干旱是影响植物生长、发育、繁殖的主要限制因素,在干旱环境中,植物的生理代谢及结构特征必定发生改变,以适应或缓解逆境而得以生存^[1]。叶片是植物体进行同化作用的主要器官,其暴露于空气中最先感应环境变化,因此叶片的形态结构对生境条件的反应最为敏锐^[2]。由于外界环境的各种不利因素首先作用于叶表面,所以叶片结构的可塑性特征可以真实体现植物对环境的适应状况^[3]。大量的研究结果表明：在干旱、强辐射等逆境条件下,植物叶片的变化主要表现在以下几个方面：(1)叶片上下表皮密被微绒毛(表皮毛或腺毛)等各种附属物^[4],有的形成较厚的绒毛层和保湿隔热层,可有效减少水分蒸发且具有较强的滞尘作用^[5]。(2)叶片气孔密度增大、面积变小^[6]、孔下室下陷明显^[7]。水分不足时,气孔可自动关闭,调节植物失水与吸水的平衡^[8-10]。(3)叶面积变小、叶片变厚,叶表皮角质层增厚^[11]。(4)叶片形状及叶肉细胞特化^[12]、叶脉输导组织发达^{[11, 13]}。(5)叶肉有结晶物,在水分充足时溶解,在水分匮乏时被析出,在一定程度可缓解了水分的匮缺^[14]。(6)叶肉组织具分泌细胞,能分泌大量的晶体及糖、蛋白、油脂等物质^[15]。上述均为不同植物叶片对逆境的适应特征,然而关于同种植物叶片对不同生境适应特征及规律方面的研究较少。植物对不同生态环境条件的适应机制存在差异,研究同种植物对不同生境的适应特征及机理对评估气候变化对植物的影响及指导生态建设恢复有重要的作用。

酸枣(Ziziphus jujuba var. spinosas)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Zizyphus Mill.)植物,原产于我国,广布于华北、西北、东北和华东的向阳山坡、荒芜丘陵和平原,从湿润的海滨到干旱的荒漠,酸枣都有分布^[11]。酸枣根系深广,抗旱、耐寒、耐贫瘠能力强,具有重要的水土保持作用,是绿化荒山的先锋树种^[16]。对该植物的研究主要分布在生物活性物质提取^[17]、药理作用探索^[18]、抗旱生理及形态特征等方面^[19-22]。然而关于酸枣叶片结构对不同生境的适应特征方面的研究较少,此外,关于酸枣叶片结构中晶体和分泌细胞方面的发现及研究尚未见报道。为此本研究选取自然梯度干旱生境中的酸枣为试材,探究酸枣叶片结构对不同生境的适应特征及规律,以期了解在全球气候变迁的背景下植物对不同生态环境的适应机理。

1 材料与方法 1.1 采样地概况

实验材料分别采自烟台(莱山区大庄村)、石家庄(赞皇县北沟村)、宁夏(银川市贺兰山附近)、新疆(吐鲁番市红星农场三队)。采样的同时采集原生境土样,测定土壤含水量。烟台的莱山区大庄村属温带海洋性季风气候,年降雨量651.9 mm,空气湿润系数为1.65,样地土壤为壤土,含水量为14%。石家庄赞皇县北沟村属暖温带半湿润季风型大陆性气候,年降雨量568 mm,空气湿润系数为1.07,样地土壤为壤土,含水量为9%。宁夏银川市贺兰山属中温带大陆性气候,年降雨量200 mm,空气湿润系数为0.50,样地土壤为沙壤土,含水量为2%左右。新疆吐鲁番市红星农场三队)属大陆性暖温带干旱荒漠气候,年降雨量15.6 mm,空气湿润系数为0.04,样地土壤为壤土,含水量为4%。样地从东到西(烟台-石家庄-宁夏-新疆)构成一个自然的梯度干旱环境(表 1)。

湿润系数是指一地降水量与蒸发量的对比关系,湿润系数越小,则该地干燥程度越明显； 各个样地的湿润系数根据当地气象部门提供的气象资料计算而得

1.2 采样方法

2010年7月,按自然气候干旱梯度,分别从烟台(莱山区大庄村)、石家庄(赞皇北沟村)、宁夏(银川贺兰山附近)、新疆(吐鲁番红星农场三队)等地依次采样。分别选取上述样地树龄5a(依据芽鳞痕判断树龄)的酸枣植株5株,选取植物顶部往下数第3个枝条、且都靠东部方向上枝条的成熟叶片10片,共选取50张叶片,摘下叶片后立即装入FAA固定液(配方：70%酒精90 mL,福尔马林5 mL,冰醋酸5 mL)中固定保存。

