生物土壤结皮(BSCs)是由微细菌、真菌、藻类、地衣、苔藓等隐花植物及其菌丝、分泌物等与土壤砂砾粘结形成的复合物，在干旱、半干旱以及极地、亚极地区等脆弱生态区域广泛分布^[1]。生物土壤结皮细菌、真菌、地衣和苔藓植物的地下菌丝和假根能够黏结沙粒^[2]，能有效地减小风和水对土壤地表的侵蚀，更重要的是生物土壤结皮积极参与C、N的生物地球化学循环^[1-4]、水分循环^[2]、保持表层土壤的稳定性^[5]以及影响种子库^[6]等，在维持干旱、半干旱区域生态系统的稳定中扮演重要角色^{[2, 7]}。生物土壤结皮中还生存着大量的土壤微生物，如真菌、细菌、原生动物和线虫等^[7-9]。

铜尾矿是铜矿选矿过程中产生的粉末状矿业废弃物，表层尾矿在风和水的作用下移动性较强，表面稳定性差，且表面易于发生干旱。生物土壤结皮中的苔藓等是自然演替过程中常见的先锋植物，能改善环境条件有利于维管植物的发育^[2]，从而有利于尾矿的稳定。野外调查发现，在弃置的铜尾矿废弃地自然生态恢复过程中，尾矿废弃地的表面也形成大量的生物结皮，且可以划分为3种类型，即藻类结皮、藓类-藻类混合结皮和藓类结皮，其中的藓类主要是黄色真藓(Bryum pallenscens)。这是由于铜尾矿废弃地中的生物土壤结皮发育和分布特征不同于干旱和半干旱土壤的生物土壤结皮，在稳定的铜尾矿裸地中先有藻类生长，然后苔藓植物侵入形成藓-藻结合结皮，随着演替的进行藓类结皮成为生物土壤结皮主要成分。这些生物土壤结皮为维管植物群落的形成发展提供了良好的场所，即使维管植物群落形成之后，在植物群落的斑块状空隙处及维管植物之下仍存在大量的生物土壤结皮。在尾矿中，生物土壤结皮不仅能改善尾矿表层的风力侵蚀^{[2, 5]}，也可以有效地改善尾矿中的养分含量^[2-4]，是尾矿中重要的碳氮来源为微生物提供营养和能量来源^{[3-4, 10-11]}。研究表明这些生物土壤结皮中生活着大量的蓝细菌及固氮微生物^[10-11]，能够有效改善表层尾矿的养分状况^[12]。

作为生物土壤结皮的重要组成部分，真菌的菌丝把表层土壤和其它成分粘连成一个稳定整体，使土壤表现出一定的抗风蚀能力和持水能力^[8]。对于表层疏松的尾矿废弃地而言，稳定的表层有利于植物的定居和植被的自然恢复。迄今为止，关于尾矿废弃地表面自然生长的生物土壤结皮中微生物群落结构及其多样性鲜有报道^[10]，本研究以生长在铜尾矿废弃地表面的生物土壤结皮为对象，通过分子生物学方法研究来自不同维管植物群落以及不同演替阶段的生物土壤结皮中的真菌多样性及其群落结构的变化，进一步探讨不同植物群落以及演替过程对生物土壤结皮真菌群落结构的影响。

1 材料与方法 1.1 研究区概况

铜陵地处长江中下游南岸, 属亚热带季风气候，年平均气温16.2℃，夏季平均气温27.4 ℃，无霜期平均为230 d，年平均降水量1390 mm，年平均湿度为75%—81%。本研究选取生长在铜陵杨山冲(30°54′N, 1I7°53′E)铜尾矿废弃地上的生物土壤结皮。杨山冲尾矿矿废弃地堆存尾矿1308万t，库区面积22 hm²，库区汇水面积0.54 km²，该尾矿废弃地1991年弃置停用后开始自然生态恢复过程，目前自然生长的主要维管植物群落包括白茅(Imperata cylindrica)、中华结缕草(Zoysia sinica)、木贼(Hppochaete ramosissimum), 藓-藻结合结皮零星地分布在这些植物群落下及植物群落间的空地上，藓类结皮主要分布在尾矿裸地上。

1.2 样品采集与预处理

本研究于2010年4月从杨山冲尾矿库采集5种类型的生物土壤结皮，分别是白茅群落(YB)、中华结缕草群落(YJ)和木贼群落下(YM)的藓-藻混合结皮，藻类结皮(YX)和作为对照的无植物生长的裸地尾矿(YL)。每种样品采集4个平行样，将4个采样点所采集样本分别装入密封袋，做好标记，将其放入冰盒内，用于真菌多样性研究。在各生物土壤结皮采样处，同时采集紧贴生物土壤结皮下层的尾矿，每处采集的尾矿样本分别装入密封袋，放入冰盒内，带回实验室后用于尾矿理化性质的测定。

