青藏高原位于中国西南部, 平均海拔4000 m以上, 是中国大陆地势最高的一级台阶, 具有地形复杂、海拔高、辐射强、气温低、积温少、气压低、风力大、气候频变等高原气候特点^[1-2], 属于气候变化的敏感区。该区域草地植被覆盖面积非常广, 占青藏高原植被总面积的63.9%^[3], 草地植物能在如此极端的环境中广泛分布与生存繁衍, 一定有其特殊的结构特征及生理、生态适应机制^[4-8]。草地植物对极端环境的适应方式多种多样, 而叶片作为植物的重要器官, 对环境生态因子的变化敏感, 可塑性强, 能够快速地反映环境的变化^[9-10], 因此可作为植物生态解剖的主要指标。目前关于低温、干旱、光照、海拔等环境因子对植物叶形态结构特征的影响已有较多研究, 但对其在经历青藏高原极端环境筛选后的叶解剖特征报道较少。前人基于青藏高原草地双子叶植物总结出了一些叶解剖特征的共性规律^[11-14], 但对该区域草地单子叶植物的相关研究非常有限。虽然在嵩草属植物中有少量报道^[15-16], 但因材料选取不足以及区域面积的局限, 难以归纳出具有普适意义的规律。因此, 本研究以青藏高原草地主要单子叶植物为试材, 通过对叶表面特征的系统观察, 尝试在区域尺度上分析高寒极端环境下植物叶表面细胞及气孔指标的共性特征, 探索其对高寒气候胁迫的响应方式与适应性变化规律, 为揭示青藏高原草地单子叶植物对高原极端环境的适应机理提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

材料由北京大学城市与环境学院提供, 样品于2003—2005年采至青藏高原, 采集的叶片在野外立即用福尔马林-醋酸-酒精固定液(Formalin-acetic-alcohol, FAA)溶液固定。研究区域(80.25°—101.03° E, 31.06°—37.43° N), 平均海拔4101 m(2934—4990 m), 年平均气温-0.41 ℃(-4.44—6.16 ℃), 生长季均温8.05 ℃(3.78—13.38 ℃), 年降水361 mm(110—569 mm), 生长季降水306 mm(85—485 mm)。研究材料隶属于莎草科(Cyperaceae)与禾本科(Gramineae), 分别为嵩草属(Kobresia)、苔草属(Carex)、扁穗草属(Blysmus)、芨芨草属(Achnatherum)、赖草属(Leymus)、洽草属(Koeleria)、早熟禾属(Poa)7个属, 包括小嵩草(Kobresia parva)、藏嵩草(Kobresia tibetica)、甘肃嵩草(Kobresia kansuensis)、矮嵩草(Kobresia humilis)、大花嵩草(Kobresia macrantha)、粗壮嵩草(Kobresia robusta)、高原嵩草(Koleusia pusillaIvan)、线叶嵩草(Kobresia capillifolia)、葡茎嵩草(Koleusia stolonifera)、藏苔草(Carex thibetica)、无穗柄苔草(Carex ivanoviae)、华扁穗草(Blysmus sinocompressus)、芨芨草(Achnatherum splendens)、醉马草(Achnatherum inebrians)、赖草(Leymus secalinus)、洽草(Koeleria cristata)、艾松早熟禾(Poa aitchisonii)17个种。

1.2 方法 1.2.1 光学显微镜观察

采用透明胶带粘取法制备装片, 在光学显微镜下观测叶表面特征。首先用10%的铬酸对样品离析12 h, 清水冲洗并浸泡。将透明胶带(普通型：宽度13 mm, 厚度0.05 mm)拉开8—10 cm, 胶面朝上平放在实验台面上；然后将样品从清水中取出, 用吸水纸迅速吸干表面水分；用镊子夹住材料, 分清上下表面, 将下表面顺长贴于胶带约1/3处, 再将胶带从1/2处对折, 平整地粘贴于材料的上表面, 用镊子柄沿同方向轻刮数下, 使胶带与叶片两面充分粘着；从对折处剪断胶带, 并缓慢撕开, 分清上下表皮胶面, 用清水冲洗除去叶肉细胞残留物；最后用吸水纸吸干表面水分, 将粘有上下表皮的胶带成对贴于载玻片上, 封片后用MoticB5光学显微镜观察, Motic Images Plus 2.0显微成像系统照相和测定。

1.2.2 气孔测量指标

气孔的数量特征主要考察气孔长度(SL)、气孔密度(SD)与气孔指数(SI)3个指标。(1) 气孔长度(SL)测定：在显微镜下选取10个视野, 每个视野随机选取5个气孔, 测量其保卫细胞长度, 即为气孔长度(μm)。(2) 气孔密度(SD)测定：在显微镜下随机选取10个视野计算气孔数目, 移动载玻片在表皮的不同部位进行气孔计数, 连续计数10次, 将其平均值换算为单位面积的气孔数, 即为叶片的气孔密度(个/mm²)。(3) 气孔指数(SI)测定：随机观察10个视野, 统计单位视野气孔个数(S)和单位视野普通表皮细胞个数(P), 计算气孔指数。气孔指数(%)=(S/S+P)×100 %。