1.3 试验方法

材料经FAA固定24h以上,采用经改进的石蜡切片法,具体过程为：取出样品→脱水(全自动组织脱水机：LEICA TP 1020,德国)→透明(二甲苯)、浸蜡→包埋(石蜡包埋机： LEICA EG 1150H,德国)→切片(石蜡切片机：LEICA RM 2265,德国；切片厚度为10 μm)→染色(番红-固绿对染)→中性树胶封片后制成永久装片,Nikon E200 光学显微镜下观察照相^[4]。

1.4 统计分析

每个样地随机取 30 张切片拍照(5个植株,每个植株6个叶片),FSX100 OLYMPS 观察分析图像,Motic Images Plus 2.0 图像分析软件测定,然后用SPSS13.0统计软件对数据进行ANOVA方差分析和最小差异法比较(LSD_0.05)分析,SigmaPlot 10.0 软件作图,Photoshop 软件图像处理,排版。

2 结果 2.1 酸枣叶片解剖结构

酸枣叶表皮着生有表皮毛且外覆有角质层与蜡质,上表皮较厚,细胞多为长方形,体积较大,排列紧密；下表皮较薄,细胞体积较小。叶肉为全栅型,栅栏组织发达,海绵组织退化,栅栏组织排列紧密,栅栏细胞长条状,由大量的叶绿体堆叠而成,栅栏组织5—6层,从叶片正面至背面,栅栏细胞体积由大变小、由密至疏,叶肉中有晶体及大量的分泌细胞(黏液细胞)(图 1A、C)。叶脉下表皮薄壁组织发达(着色浅),上、下表皮内均有分泌细胞且下表皮处的数量多,着色较深,分泌细胞中央为木质部导管和韧皮部结构,排列紧凑整齐,在韧皮部和分泌细胞间也有晶体分布(图 1B、D)。

2.2 酸枣叶片叶面积和叶厚度

从烟台、石家庄、宁夏至新疆,随生境干旱程度加剧酸枣叶片叶面积逐渐变小,烟台的叶面积最大为515 mm²,分别是石家庄的2倍、宁夏的5倍、新疆的3倍；宁夏的叶面积最小,只有98 mm²,石家庄和新疆的分别为246、145 mm²,且各样地间差异显著(图 2)。叶片厚度逐渐增加,烟台的叶片厚度最小,为164 μm,石家庄与烟台的相近为171 μm,宁夏和新疆的叶片厚度相差不大,分别为200 μm和211 μm,与烟台相比,石家庄、宁夏、新疆等地的叶片厚度分别显著增加了4%、22%、29%(图 3,P＜0.05)。

2.3 叶片角质层,表皮细胞长径和短径

从烟台至新疆随生境干旱程度加剧,叶片角质层厚度逐渐增加,且上角质层厚度大于下角质层,烟台叶片的上、下角质层厚度均最小,分别为2.6 μm和1.9 μm；与烟台相比,石家庄、宁夏、新疆的叶片上、下角质层厚度分别增加了6%和3%,29%和41%,37%和48%,宁夏、新疆叶片的角质层厚度增加与烟台和石家庄的相比差异显著(图 4,P＜0.05)。4个样地中植株叶片上、下表皮细胞长径和短径总体呈逐渐增加的趋势,宁夏地区的叶片表皮细胞体积最大,上表皮达到28 μm×18 μm,下表皮为19 μm×16 μm；与宁夏酸枣相比,新疆地区的叶片表皮细胞体积逐渐降低,但下表皮细胞长径仍高于烟台,而短径是4个地方中最小的,与烟台、石家庄叶片相比,宁夏和新疆样地叶片的表皮细胞直径变化显著(图 5,P＜0.05)。

2.4 叶片栅栏组织的变化

从烟台至新疆,随干旱梯度的增加叶片各层栅栏组织细胞的长径逐渐增加,烟台、石家庄酸枣叶片的栅栏组织细胞长径从上表皮向下表皮方向逐渐减小,而宁夏和新疆叶片靠近下表皮的栅栏细胞长径逐渐增加。新疆酸枣叶片的栅栏组织最特别,栅栏细胞呈长柱状,排列密集,栅栏细胞由许多小颗粒叶绿体堆积而成,叶片呈全栅型的趋势更明显(图 6)。栅栏组织总厚度依次增大,烟台叶片的栅栏组织厚度最小,为115 μm,与烟台相比,石家庄、宁夏、新疆叶片的栅栏组织厚度分别增加了1%、26%、34%,其中新疆叶片栅栏组织的厚度最大为154 μm(图 7),栅栏组织密度和厚度在烟台和石家庄生境中变化差异不显著,而随干旱加剧与宁夏、新疆等生境相比差异显著(P＜0.05)。栅栏组织密度以100 μm中第1层栅栏组织细胞的个数表示,是反映栅栏组织排列紧密度的指标,从而反应保水能力；从烟台至新疆随干旱加剧,栅栏组织密度逐渐增大,第1层栅栏细胞的短径逐渐变小、密度更大,烟台和石家庄的栅栏组织密度平均为15个/100 μm,第1层栅栏细胞的短径均为6 μm左右,宁夏和新疆叶片栅栏组织密度为19个/100 μm,第一层栅栏细胞的短径均为5μm左右(图 8)。此外,栅栏组织层数逐渐减少,各层栅栏组织细胞长径显著增大(P＜0.05)。烟台酸枣叶片的栅栏组织层数以6层常见,占80%以上,也有5层、7层的,占8%—12%左右；石家庄的以5层居多,占85%左右,6层的占15%左右、7层的占3%左右,宁夏、新疆叶片的栅栏组织几乎都是5层(图 9)。

