植物内生真菌的研究已有100多年的历史,早期主要集中在对热带地区的经济植物内生真菌的种类组成和生态分布特征的研究^[1-4],后来涉及的地区、植物种类、组织部位、生长季节等都有了较大的扩展^[5-6]。近年来,主要集中在植物内生真菌代谢产物的种类和结构方面的研究^[7-9],同时,对植物内生真菌在促进宿主植物生长、增加产量、增强宿主抗逆性、改善微生态环境方面进行了较多的研究^[10-14]。对古老或特有植物种类内生真菌的研究报道明显较少,对附生植物表面和内生植物中的真菌菌群的组成和相互关系的研究未见报道。青檀Pteroceltis tatarinowii是我国特有的第三纪孑遗植物^[15],青檀作为一种古老的植物在长期的进化过程中与其叶片内生和附生真菌菌群可能已经形成了较好的、稳定的适应关系^[16],所以本研究选择野生健康的青檀植物上部和下部,向阳和向阴等不同部位的叶片进行内生和附生真菌的分离研究,以了解青檀叶片内生和附生真菌的组成特点,并探讨内生和附生真菌菌群之间的可能联系,以期为研究真菌资源多样性、植物附生和内生真菌的相互演化关系及真菌与宿主植物协同进化等提供有益的参考资料。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 植物样本

夏季(8月),在安徽琅琊山自然保护区内选择10棵树龄一致的多年生野生健康青檀植株,每株分别从上部、下部、向阳和向阴各部位选取当年生的健康叶片10个。样品放置于已灭菌的培养皿中,密封,详细编号,冰箱4℃保存,24h内完成分离实验。

1.1.2 培养基

分离培养基：配制和制作过程参照参考文献^[16]。保藏培养基：PDA培养基,即马铃薯葡萄糖琼脂培养基,马铃薯 200g(煮汁)、葡萄糖 20g、琼脂15—18g、加水定容1000mL、pH 自然。

1.2 方法 1.2.1 附生和内生真菌的分离

青檀叶片附生和内生真菌的分离主要参照参考文献^[16],并根据实际做了一些修改。用无菌剪刀把叶片剪成适当大小,无菌水冲洗5次,混匀该无菌水冲洗液,涂布平板进行叶片附生真菌的分离培养。同时,做空白对照。将上述无菌水冲洗后的叶片在2%的次氯酸钠中消毒1min;用无菌水冲洗2次,转入75%的乙醇中浸泡1min;用无菌水清洗5次,晾干,用无菌剪刀将叶片剪成2mm×2mm大小的组织小块,接种到分离培养基上。同时,做空白对照。在(25±1)℃恒温培养箱中培养,并每天观察记录生长状况,用接种针及时挑取边缘菌丝转接到PDA平板上继续培养,纯化2—3次后得到单一菌种。

1.2.2 内生和附生真菌的鉴定

采取形态分类鉴定法进行菌株鉴定,对未产孢的种类采取低温、干燥(降低湿度)、紫外线照射和降低营养供给等方法诱导和刺激产孢。分类主要依据Barnett和Hunter和Sutton的分类系统^[17-18]。同时,参照其它有关真菌鉴定工具书进行鉴定^[19-20]。

1.2.3 数据分析

分离频率：某一指定类型真菌的菌株数量占分离培养的内生和附生真菌菌株数量的百分率,用于比较和判断优势菌群。

Shannon-Wiener 多样性指数$H'=-\sum\limits_{i=1}^{s'}{{{P}_{i}}\ln {{P}_{i}}}$,式中P_i是第i 种的比例多度,给定为：${{P}_{i}}=\frac{{{N}_{i}}}{N}$;式中N_i为第i种物种个体数,i=1,2,3,4,…,S。Margalef 丰富度指数：$R=\frac{\left( S-1 \right)}{{{\log }_{2}}\left( N \right)}$, 式中S为物种数;N 为个体总数。

Shannon-Wiener 指数(H′)和 Margalef 指数(R)被用于分析青檀叶片内生和附生真菌的菌群多样性。

均匀度指数：$E=\frac{H'}{\ln \left( S \right)}$ ,式中H′为 Shannon-Wiener 指数,S为物种数,用于分析菌群在青檀叶片内生和附生分布的均匀程度。

