陇东黄土高原地处甘肃东部，属黄河中游黄土高原沟壑区，区内塬(梁)川(沟)相间,高差400m；其西北部，由于严重的水土流失，已演变成梁峁丘陵区。甘肃省庆阳市是长庆油田的主产区之一，油田开采历史长，自1971年油田开发以来，已有40多年的历史。自“十二五”以来，进入开采高峰期，2011年原油产量达到451.66 × 10⁴ t^[1]。开采方式由最初的粗放式开采，到现在的规范化生产。该区域为生态脆弱区，生态环境容易受到破坏。石油开采使得土壤发生扰动，地表结构改变，增加了水土流失和生态破坏的风险。同时，石油开采、维修及运输中的泄漏对土壤环境造成污染，这些污染物(石油中的烃类化合物)经多途径进入环境后较难降解消失，对土壤环境以及土壤动物造成危害，降低整个生态系统中物种丰富度及多样性指数，对生态系统造成难以修复的危害^[2]。

线虫是土壤动物区系中种类最为丰富的无脊椎动物之一，它们参与土壤有机质分解、植物营养矿化和养分循环等重要生态过程，在土壤食物网中占有重要地位^[3]，被广泛地应用于土壤健康状况与土壤环境污染指示研究^[4]。线虫群落研究发展相对成熟，如成熟度指数(MI)能敏感地反映土壤环境的受胁迫程度^[5]。线虫通路指数(NCR)能表示土壤有机质的分解途径^{[3, 6]}。石油开采影响土壤线虫，一般认为油田污染土壤对土壤线虫有明显毒性^[7]，采油区线虫数量减少^{[8, 9]}。但也有研究者认为使用开采污染区土壤后线虫多样性有所增加^[10]。并且不同营养类型土壤线虫对石油开采污染的反应不一，Heininger等认为石油污染条件下，捕食/杂食类线虫数量与污染呈正相关^[11]，而Chen等认为该类群数量与污染呈负相关^[12]。陇东黄土高原油井钻井、维修区域一般在油井口周围20m左右范围，该区域为标准化作业区，近10多年的油井均有围墙隔离，作业区内无植被杂草覆盖，土地利用方式、土壤理化性质与污染程度与周围环境有明显的差别。并且不同油田油井密度不一，开采历史以及开采方式不一样，油田的管理水平不一样。因此，石油开采对土壤的污染状况以及对土壤生物的影响还有待进一步研究。

为了研究石油开采对土壤线虫群落的影响，在陇东黄土高原长庆油田选择环境一致的不同开采年限(1、10a和20a)油井，按不同距离采集土壤线虫，分析黄土高原石油开采过程中油井开采年限以及距离与线虫群落结构的关系，揭示石油开采对土壤线虫群落的影响，其结论将为石油开采生态保护以及开采区污染土壤的修复打下理论基础。

本研究选取位于中国甘肃省庆阳市华池县黄土高原区的长庆油田(107°29′—108°33′ E，36°07′—36°51′ S)作为研究区。该区属于黄土高原丘陵沟壑区，年平均降水量为510mm，年平均气温为8.7 ℃，无霜期178 d^[13]。油井作业区一般为20m，除部分老旧油井，大部分都有围墙，围墙外为自然植被类型。

2013年9月在长庆油田选取开采时间为1a(井Ⅰ和Ⅱ)、10a(井Ⅲ和Ⅳ)和20a(井Ⅴ和Ⅵ)的油田各2井，在距离采油井口分别为3、6、10、20m和50m处，以油井为中心向3个方向辐射布点采样，共采集90个土壤样品^[14]。每个采样点设2 m×1m样方，在样方内选择3个点取土，用土钻采集深度为0—15 cm的表土，将其均匀混合后，制成约500mL混合土样放入保温袋中并迅速移至实验室，冰箱4 ℃保存，带回实验室分离土壤线虫和进行理化分析，以3个方位作为不同距离重复。