1.3 化学性质分析

有机质含量采用烧失量法((550±5) ℃，6 h) 测定，pH值用酸度计(pHS-3C型精密pH计，上海雷磁仪器厂)测定(W_尾矿:V_水=1 g:5 mL), 总氮采用开氏定氮法测定，有效态磷采用钼蓝比色法测定^[13]。

1.4 DNA提取

称取0.5g生物土壤结皮样本用1×TE洗涤样本2遍去除腐殖质、色素、盐离子等并参照Zhou^[14]的提取方法提取基因组总DNA。

1.5 PCR扩增与酶切

真菌PCR扩增使用18S rRNA通用引物，F:5′-GGA GGA TTA GGG TCC GAT TCC-3′；R:5′-CTT CCG TCA ATT CCT TTA AG-3′。用DNA纯化试剂盒对扩增的PCR产物进行胶回收纯化(等量混合同一植物群落的4个平行样品的PCR产物)，将已纯化的PCR产物与pEASY-T3-Vector连接并转入E.coli DH5a感受态细胞。细胞在含有X-Gal和IPTG并混有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上37℃培养12h。利用蓝白筛选和Amp抗性筛选阳性克隆，挑取阳性单菌落于LB液体培养基中37℃水浴振荡培养4—6 h，以菌液作为模板以M13-F、M13-R为引物做PCR扩增。M13-F：5′-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3′；M13-R:5′-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3′。分别选用限制性内切酶Hha I和Msp I对M13扩增产物进行酶切消化，用2.0%的琼脂糖凝胶电泳对酶切片段进行分离检测, 根据酶切图谱对克隆子进行分型。每一个基因型可以作为一个分类操作单位(Operational Taxonomic Unit，OTU)选择具有代表性的菌液进行测序。研究中将所有获得的序列构建系统发育树，剔除非真菌的序列并将真菌的18S rRNA基因序列提交到NCBI，获得登录号为KT285715-KT285801。

1.6 数据分析

以Shannon-Wiener指数和Simpson指数来计算真菌物种多样性，以Pielou指数计算真菌物种的均匀度。采用SPSS 19.0进行理化数据以及Pearson相关性分析，用One way ANOVA (Duncan检验) 进行多重比较(P < 0.05)比对。使用MEGA 4.0进行系统发育树的构建。利用Mothur(1.31.2)计算不同OTUs的相似度，以相似度为0.97构建OTU矩阵。利用R语言(R 3.2)基于OTU矩阵计算Bray-Curtis距离矩阵并进一步做非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)。在R语言环境中使用典范相关分析(canonical correlation analysis，CCA)鉴定影响真菌群落结构的主要影响因素，并用蒙特卡洛检验分析环境因子与真菌群落结构的相关性。

2 结果与分析 2.1 生物土壤结皮中真菌多样性及结构变化

不同植物群落以及不同演替阶段下的5种类型生物土壤结皮中真菌多样性指数的变化如表 1所示，从表 1可以看出，白茅群落下结皮和真藓结皮中总的克隆数远低于结缕草群落中结皮和裸地，尽管木贼群落中的结皮具有较高的克隆数，但其OTUs在5个样本中是最低的。Shannon-Wiener、Simpson、Pielou指数以及稀释曲线(图 1)均表明，在5个样本中生长在木贼群落中的生物土壤结皮和裸地处较低。这些结果表明生长在不同植物群落中以及不同演替阶段的生物土壤结皮中真菌多样性及均匀度存在差异。

