因型水稻叶片CAT活性差异不显著，相同TCB胁迫下扬辐粳稻叶片CAT活性均极显著大于宁粳1号。

图 7 1,2,4-三氯苯胁迫对灌浆盛期水稻叶片CAT活性的影响 Fig.7 Effect of 1,2,4-TCB on the activity of CAT rice leaves at the grain filling period 标以不同大、小写字母时分别表示0.01和0.05差异显著水平

图选项

随着农田中1,2,4-TCB的累积，对作物生长的影响已引起了广泛的关注^[22]。王泽港等^[33]研究发现，TCB导致水稻减产的原因是穗数、穗粒数、结实率的降低。本研究发现，产量结构的下降顺序是穗数>粒数>结实率，这与洛育^[34]研究相一致，1,2,4-三氯苯对水稻产量的影响存在基因型差异，在低TCB处理(10 mg/kg)耐性基因型扬辐粳8号产量有所上升，而敏感基因型宁粳1号产量下降。进一步随TCB处理浓度升高，两品种产量极显著下降，宁粳稻1号降幅远大于扬辐粳8号，主要是宁粳稻1号的穗数、粒数降幅大。TCB对产量的影响前期主要是分蘖发生的抑制，灌浆结实期是籽粒灌浆充实不良，秕粒增多。耐性基因型扬辐粳8号可能由于TCB诱导相关解毒酶的产生，提高了耐受性。

1,2,4-三氯苯对小麦苗期^[35]、水稻苗期^[19]、分蘖盛期^[26]根系活力均有显著的抑制作用，影响根系结构，导致脂质过氧化，对根系蛋白质组也有显著影响^{[36, 37]}，进而影响株高、干物质积累^{[24, 28, 35]}，本研究发现1,2,4-三氯苯对灌浆结实期根系活力、株高、地上部干物重、地下部干物重仍具有显著的抑制作用且存在基因型差异，耐性基因型扬辐粳8号在低浓度TCB处理下根系活力显著提高，株高、地上部干物重、地下部干物重与对照相比分别升高0.46%、5.6%、4.5%，说明低浓度TCB扬辐粳8号的生长具有一定的促进作用，而敏感基因型宁粳1号在低浓度处理下即出现抑制作用，根系活力显著降低，植株矮小，叶色发黄，干物重降低，高浓度TCB胁迫下，两个基因型品种均出现显著的抑制作用，且宁粳1号降幅较大。耐性扬辐粳8号在根系活力相对较高，耐性较强可能是由于TCB诱导脂酶、醛/酮还原酶、谷胱甘肽-硫转移酶等相关的解毒酶。

植物受胁迫诱导会积累基因的蛋白产物以应对不良环境^[38]。TCB 胁迫能诱导根系内不同类型蛋白质的表达^[36]，本研究发现TCB胁迫对水稻灌浆期叶片蛋白质含量的影响存在基因型差异，低浓度TCB(10 mg/kg，20 mg/kg)胁迫时，两个基因型品种叶片蛋白质含量均呈上升趋势，扬辐粳8号蛋白质含量增加幅度较宁粳1号大，随着TCB浓度的进一步升高，宁粳1号蛋白质含量开始下降，但与对照差异不显著，而扬辐粳8号蛋白质含量略有下降但仍极显著高于对照。扬辐粳8号叶片可溶性蛋白质含量在中低浓度TCB处理下极显著升高，诱导抗性蛋白的产生，高浓度TCB胁迫时正常蛋白质的表达有一定的抑制作用，但是仍能极显著高于对照。敏感基因型品种宁粳1号在中高浓度TCB会造成DNA的损伤，正常蛋白质的转录翻译受阻，病程相关蛋白继续产生，与对照差异不显著。本研究发现TCB胁迫下，对水稻生育后期(灌浆盛期)蛋白质含量的影响与苗期^[25]和分蘖盛期^[26]有所不同，因此，可通过蛋白质组学进一步了解蛋白质表达的差异性，获取差异蛋白。

王泽港等^{[24, 27]}研究发现，TCB能使水稻苗期、抽穗期叶片叶绿素含量和 Rubisco 酶显著降低。灌浆期是产量形成的关键时期，本研究发现灌浆结实期敏感基因型宁粳1号叶片叶绿素含量随着1,2,4-TCB浓度升高呈递减趋势，在低浓度TCB处理时已极显著低于对照，而耐性基因型扬辐粳8号在低浓度TCB处理时有所上升，在相同浓度TCB胁迫时，宁粳1号叶绿素含量显著或者极显著低于扬辐粳8号，光合器官受到伤害，而籽粒的灌浆物质70%—80%来自于开花后功能叶的光合作用^[39]，这是敏感基因型品种宁粳1号产量降幅较大的主要原因。

逆境下植物产生更多的活性氧自由基，水稻细胞内活性氧自由基代谢平衡受到破坏，造成活性氧自由基的积累，膜脂过氧化作用加剧，损坏细胞膜系统结构和功能。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的主要产物之一，其积累量可以代表膜脂过氧化作用的程度。SOD、POD和CAT则共同组成植物体内一个有效的活性氧清除系统^[40]，能够有效地清除植物体内的自由基和过氧化物。张国良等^[25]，王泽港等^[36]，丁秀文等^[26]研究发现，高浓度TCB 胁迫下水稻苗期、分蘖盛期敏感品种叶片MDA含量显著高于对照，SOD、POD、CAT有所下降，O2^- 产生速率极显著高于对照。本研究发现，两品种对1,2,4-TCB 胁迫的酶活性响应存在明显的基因型差异，耐性基因型扬辐8号在中低浓度TCB胁迫时，叶片中三种抗氧化活性酶均显著升高，清除活性氧能力增强，MDA含量有所下降。敏感基因型宁粳1号叶片抗氧化酶清除活性氧的能力较弱，引起膜脂过氧化加剧,最终其MDA 含量高于耐性基因型。说明耐性基因型在中低浓度时，TCB诱导抗性蛋白质的表达，提高抗氧化物酶活性，清除活性氧自由基，膜脂过氧化程度低^[34]。

1,2,4-三氯苯胁迫对不同基因型水稻产量和灌浆期生长生理特性的影响存在基因型差异，低浓度TCB(10 mg/kg)促进耐性基因型扬辐粳8号的生长和产量的提高，而敏感基因型宁粳1号在低浓度TCB胁迫下即出现抑制作用，中高浓度TCB处理时两个基因型品种都出现明显的抑制作用。耐性基因型扬辐粳稻8号产量、株高、干物重、叶绿素含量抑制程度相对较低、蛋白质含量高、抗氧化酶清除能力强、膜脂过氧化程度相对较低，进一步明确了水稻耐1,2,4-三氯苯的筛选评价指标，为水稻抗逆栽培管理和品种选用提供了依据。