土样的含水率用土壤水分测量仪TRIME-PICO-IPH TDR测定。按2.5 ∶ 1的水土比制备土壤水浸液，用玻璃电极pH仪测定pH值。土壤总石油烃(total petroleum hydrocarbon,TPH)采用重量法测定^[15]。称取5.00 g风干土样，添加萃取剂二氯甲烷，超声15 min，4000 r/min离心10min，重复萃取，收集上清液，54℃旋转蒸发至干，在通风橱内挥发至恒重，称重。同时做2个平行样。

有机碳(organic carbon,OC)测定采用Analytikjena multi N/C 3100 TOC仪器测定。将自然风干两周土样用研钵轻研磨，过0.5 mm筛，称量样品300mg左右，装入取样舟，加入盐酸酸化，105—110℃烘箱干燥12 h，催化燃烧测定。

每个土样取土100 cm³，3 d内用改进的Baermann漏斗法分离线虫48 h^[16]，收集线虫悬浮液并浓缩至2 mL，用4％福尔马林溶液固定。光学显微镜下参照Goodey的分类系统^[17]和《中国土壤动物检索图鉴》^[18]以及《植物线虫志》^[19]，将线虫鉴定到属，并统计各属线虫数量。

土壤线虫依据Yeates等分为4个营养类型^[20]，分别为食细菌类(Bacterivores,Ba)、食真菌类(Fungivores,Fu)、植物寄生类(Herbivores,PP)和杂食捕食类(Omnivores-predators,OP)。线虫数量多度划分的标准为：个体数占线虫总数的百分比>10%为优势属；1%—10%为常见属；<1%为稀有属^[21]。

研究采用的生态学评价指数如下。Shannon-Wiener多样性指数(H′)，H′＝-∑P_ilnP_i，P_i=n_i/N，式中P_i为样品中属于第i种的个体的比例；n_i为第i类群的个体数；N为所有类群的个体总数^[22]。Pielou均匀度指数(J′)，J′＝H′/lnS，式中S为类群数^[23]。Simpson优势度指数(λ)，λ＝∑(n_i/N)²，λ＝∑H′^2[24]。线虫成熟指数(MI)，MI=∑v(i)·f(i)，式中v(i)是第i种线虫的生活史策略(c-p)值；f(i)第i种线虫的个体数占总个体数的比例^[5]。线虫通路比值(NCR)，NCR= N_Ba／(N_Ba + N_Fu)，瓦斯乐斯卡指数(WI)^[25]：WI =(N_Ba +N_Fu) /N_PP，式中N_Ba为食细菌线虫数量，N_Fu为食真菌线虫数量。N_PP为食植物类线虫数量^[3]。根据线虫不同的生活史策略,将线虫划分为5个colonizer persister (c-p)类群，分类参考Neher等^[26]。

数据采用SPSS软件(13.0版,SPSS Inc.)分析。不同年限油井和不同距离采样点土壤线虫的差异用ANOVA分析，处理间差异显著性检验采用最小极差法(Least-Significant Difference,LSD)方法。群落排序使用Canoco for win 4.5软件进行分析^[27]，采用典范对应分析(Canonical Correspondence Analysis,CCA)对物种丰富度和环境进行群落排序，将物种丰富度采用log(x+1)进行处理以满足正态分布假设。

距井基不同距离(3、6、10、20m和50m)土壤性质有较大差异(表 1)，土壤含水率在50m采样点处最高达(8.98±1.26)%，显著高于其它采样距离土壤含水率。土壤总石油烃(TPH)浓度在3 m和6 m显著高于10、20m和50m。

双因素方差分析表明，不同距离土壤含水率和TPH浓度差异极显著(P<0.001)，但各采样点pH值和有机碳含量差异不显著(P>0.05)。不同开采年限油井土壤pH值和TPH有显著差异(P<0.05)，但不同年限油井土壤含水率和有机碳含量差异不显著。开采年限和距离对土壤性质无交互效用(P>0.05)(表 2)。