系统发育树(图 2，图 3)显示在门、优势纲和优势目3个分类水平上5个生物土壤结皮样本中真菌群落结构均存在差异。在所分析的5个生物土壤结皮样本中，共检测出隶属于3个门的真菌(即子囊菌门(Ascomycota)(图 2)、担子菌门(Basidiomycota)和壶菌门(Chytridiomycota)(图 3))。在子囊菌门和担子菌门中共检测出8个纲，包括子囊菌门的座囊菌纲(Dothideomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、盘菌纲(Pezizomycetes)、酵母纲(Saccharomycetes)和外囊菌纲(Taphrinomycetes)等5纲以及担子菌门的伞菌纲(Agaricomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)和微球黑粉菌纲(Microbotryomycetes)等3纲。在8个纲中，相对丰度较高的优势纲主要包括担子菌门的伞菌纲、银耳纲(图 3)和子囊菌门的座囊菌纲、散囊菌纲(图 2)，这4个纲占总检测出真菌的比例均超过90%，其中生活在木贼群落生物土壤结皮中的真菌仅隶属于3个纲，即座囊菌纲、散囊菌纲和伞菌纲。在研究的5个样本中，裸地处和结缕草群落下的生物土壤结皮中拥有较高丰度的座囊菌纲和较低丰度的散囊菌纲，而裸地处和藓类结皮中伞菌纲和银耳纲相对丰度低于其他其他3个生物土壤结皮样本。盘囊菌纲仅在白茅群落下的生物土壤结皮以及藓类结皮中以较低的相对丰度存在，而酵母纲和外囊菌纲也仅分别在裸地处和结缕草群落下的生物土壤结皮中以较低的相对丰度存在。基于纲的水平，5个样本在真菌群落组成方面存在很大的差异，这一结果表明植物群落对生物土壤结皮中真菌群落种类组成的影响是非常显著的。5个样本不仅在优势门和优势纲的水平上存在显著差异，在子囊菌门优势目水平上也表现出显著的差异。在裸地和白茅群落、结缕草群落下的生物土壤结皮中有3个优势目，其相对丰度均表现为座囊菌目(Dothideales)>格孢菌目(Pleosporales)>刺盾炱目(Chaetothyriales)；而在藓类结皮和木贼群落下的生物土壤结皮中仅有格孢菌目和刺盾炱目两个优势目，且前者的相对丰度显著高于后者。

通过与GenBank比对，在5个样本所检测出的系列中，隶属于子囊菌门和单子菌门的真菌分别有17属和12属。其中在至少某一样本中相对丰度大于5%的优势属分别为9属和5属。具有较低的相对丰度、并仅在于某一或某两个样本中的属，主要包括子囊菌门的Taphrina、Lamprospora、Cochliobolus、Candida、Bimuria、Aspergillus等和单子菌门的Sphacelotheca、Rhodotorula、Rhodosporidium、Hyphodontia、Fellomyces、Cyphellostereum等。从系统发育树中可以看出，5个样本在属的水平上仍然存在着显著的差异。在14个优势属中，只有单子菌门的Rickenella属在5个样本中均有分布，仅在某一样本具有较高相对丰度的属包括Phaeosphaeria、Leptosphaeria、Alternaria、Collybia和Trichosporon。其中，Leptosphaeria、Collybia和Trichosporon仅在白茅群落下的生物土壤结皮中占优势，而Phaeosphaeria和Alternaria仅分别在木贼群落下的生物土壤结皮以及藓类结皮中占优势。

2.2 生物土壤结皮的化学性质变化

研究区域生物土壤结皮基本化学性质如表 2所示。从表 2可以看出，生物土壤结皮基本表现出微碱性；不同生物土壤结皮中的烧失量、总氮和有效磷含量表现出一定的差异，生长在植物群落下的生物土壤结皮和苔藓生物土壤结皮中的烧失量、总氮和有效磷含量高于裸地处。不同区域的生物土壤结皮在有效态Cu和Zn含量上无差异，但生长在白茅群落中的生物结皮中(YB)有效态Pb含量显著高于裸地处(YL)。生长在铜尾矿废弃地表面的生物土壤结皮中较高是有效态Cu、Zn和Pb主要与尾矿本身含有较高的重金属有关。

2.3 影响生物土壤结皮中真菌多样性及结构的因素

NMDS图(图 4)显示不同植物群落与演替阶段均对真菌的群落结构产生影响，其中不同植物群落下真菌群落结构随着轴2分离，不同的演替阶段下真菌群落结构沿着轴1发生变化。通过CCA分析(图 5)发现这种真菌群落结构变化并不是主要由尾矿的基质化学性质影响的，同时真菌群落多样性指数与化学性质均无显著的相关性(表 3)。

3 讨论

在所分析的5个生物土壤结皮样本中，共检测出隶属于3个门的真菌(即子囊菌门、担子菌门和壶菌门)，而构成沙漠生物结皮的其他门类真菌(如接合菌门Zygomycota)^[15]未被检出，也许与DNA提取或PCR扩增所用的引物偏好性有关^[8]。在检出的真菌中，子囊菌门真菌在所有样本中均占优势(55.12%—87.73%)，其次为担子菌门(12.27%—43.86%)，壶菌门相对丰度最低(≤1.02%)，这一结果与在其他干旱、半干旱区域得到的结果基本一致^{[8, 16-17]}，但与安曼、北美和以色列沙漠生物结皮中的研究结果有所不同。毛乌素沙漠的生物结皮中子囊菌门仅占了全部真菌总数的58%^[8]，而在安曼、北美及以色列沙漠生物结皮中子囊菌所占的比例均在90%以上^[18-20]。赵宇龙等^[8]认为土生物壤结皮中子囊菌门所占比例的差异这可能与地理位置，环境因素和发育阶段等因素有关。另一方面，不同生物土壤结皮中真菌群落结构的差异可能与不同结皮所形成的微环境有关^{[16, 19]}。Abed等^[18]发现在安曼的沙漠生物结皮中格孢菌目占绝对优势。而本研究中，生长于木贼群落下的结皮和藓类结皮中黄色真藓(Bryum pallescens)在结皮中的相对丰度明显高于而其他3种类型的结皮，而藻类在结皮中的相对盖度则表现相反，Abed等^[18]的研究发现以蓝细菌占优势的结皮与以地衣占优势的结皮在真菌群落结构方面存在显著差异。