1.2.3 气候指标及气候数据来源

对全国670个标准气象台站1970—1999年间每月平均温度和降水数据进行克里格(Kriging)插值分析, 该数据来自于世界气候数据网站(http://www.worldclim.org), 然后根据样地的经纬度从插值结果中提取样地的每月平均温度和降水数据, 以30 a的平均值作为样地的温度和降水数据^[17], 本文使用生长季均温、生长季降水两个气候指标。

1.2.4 统计分析

对实验数据采用SPSS19.0统计软件进行分析。对于不同物种间气孔数量指标差异采用one-way ANOVA方差分析, 气孔数量指标对环境因子的响应采用Pearson相关分析以及线性回归分析。

2 结果与分析 2.1 青藏高原草地主要单子叶植物的叶表面形态特征

青藏高原草地单子叶植物长期受高原气候环境的筛选, 形成了一些特有的叶表面共性特征：(1) 从叶表面细胞形态方面分析, 叶表面细胞普遍存在长细胞与短细胞两种类型。长细胞占多数, 呈规则长方形, 相互嵌合、排列紧密, 相邻细胞纵向相接成行, 各行平行排列, 细胞垂周壁不同程度地弯曲(图 1)。不同物种短细胞形态、丰缺及着生方式差异明显(表 1)。具体表现为嵩草类植物与洽草(Koeleria cristata), 短细胞数量少, 呈短长方形、椭圆形或圆形, 零星分散在长细胞之间, 形态与长细胞差异不大；而芨芨草(Achnatherum splendens)、醉马草(Achnatherum inebrians)、赖草(Leymus secalinus)与艾松早熟禾(Poa aitchisonii)短细胞数量多, 特化为马鞍形, 单独分布或两两孪生, 有规律地排列在长细胞两端, 细胞壁加厚或不加厚。少数种类如芨芨草(Achnatherum splendens)部分短细胞特化为圆形及正方形, 紧密聚集成行与长细胞平行排列(图 2)。(2) 从气孔的分布位置分析, 青藏高原草地单子叶植物气孔多分布于叶片下表面, 属于典型的单面分布型气孔。实验研究的17个代表物种, 除芨芨草(Achnatherum splendens)、醉马草(Achnatherum inebrians)、赖草(Leymus secalinus)与艾松早熟禾(Poa aitchisonii)4个种类在叶片上表面观测到气孔；其余种类仅在叶片下表面有气孔分布(表 2)。(3) 从气孔形态方面分析, 不同物种气孔器形态、保卫细胞及副卫细胞形态表现出较为明显的多态性。保卫细胞呈中部狭窄、两端膨大的哑铃形, 或两端与中间宽度相差不大的近平边形, 或中间略微偏大的半月形；副卫细胞与保卫细胞平行, 呈圆顶形。气孔复体椭圆形、宽椭圆形或近圆形, 等间距或不等间距地呈直线排列, 与表皮细胞长轴平行, 形成明显的“气孔带”。(4) 从气孔器类型方面分析, 青藏高原草地单子叶植物气孔器均是平列型(paracytic type), 由两个副卫细胞与保卫细胞共同构成；副卫细胞与保卫细胞平行, 并完全包围保卫细胞。

2.2 青藏高原草地主要单子叶植物叶表面气孔数量特征分析

上表面气孔数量特征分析结果表明(表 3)：艾松早熟禾(Poa aitchisonii)的气孔长度最大(46.85±0.86) μm, 赖草(Leymus secalinus)次之(45.78±1.06) μm, 芨芨草(Achnatherum splendens)与醉马草(Achnatherum inebrians)气孔较小, 保卫细胞纵向长度分别为(29.41±0.518)μm与(29.84±1.57)μm；芨芨草(Achnatherum splendens)上表面的气孔密度最高(356.57±15.07)个/mm², 约是其下表面气孔密度的6倍；醉马草(Achnatherum inebrians)上表面气孔密度为(120.08±17.51)个/mm², 也显著大于其下表面气孔密度(80.21±3.24)个/mm²；而赖草(Leymus secalinus)与艾松早熟禾(Poa aitchisonii)上表面的气孔密度分别为(75.68±5.52)个/mm²与(86.49±9.13)个/mm², 却明显小于下表面的气孔密度(250.88±16.22)个/mm²与(166.52±7.38)个/mm²。