共采集土壤样品90个，鉴定出土壤线虫22科43属。食细菌线虫有26属，食真菌线虫2属，植物寄生线虫9属，杂食/捕食线虫6属。其中，优势类群为小杆属Rhabditis和孔咽属Aporcelaimus，分别占线虫总数的15.2%和10.0%；常见类群有17属，占线虫总数的68.7%；稀有类群15属，占总线虫数量的6.1%(表 3)。

不同距离土壤线虫优势类群差异较大；其中，3 m处优势类群为散香属Beleodorus和头叶属Cephalobus，6 m和10m处的优势类群均为小杆属Rhabditis和中杆属Mesorhabditis，20m处优势类群为滑刃属Aphelenchoides、短体属Pratylenchus和孔咽属Aporcelaimus，50m处优势类群为针属Paratylenchus、滑刃属Aphelenchoides和孔咽属Aporcelaimus。

双因素方差分析表明，不同距离线虫属数量差异显著(F=2.72，P=0.04)(表 2)，不同年限油井线虫属数量存在极显著差异(F=15.11，P<0.001)，但开采年限和距离间无交互效用(F=0.92，P=0.5)。

各油井线虫生活史策略colonizer persister (c-p)以c-p 2类群为主，占总数的48.2%；其次为c-p 1，占25.1%；而c-p 4类群占比例最小，仅为2.2%。距井基不同距离采样点土壤线虫c-p组成差异较大(图 1)，3 m处以c-p2比例最高达65.7%，其次为c-p 1，而c-p 4比例最小。在6 m和10m处c-p 1比例最高，其次为c-p 2。而在20m和50m处，土壤线虫以c-p 2比例最高，其次为c-p 3，而c-p 4比例最低。方差分析结果表明，不同距离采样点，土壤线虫c-p 2和c-p 5差异极显著(P<0.01)，而其它类群差异均不显著(P>0.05)。

图1 不同距离采样点土壤线虫c-p组成比例 Fig.1 The composition ratio of soil nematode c-p at different distances from the oil wells

图选项

距井基不同距离的土壤线虫数量差异较大(图 2)。其中，3 m处线虫密度最小，为(23.5±7.1)条/100 cm³；6、10m和20m处线虫数量有所增加且较为接近，作业区50m外线虫数量最多达到(122.7±15.5)条/100 cm³。50m处土壤线虫数量显著高于油田作业区(3、6、10、20m)。不同开采年限油井土壤线虫如表 3表 示，开采年限10a油井土壤线虫数量最低，仅为(46.4±10.8)条/100 cm³，而开采年限20a油井土壤线虫数量最高，达到(69.2±12.6)条/100 cm³。双因素方差分析结果表明，不同距离土壤线虫数量差异显著(F=3.51，P=0.01)，不同开采年限土壤线虫数量无显著差异(F=0.54，P=0.58)，且开采年限和距离对土壤线虫总数有交互效用(F=2.38，P=0.03)(表 2)。

图2 距井基不同距离各营养类型线虫数量及线虫总量 Fig.2 the total number and number of each feeding type of nematodes at different distances from the oil wells 相同字母表示组间无显著性差异，不同字母表示有显著性差异，α=0.05

图选项

不同营养类型土壤线虫以食细菌线虫数量最多，其次为植食性线虫。各营养类型在不同距离差异较大，植食性线虫、捕食杂食类和食真菌类线虫数量以50m处最多，分别为(56.1±10.9)、(21.5±6.2)和(23.1±6.4)条/100 cm³，与其它几个距离采样点差异显著(P<0.05)。但食细菌线虫数量在不同距离采样点差异不显著(F=0.69，P=0.601)。不同开采年限油田不同营养类型土壤线虫差异较大。植食性线虫20a其中，20a油井最多，为(35.8±9.9)条/100 cm³；10a油井最少，为(1.5±2.1)条/100 cm³。不同年限油井食细菌线虫差异不显著。捕食/杂食类线虫和食真菌线虫以1a油井最多，为(12.0±5.5)和(14.2±5.7)条/100 cm³，而10a油井最少，为(1.3±2.3)和(1.8±2.3)条/100 cm³，且差异显著(表 4)。双因素方差分析结果表明，不同距离土壤植食性线虫和食真菌线虫数量差异极显著(P<0.01)，不同开采年限土壤植食性线虫、食真菌线虫和捕食/杂食类线虫数量显著极差异(P<0.01)，且开采年限和距离对土壤植食性线虫和食真菌线虫数量有交互效用(P<0.01)(表 2)。