2.5 叶脉显微结构

叶脉上表皮有表皮毛着生,上表皮细胞厚而大,下表皮细胞小而窄,表皮细胞下方为薄壁组织,有多层圆球形薄壁细胞组成,细胞体积较大；下表皮薄壁组织发达,厚于上表皮,薄壁组织中通常有分泌细胞；叶脉中间有一层或几层体积较小的细胞排列成环形的结构为中脉维管束,维管束外由薄壁组织组成的维管束鞘包裹,在维管束周围有大量是的分泌细胞,体积较大,染色深；维管束鞘以内为木质部和韧皮部,木质部已分化出导管,纵向排列成行,各列之间被木薄壁细胞隔开,韧皮部位于木质部的下方,由体积较小的韧皮细胞排列而成,韧皮部中分布有大量的晶体及分泌细胞(图 10,图 11)。

薄壁细胞具有光合、分泌、储藏等功能,叶脉处薄壁细胞的相对厚度用上表皮薄壁细胞厚度/下表皮薄壁细胞厚度来表示,反映薄壁组织的发达程度、分布状况,从而体现其功能特征。从烟台至新疆,随干旱加剧叶脉处下表皮薄壁组织比上表皮薄壁组织发达,薄壁细胞层数多且细胞体积大(图 10Y、S、N、X),薄壁细胞相对厚度依次减小,表明从烟台至新疆,随叶面积的减小,叶片厚度的增加,叶脉处上表皮薄壁组织逐渐减少,下表皮薄壁组织逐渐增多。

中脉维管束层数逐渐增多,烟台和石家庄的分别为4层,宁夏和新疆的为5层；维管束鞘细胞的层数以石家庄叶片的最多为4层,烟台的最少为2层,宁夏和新疆的为3层(图 12),相应的的维管束鞘细胞厚度以石家庄的最大,达到50 μm,其次宁夏、烟台,分别为40、32 μm,新疆的厚度最小只有28 μm,表明烟台和宁夏酸枣叶片的维管束鞘细胞体积大于新疆的(P＜0.05)(图 13)。

叶脉中木质部导管直径呈增大的趋势,烟台的导管直径最小为12.6 μm,与烟台相比,石家庄、宁夏、新疆的分别增加了0.3%、6.7%、10.9%,但各样地间差异不显著(图 14,P>0.05)。从烟台至新疆,随干旱加剧酸枣叶片叶脉韧皮部中晶体数逐渐增多,烟台、石家庄的平均为7和8个,变化不显著；而宁夏和新疆的分别为11和12个,与烟台和石家庄相比差异显著,表明叶片中晶体数量与植株的抗旱性存在相关性(图 15,P＜0.05)。

3 讨论

叶片是植物暴露于环境中面积最大、对环境气候感知最敏感、感应逆境而发生形态结构改变最明显的器官^[2]。酸枣在我国分布极广,但其均生长于荒岭峭壁、向阳山坡等较为干旱的环境中。从烟台—石家庄—宁夏—新疆4个采样地的土壤含水量、年降雨量及湿润系数来看,其形成一个大尺度的自然梯度干旱环境(表 1),酸枣植株长期生存于不同的干旱生境中,其叶片在解剖结构上的可塑性必定演化出特定的适应特征。本研究结果表明酸枣叶为异面叶,叶片为全栅型,海绵组织退化,全栅型的叶片含有的叶绿体较多,可提高光合作用^[23]；上、下表皮都覆盖有角质和蜡质,且着生有表皮毛,叶表皮表皮毛和厚的角质层可以有效防止水分蒸腾,此外,坚硬的角质层除具有保水作用外,还具有机械支撑作用,使植株在水分缺乏时不会立即萎蔫^[24]；叶肉及叶脉处分布有数量较多的分泌细胞和晶体,晶体和分泌细胞都能增加叶片的机械性能,减轻重金属对细胞的毒害作用,且具有水分储藏功能,可进一步增强抗旱性^[11]。以上这些特征都是典型旱生特征。