从优势属的层面通过与GenBank比对，在5个样本所检测出的系列中，隶属于子囊菌门和单子菌门的真菌分别有17属和12属，在属的水平本研究中真菌的多样性低于Negev沙漠的49属^[15]和安曼沙漠生物土壤结皮中的44属^[18]。尽管本研究中的某些优势属(如Coniosporium、Phaeosphaeria、Alternaria、Phoma和Cryptococcus等)在沙漠生物土壤结皮中也广泛分布，但在沙漠生物土壤结皮中占优势的Chaetomium、Penicillium、Ulocladium、Fusarium等属^{[8, 15, 17-18]}在本研究中并未检测出；而本研究中的优势属如子囊菌门的Discosphaerina和单子菌门的Rickenella、Globulicium和Trichosporon等在沙漠生物土壤结皮中未检出或并不占优势。Grishkan等^[15]发现Phoma属的物种仅在某些湿度较高区域的生物土壤结皮中占优势，而本研究中地势较洼、含水量较高的木贼群落下的生物土壤结皮中Phoma属的物种的相对丰度反而低于含水量较低的裸地处(图 1)，另外在毛乌素沙漠的生物土壤结皮中利用分子生物学手段并未检测出该属^[8]。研究发现Aureobasidium属在以蓝细菌占优势的生物土壤结皮中占优势^[18]，本研究中该属也是在结缕草群落和裸地处以蓝细菌为主的藻类结皮中占优势。

早期对铜尾矿废弃地上生物土壤结皮的研究表明^{[12, 21]}植物群落能提高尾矿中的有机物质和营养物质，但与干旱、半干旱区域的生物土壤结皮相比，本研究中生物土壤结皮中的总氮含量低于生长在沙漠中表层土壤^[22]，这也表明所研究铜尾矿废弃地在氮素含量方面仍表现非常贫瘠。本研究并没有显示出真菌群落多样性和结构与所检测样本的化学性质的相关性，显然植物构建后化学因素的微量改善可能并不是造成生物土壤结皮中真菌群落结构改变的主要因素。尽管有研究表明土壤中C以及以及C/N比率能够影响真菌组成^[23]，但本研究中营养贫瘠的裸地处真菌多样性比生长在营养较为丰富的木贼群落下生物土壤结皮中具有更高的生物多样性。裸地中较高的真菌多样性表明裸地中所含有的少量养分能够满足这些真菌的需求^[16]，白茅、中华结缕草和木贼3种维管植物群落下生物土壤结皮中真菌多样性的差异，表明了植物群落类型对生物土壤结皮真菌多样性的影响是非常显著的。研究表明，来自植物的凋落物及其分解产物能够影响生物土壤结皮中真菌的结构和多样性^[17]，同时不同植物群落所形成的不同的环境条件(微生境)也会影响生物土壤结皮中真菌的结构和多样性^[16]。另一方面，生物土壤结皮的演替过程也是造成真菌群落结构改变的又一因素。不同演替阶段的生物土壤结皮对尾矿的土壤发生过程起到不一样的作用，例如藻类结皮能向体外分泌以多糖为主的物质^[24]能够促进真菌的生长，死亡的藻体也能够给真菌生长提供有机物质，而苔藓结皮的形成也进一步地加速了尾矿风化的速度并累积风尘物质包括植物的一些必要元素包括P、K等^[24]，这些都可能是改变生物土壤结皮的重要因素。因此本研究中不同样本真菌群落结构和多样性的差异可能受维管植物群落类型、微地形、结皮类型(藻类结皮、藓类-藻类混合结皮和藓类结皮)以及基本理化性质等多重影响。

4 结论

生活于铜陵铜尾矿表面的生物土壤结皮中的真菌主要隶属于子囊菌门和担子菌门，子囊菌门占绝对优势；不同样本真菌群落结构在门、纲、目以及属的水平存在显著差异；生物土壤结皮中真菌群落的结构与多样性与基质化学性质之间无显著的相关性；生物土壤结皮中真菌群落结构和多样性的差异与维管植物群落类型以及演替阶段不同的生物土壤结皮的类型有关。