距井基不同距离线虫群落指数如表 5，Shannon-Wiener多样性指数(H′)在50m处最高达2.558±0.869，在3 m处最低，而50m处H′显著高于3 m处。优势度指数(λ)为0.796—0.827，均匀度指数(J)为0.822—0.869，但不同距离之间λ和J差异不显著。成熟度指数(MI)在3 m处最高达2.712±1.13，显著高于6 m和10m处。瓦斯乐斯卡指数(WI)指数在各个距离差异不显著，线虫通路比值(NCR)也以3 m处最高，显著高于10、20m和50m处。双因素方差分析表明，MI指数在各个距离间存在显著差异(F=4.00,P=0.01)(表 2)。

不同开采年限油井线虫群落指数表示(表 6)，多样性指数H′以20a和1a油井较高，而10a油井最低，为1.912±0.806，且1a油井和20a油井H′显著高于10a油井。优势度指数以1a油井最高，为0.847±0.320，显著高于10a油井。范围为0.796—0.827，均匀度指数范围为0.820—0.871，但不同开采年限油井均匀度指数差异不显著。MI和WI指数以20a和1a油井较高，而10a油井较低，且1a油井和20a油井MI和WI指数显著高于10a油井。NCR则以10a油井最高，且显著高于20a和1a油井。方差分析表明，λ、H′、MI、WI和NCR指数在不同年限油井存在极显著差异(P<0.01)(表 2)，且开采年限和距离对土壤线虫均匀度指数有交互效用(P<0.01)。

对不同距离采样点土壤线虫进行物种-环境典范对应分析CCA排序，第一轴和第二轴特征值分别为0.132和0.093，且物种和环境的相关性分别达到0.702和0.745，且结果均达到显著水平(P<0.05)，能很好的解释物种分布。

从排序图(图 3)可以看出，土壤性质与第二轴较为相关，而不同采样距离与第一轴更为相关，其中3、6、10m和20m处土壤线虫与第一轴显著正相关，而50m处与第一轴显著负相关。3m处土壤线虫分布受TPH影响较大，50m处线虫与土壤湿度较为相关。而真矛线属Eudorylaimus的分布与土壤湿度较为相关。与50m处相关的物种有原矛线属Prodorylaimus与矮化属Tylenchorhynchus；而小杆属Rhabditis、畸头叶属Teratocephalus、棱咽属Prismatolainus、拟丽突属Acrobeloides等更倾向于分布在油井作业区内。

图3 油井土壤线虫物种-环境CCA排序双序图 Fig.3 Species-environment CCA diagram of soil nematodes in Changqing Oilfield

图选项

陇东黄土高原油田开采历史时间长，目前进入开采高峰期。巨大的原油开采量不仅会带来生态破坏，而且对环境也造成一定的污染。本文研究结果表明在陇东黄土高原油田作业区，由于油田开采实行标准化作业，植被杂草被清除，土壤裸露，加上长期由于钻井、维修和运输等因素影响，导致土壤性质发生改变，土壤含水量明显降低。同时，在油井井基周围6 m内土壤TPH明显增加，而在50m处土壤TPH污染显著减少，表明油田开采过程中，产生一定范围的土壤污染。