下表面气孔数量特征观测结果表明(表 4)：气孔长度最大的为洽草(Koeleria cristata)(47.50±0.89) μm, 最小的为藏苔草(Carex thibetica)(30.48±0.58) μm, 平均气孔长度为(34.50±0.28) μm；矮嵩草(Kobresia humilis)气孔密度最大(299.52±9.51)个/mm², 无穗柄苔草(Carex ivanoviae)的气孔密度最小(50.22±4.72)个/mm², 平均气孔密度为(194.07±4.74)个/mm²；气孔指数的极大值与极小值分别为洽草(Koeleria cristata)(26.68±1.61)%与无穗柄苔草(Carex ivanoviae)(8.35±0.69)%。就下表面3个气孔数量指标而言, 气孔密度的变异系数最大(53.02%), 气孔长度的变异系数最小(17.94%)。另外, One-way ANOVA结果表明：不同物种间叶片下表面在SL、SD与SI指标上差异均极显著(P < 0.01)。

2.3 青藏高原草地主要单子叶植物气孔特征与环境之间的关系 2.3.1 气孔特征参数与环境因子的相关分析

Pearson相关分析结果表明：(1) 海拔与叶表面气孔特征之间呈正相关关系, 相关系数检验极显著(P < 0.01), 即随着海拔的升高, SL、SD与SI均呈现上升的趋势。(2) 生长季均温与SL之间呈弱正相关(P < 0.05), 与SD、SI之间呈极显著负相关关系(P < 0.01), 即随着生长季均温的降低, 气孔长度变小, 而SD与SI呈现增加的趋势。(3) 生长季降水与SL之间呈负相关, 相关系数检验极显著(P < 0.01), 而与SD、SI之间呈极显著正相关关系(P < 0.01), 即随着生长降水的减少, 气孔长度一定程度上增大, 而SD与SI则呈下降趋势。

2.3.2 生态环境因子对气孔特征参数的回归分析

为了分析环境生态因子的综合效应以及各因子的效应大小, 以海拔、生长季均温与生长季降水为自变量对气孔数量指标进行线性回归分析(表 6)。

回归分析表明：海拔、生长季均温与生长季降水对SL的回归方程为Y=0.005X₁+0.878 X₂-0.021X₃+12.278, 回归方程统计检验显著(P < 0.01), 3个环境变量的回归系数显著(P < 0.01)；环境生态因子对SD的回归方程为Y=0.046X₁-11.688X₂+0.466X₃-46.391, 回归方程检验显著(P < 0.01), 各环境变量的回归系数显著(P < 0.01)；3个环境生态因子对SI的回归方程为Y=0.003X₁-0.363X₂+0.009X₃+7.394, 回归方程检验显著(P < 0.01), 生长季均温回归系数不显著(P>0.05), 海拔与生长季降水回归系数极显著(P < 0.01)。总体而言, 环境因子对SD的决定系数最大(R=0.690), SL次之, 而对SI的贡献率相对最小。

3 讨论

青藏高原高达60%的区域被高寒草甸与高寒草原覆盖, 草本植物居多数^[18], 这些植物长期生活在极端胁迫环境中, 进化出多种生理生态适应机制。该区域主要草地单子叶植物叶表面的独有特征, 印刻着其在经历生理干旱、昼夜温差大的高原气候等逆境筛选后结构饰变的痕迹, 是植物对多种生态因子综合响应的结果, 体现了植物对高寒独特生境的适应。

3.1 叶表皮细胞的生态适应

青藏高原草地植物对高寒气候环境的生态适应突出体现在叶表面厚度指标方面, 具体表现为叶表面细胞及角质层均加厚, 且许多植物发育出表皮毛等附属物^[11]；不同区域横向比较结果表明青藏高原草地双子叶植物上、下表面细胞厚度普遍大于内蒙古草原叶表面厚度^[12], 厚的表皮细胞具有隔热、保水、抗损伤等功能。本研究对青藏高原主要草地单子叶植物叶表面细胞形态的观察, 佐证了叶表面细胞对高寒严酷环境适应的另一种机制。本研究的草地单子叶植物叶表面细胞普遍存在长、短两种类型。长细胞为规则长方形, 垂周壁为波纹状, 纵向嵌接成行, 与叶脉平行紧密排列, 为典型的单子叶植物叶表皮组合式样, 这种结构有助于增强细胞刚性, 是植物抗旱抗寒能力较强的表现^[19]。短细胞形态多样, 具有明显的类群差异性。尤其是禾本科的短细胞特化为马鞍形, 以单生或孪生方式, 有规律地固定在长细胞两端, 这种结构可能具有“锚定”加固作用, 有助于增强长细胞之间的结合力度, 增强抗风撕裂能力, 使植物在受到大风、冰雹、温度极变、强辐射等不良环境损伤时, 能更好地保护其内部结构。这也是青藏高原草地单子叶植物在叶表面解剖层次上对严酷生境的适应。