Sorenson 相似性指数：${{C}_{s}}=\frac{2j}{\left( a+b \right)}$,式中j为两个上部、下部、阴面、阳面共有青檀叶片内生或附生真菌菌群属数;a是一个上部、下部、阴面、阳面的青檀叶片内生或附生真菌菌群的属数,b是另一个上部、下部、阴面、阳面的青檀叶片内生或附生真菌的属数,用于比较两个上部、下部、阴面、阳面之间的青檀叶片内生和附生真菌菌群组成的相似程度。

利用软件spss16.0分析青檀叶片内生和附生真菌菌群的组成差异。

2 结果与分析 2.1 青檀叶片内生和附生真菌菌群组成分析

从青檀叶片共分离可培养内生真菌839株,附生真菌1857株,共计2696株,鉴定结果显示其分属于4目,5科,43属(表 1)。子囊菌的无性型(丝孢类无性型真菌和腔孢类无性型真菌)在青檀叶片内生和附生真菌分离的菌群中占据绝对优势,分别达到94.64%和97.41%。在目的分类水平上,青檀叶片内生和附生真菌均以丛梗孢目Moniliales为优势菌群,分别占90.23%和 92.51%;在科的水平上,内生真菌以暗梗孢科 Dematiaceae和丛梗孢科Moniliaceae为优势菌群,分别占47.56%和42.67%,附生真菌以丛梗孢科Moniliaceae 和暗梗孢科 Dematiaceae为优势菌群,分别占67.04%和25.47;在属的水平上,内生真菌以黑团孢属Periconia和青霉属Penicillium为优势菌群,分别占31.47%和10.73%,附生真菌以小球霉属Glomerularia、膝葡孢属Gonatobotrys和青霉属Penicillium为优势菌群,分别占20.03%、13.95%和12.22%(表 1)。

青檀叶片内生和附生真菌菌群组成既有共性,又存在一定差异。内生真菌和附生真菌均存在的菌群数量达到23属,占到53.49%,分别为青霉属Penicillium、曲霉属Aspergillus、地霉属Geotrichum、膝葡孢属Gonatobotrys、链霉属Streptomyces、小球霉属Glomerularia、拟青霉属Paecilomyces、树粉孢属Oidiodendron、木霉属Trichoderma、交链孢属Alternaria、色串孢属Torula、黑团孢属Periconia、刀孢属Clasterosporium、多隔头状孢属Phragmocephala、内隔孢属Endophragmia、小叶点孢属Stigmella、无柄霉属Acaulopage、旋梗霉属Spiromyces、共头霉属Syncephalastrum、笄霉属Choanephora、拟茎点霉属Phomopsis、盘长孢属Gloeosporium和盘二孢属Marssonina,共分离菌株2557株,占94.84%。青檀叶片内生真菌特有的属有6个,共分离19株,占0.70%,分别为头珠霉属Oedocephalum、孔球孢属Gilmaniella、皮思霉属Pithomyces、毛格孢属Trichaegum、刺盘孢属Colletotrichum和痂圆孢属Sphaceloma。附生真菌特有的属有14个,共分离120株,占4.45%,其分别为假丝酵母属Candida、葡萄孢属Botrytis、麦穗霉属Tritirachium、单端孢属Trichothecium、原叶孢属Thallospora、总葡萄孢属Basidiobotrys、毛轴霉属Chaetopsis、离蠕孢属Bipolaris、弯孢菌属Menispora、暗双孢属Cordana、波梗霉属Polythrincium、旋体霉属Cochlonema、蒲头霉属Mycotypha和梗虫霉属Stylopage。 通过Fisher′s exact test分析显示青檀叶片内生和附生真菌菌群组成无明显差异(P=0.072﹥0.05),这可能暗示着青檀叶片内生和附生真菌菌群之间存在着密切的演化关系。

2.2 不同部位青檀叶片内生和附生真菌菌群组成分析

由表 2可以看出：青檀不同部位叶片的内生和附生真菌均同时具有的菌群有青霉属Penicillium、曲霉属Aspergillus、膝葡孢属Gonatobotrys、拟青霉属Paecilomyces、木霉属Trichoderma、交链孢属Alternaria、黑团孢属Periconia、多隔头状孢属Phragmocephala和内隔孢属Endophragmia共9个属。青檀叶片内生真菌和附生真菌均是以向阳面的样品分离培养的菌株数量最多,分别达到495株和1382株,占58.88%和74.42%,以阴面样品分离培养的菌株数量为最少,分别为344株和475株,分别占41%和25.58%。