石油开采影响土壤性质并带来一定的污染，从而也影响土壤线虫数量与组成。距井基不同距离，由于土壤受到干扰不一样，土壤线虫丰富度发生较大变化，在50m处线虫数量最高，而在井场作业区(3、6、10m和20m)土壤线虫数量明显减少，尤其是植食性线虫、捕食杂食类和食真菌类线虫数量显著减少，结果说明石油开采影响土壤线虫数量。各油井线虫以c-p 2类群为主，占总数的48.2%。c-p 2类群世代时间短，产卵量大，较耐环境压力，表明油田开采区环境压力较大。其结果与Wang等调查胜利油田采油区土壤线虫丰富度显著低于对照区域结论一致^[10]。原因可能是因为油井作业区土地利用性质发生改变，地表覆盖和土壤性质发生变化，引起线虫数量减少。本文研究黄土高原油井周围土壤微生物群落，井场作业区土壤微生物群落功能多样性显著低于作业区外(50m)土壤微生物群落功能多样性^[14]，说明作业区土壤结构与功能均受到一定影响，石油开采使土壤生物多样性发生改变。

石油开采导致线虫优势类群也发生改变。长庆油田井场周围以食细菌线虫为最主要类群，可能是石油污染使土壤有机质含量增加刺激了土壤中微生物的生长，使土壤中微生物多样性增加^[28]，食细菌线虫增加。但不同区域油田土壤线虫优势类群不一。肖能文等调查大庆油田土壤线虫，其中食细菌线虫为最主要类群^[6]。Chen等调查黄河兰州段土壤，认为土壤PAHs污染严重位点，食细菌线虫数量较高，而PAHs污染较轻位点，植食性线虫数量较多^[12]，本文结果与之基本一致。但Wang等在胜利油田调查结果植食性线虫为主要类群^[10]，与长庆油田土壤线虫主要类群有一定差异，其差异可能是因为调查采样点不限定在油井周围，而是整个油田开采区。

油井开采年限对土壤线虫构成及群落均有一定影响，本文研究结果表明不同开采年限油井土壤线虫总数差异不显著，但群落组成变化很大。10a油井土壤线虫群落多样性指数H′、MI和WI指数最低，而开采年限20a和1a油井较高，且差异显著。而NCR指数以10a油井最高。可能原因是庆阳市油井开采历史较长，10a油井均为标准化作业油井，10a油井正处于生产高峰期，产量较高，同时维修也较多，因此对土壤干扰较为强烈，线虫受影响比较大。但是20a油井为老油井，大多没有建设标准的围场，产量相对也较低，干扰也逐渐减小。而新油井经过建设，运行稳定，因此干扰减小，土壤线虫得以恢复。

石油开采也改变了土壤线虫的群落结构，长庆油田井场3 m处线虫多样性指数H′较低，但MI和NCR指数较高，而在油井作业区外50m处H′最高，而WI最低。一般认为在干扰和污染环境，土壤线虫MI指数较低^[29]。Chen等认为干扰强度大的土壤，线虫MI指数较低^[12]，Wang等认为胜利油田采油区土壤线虫多样性较高^[10]，本文结论与上述结果均不一致。土壤线虫分布受到多种因素的影响，本文结果认为3 m处土壤线虫分布受TPH影响较大，50m处线虫与土壤湿度较为相关(图 3)。实验结果表明石油开采降低了土壤线虫群落多样性，生物多样性指数H′和成熟度指数MI能较好的评价油田开采对线虫群落的影响。但Suderman和Thistle认为石油污染对线虫无明显影响^[30]。不同类群的线虫对不同环境的选择不一，因此石油开采对土壤线虫群落结构的影响有待进一步的研究。

石油开采对油井周围土壤性质有一定影响，在油井3 m和6 m内土壤TPH含量显著高于10m以外的土壤，作业区土壤含水量降低。开采距离影响土壤线虫数量，油井作业区内(20m)土壤线虫显著低于作业区外(50m)；其中，植食性线虫、捕食杂食类和食真菌类线虫数量显著降低。此外，土壤线虫c-p构成和群落结构也发生改变，生物多样性指数H′和成熟度指数MI能较好的评价油田开采对线虫群落的影响。油井开采年限对土壤线虫构成及群落均有一定影响，土壤线虫以10a开采土壤线虫密度最低，捕食/杂食类线虫和食真菌线虫显著减少。10a油井指数H′、MI和WI均显著低于其它年限油井。