3.2 气孔分布及形态的生态适应

虽然气孔总面积仅占叶片表面积的5%^[20], 但气孔的分布与大小会对环境因子感知并趋势应答^[21], 直接决定着植物的蒸腾与光合作用。有研究表明高山植物与旱生植物类似, 气孔多分布在叶片下表面^{[4, 22]}, 有利于减少水分蒸发。青藏高原主要草地单子叶植物气孔分布观察结果表明, 大多种类(75%)仅下表面分布气孔, 从较大规模尺度上验证这一分布规律。气孔选择性地分布在下表面, 可在不影响CO₂同化率的情况下, 一定程度上起到限制水分蒸发的作用, 可避免水分过度蒸发而造成生理干旱。气孔是高等陆生植物在进化中形成的关键结构, 该结构使植物体可以适应各种环境的变化^[23]。不同于青藏高原草地双子叶植物的肾形保卫细胞以及无规则型气孔器^[24], 草地单子叶植物保卫细胞除了哑铃形这种主体结构外, 还分化出半月形或近平边形的结构变式, 反映了草地单子叶植物以气孔形态的丰度来应对环境的多变, 从而增加适应环境变化的潜势, 可能是植物结构在进化上的一种适应策略。草地单子叶植物气孔器均为平列型(paracytic type), 副卫细胞呈圆顶形, 完全包围保卫细胞。从整体结构上看, 气孔器形态一致, 排列整齐, 且有副卫细胞在结构与功能上的协助, 能够较好地营建稳定的气孔微生态环境, 增强CO₂同化功能, 更有利于光能的有效利用, 可快速高效地对开阔生境的环境因子做出响应以避旱, 是一种比双子叶植物更加进化、适应性更强的气孔类型。

3.3 气孔数量特征对环境的响应与适应

植物叶形态特征对环境的响应十分敏感。海拔作为重要的环境变量, 可以通过氧分压、二氧化碳分压、空气湿度等变量间接地对植物施加影响^{[4, 22]}, 这些因素长期综合作用的结果必然导致植物内部结构发生适应性改变。Woodward^[25]对比200年前的草本植物与现在的植物, 发现气孔密度和气孔指数与CO₂浓度呈负相关关系。随海拔上升CO₂分压降低, 在低CO₂分压下, 气孔密度与气孔指数会升高, 以利于吸收CO₂^[26-27]。青藏高原海拔高、空气稀薄, 因此叶片在长期自然选择中形成较高的气孔密度, 且随着海拔的升高, SL、SD与SI均呈现上升的趋势, 从宏观数量角度解释了海拔与气孔密度之间的协变关系, 验证了海拔对叶表面特征的间接效应作用。

由于受西南季风控制, 环境相对湿润, 但生长季温度较低, 昼夜温差大, 因此低温是限制青藏高原草地植物生长的重要因子^[28]。本研究发现随生长季均温的下降, 气孔密度与气孔指数增加, 气孔长度变小。气孔数目与密度的增加, 可提高叶片与外界环境的气体交换能力^[29]。青藏高原草地单子叶植物通过气孔绝对数量与相对数量的同步增加, 增强叶片单位面积的CO₂摄入量, 提高光合速率, 保证正常生理功能得以维持；而气孔变小, 开闭调节灵活^[30], 可在一定程度上减少水分蒸发, 对高的气孔密度与气孔指数可能造成的“生理干旱”进行生态代偿。这也是植物在数量特征上对高原寒冷逆境条件下长期生存所选择的另一种适应性策略。

已有研究表明水分对叶特征具有可塑性^[31], 气孔的分布、大小、密度等受环境中水分状况的影响^[32]。青藏高原由于低温的影响, 植物的生理干旱往往为常态。本研究气孔长度与生长季降水相关系数为-0.447(P < 0.01), 表明气孔长度和干旱感知间存在明显负相关, 反映出气孔大小在干旱条件下起主要作用^[33]。随着生长季节降水的减少, 水分胁迫成为主导限制因子, 植物叶表皮气孔密度与气孔指数降低, 虽然减弱了叶片的CO₂同化能力, 但同时也可降低水分散失。植物通过这种“牺牲”光合“换取”水分优化利用的策略, 保证植物正常生命活动进行, 是草地单子叶植物对青藏高原极端气候环境长期适应的结果。

植物气孔对特定生态环境的适应机制综合且复杂, 青藏高原草地单子叶植物叶表皮结构的特异性, 是对高寒特殊综合生态环境长期作用的结果, 因此考虑各因子之间的综合效应, 建立数学回归模型, 深入探讨各生态因子之间的协同效应, 从整体上洞悉高寒环境对草地单子叶植物叶表面特征的影响具有重要意义。