不同生境中,酸枣叶片可塑性表现出特定的变化规律。从烟台至新疆,随各生境干旱程度加剧,酸枣叶片叶面积逐渐变小,叶片及角质层厚度增加,叶片栅栏组织层数减少,叶脉导管管径增大,分泌细胞及晶体数增多,这些特征都是酸枣植株应对不同干旱生境自身所演化出的一系列适应策略。宁夏、新疆等地区降雨少、风沙大,该生境中酸枣叶片趋于小而厚发展,小而厚的叶片可减少水分散失面积,加强叶片机械性能,防止风沙对叶片的损伤；此外加厚的角质层可进一步减少水分蒸发、增强叶片保水性,有利于植株适应宁夏、新疆等干旱严重、降雨少的环境。叶片形状和叶表皮微形态的变化是沙生、盐生及旱生植物应对逆境所表现出的共同特征^{[7, 12-13]}。有些沙生植物的叶片可进一步缩小为同化枝或者叶刺,增加保水性能,但其光合能力亦受影响。

植物应对干旱胁迫的策略既有相似之处也有各异之别,在叶片功能上主要向着增强保水性、降低蒸腾速率和提高光合速率等方面发展^[25]；在叶片形态上表现为叶片变小、变厚,蜡质、茸毛等覆盖物的增加；在解剖结构上表现为表皮细胞角质层增厚,形状向扁平发展以减少水分散失,同时栅栏组织增厚且细胞呈细长状排列紧密,海绵组织变小等^[26]。酸枣植物在应对不同干旱生境时其独特的变化在于叶片栅栏组织层数逐渐减少,海绵组织完全退化。栅栏组织层数减少有助于叶片变小增厚；栅栏组织密度和每层栅栏组织长径增加(图 9),异面叶的程度加强。栅栏组织由众多叶绿体堆积而成,酸枣等旱生植物的叶片向着提高光合效能方面发展,高度发达的栅栏组织既可避免宁夏、新疆等地区强烈光照对叶肉细胞的灼伤,又可有效的利用衍射光进行光合作用^[27]。栅栏组织越厚、排列越紧密,植物利用光能的效率越高、保水抗旱性越好^[12]。赵小仙^[12]、康冬冬^[22]等对其它沙生、旱生植物叶片解剖结构研究后也有相似的结果,然而酸枣叶片在栅栏组织长度和层数上的变化更加显著,表明栅栏组织在干旱逆境中的可塑性较高,提高酸枣适应不同干旱生境的能力。

此外,酸枣叶片的叶肉及叶脉中有晶体及大量的分泌细胞(黏液细胞),这在酸枣植物的研究中为首次发现报导,且随干旱加剧,晶体及分泌细胞数量增多,叶脉导管管径增大。目前普遍认为晶体和黏液细胞是荒漠植物抗旱结构特征之一,晶体和黏液细胞具有较高的渗透势,吸水能力强,在外界环境条件适宜、植物水分输导良好时,晶体可以吸收并贮存水分呈溶解状态；当外界环境干旱、导管中水分输导受阻而不能正常满足植物需水时,晶体呈析出状态而释放水分,为其周边细胞提供一个较为湿润的小环境,从而提高植物的抗旱性^[14]。这与本研究的结果相印证,即在越干旱的生境中酸枣叶片中晶体的数量越多(图 15),晶体与植物应对逆境密切相关。此外还有研究表明晶体的存在一方面可加强叶片的机械性能,另一方面可避免重金属离子对细胞的毒害作用、改变细胞的渗透势、提高吸水和保水能力^[28]。导管是植物输送水分和无机盐的重要通道,叶脉导管管径增大有利于提高输水效率和水分利用率,使植物在宁夏、新疆等有限的水资源环境中维持正常的生理代谢；虽然导管管径在4个梯度干旱生境中差异不显著,但亦表现出增加的趋势,表明其正在随环境的改变而发生协同进化。

在对酸枣叶片可塑性的研究可知,叶面积、叶片厚度、角质层及叶肉组织(栅栏组织、晶体、分泌细胞等)应对环境变化的可塑性较大,因其直接感应环境变化而在不同的生境中易发生改变而适应环境；而输导组织(导管直径等)发生变异的可塑性较小,究其原因可能为在越干旱的生境,植物的主要任务是如何获得水分得以生存,因此其率先发展根系,以便发达的根系可扎入深层土壤获取地下水分^[29],而疏导组织的提高次之。由此可知,酸枣叶片结构可塑性的变化是其对不同生境的长期适应特征。