向阳向阴样品分离的内生真菌和附生真菌的优势菌群(IF≥5%)组成存在一定差异。向阳内生真菌优势属为黑团孢属Periconia (20.5%)、木霉属Trichoderma (8.70%)、青霉属Penicillium (5.24%)、链霉属Streptomyces (5.13%),附生真菌优势属小球霉属Glomerularia(20.03%)、青霉属Penicillium (11.74%)、黑团孢属Periconia (6.84%)、膝葡孢属Gonatobotrys (5.65%)。向阴内生真菌优势属为黑团孢属Periconia (11.08%)、青霉属Penicillium (5.48%)、树粉孢属Oidiodendron (6.20%),附生真菌优势属膝葡孢属Gonatobotrys (6.57%)。由上可见,向阳向阴的内生真菌均是以黑团孢属Periconia为最大优势菌群,分别占20.5%和11.08%;膝葡孢属Gonatobotrys为向阳向阴部位共同具有的附生真菌优势菌群,分别占5.65%和6.57%。

上部和下部青檀叶片样品分离内生真菌和附生真菌的优势菌群组成亦表现出一定的差异。上部内生真菌优势属为黑团孢属Periconia (17.76%)、木霉属Trichoderma (7.03%)、青霉属Penicillium(6.79%);附生真菌优势属有膝葡孢属Gonatobotrys(10.50%)、青霉属Penicillium(8.94%)和内隔孢属Endophragmia (5.98%)。下部内生真菌优势属为黑团孢属Periconia(13.59%)、树粉孢属Oidiodendron (6.20%),附生真菌优势属为小球霉属Glomerularia(18.63%)、黑团孢属Periconia(7.05%)、青霉属Penicillium(5.01%)。由此可见,上部和下部的内生真菌亦均是以黑团孢属Periconia为最大优势菌群,分别占17.76%和13.59%;青霉属Penicillium为上部和下部共同具有的附生真菌优势菌群,分别占8.94%和5.01%。

通过Fisher′s exact test分析,结果表明(表 3)：(1)青檀叶片内生真菌菌群组成除了阴面和上部样品中存在显著差异之外(P=0.029),在来自其它部位的样本之中的菌群组成均无明显差异(P=0.083—0.758);(2)青檀叶片附生真菌菌群组成除了阴面和上部样品存在显著差异之外(P=0.032),在来自其它部位的样本之中的菌群组成均无明显差异(P=0.08—0.996);(3)来自青檀同一部位(阴面、阳面、上部和下部)的样品分离获得的相应内生真菌和附生真菌菌群的组成均无明显差异(P=0.074,0.098,0.052,0.535)。以上结果再次暗示着青檀叶片内生和附生真菌菌群之间存在着密切的演化关系,真菌与宿主植物在长期的发展过程中已经形成了较为稳定的协同进化关系。

2.3 青檀叶片内生和附生真菌菌群多样性分析

由表 4可知,青檀叶片内生真菌共分离菌株839株,占31.12,29属,占67.44%,而青檀叶片附生真菌共分离菌株1857株,占68.88%,37属,占86.05%。内生真菌以阳面样品分离的菌株数量为最多(495株),以阴面分离的菌株数量为最少(344株),附生真菌分离的菌株数量亦表现出了类似的规律。青檀叶片内生真菌以下部分离的菌群数量为最多(27属),以上部分离的菌群数量为最少(18属),而青檀叶片附生真菌菌群数量表现的规律恰好与之相反。青檀内生真菌的Shannon-Wiener index (H′) 多样性指数(2.44)和Margalef index (R) 丰富度指数(2.88)均分别小于青檀附生真菌Shannon-Wiener index (H′) 多样性指数(2.57)和Margalef index (R) 丰富度指数(3.32),但两者的Evenness index (E) 均匀度指数几乎相等,说明菌群在青檀叶片内、叶片外分布的均匀程度基本一致。

来自向阴和向阳青檀叶片样品分离的内生真菌的菌株数量、属数、Shannon-Wiener index (H′) 多样性指数和Margalef index (R) 丰富度指数均分别小于青檀附生真菌相应的菌株数量、属数、Shannon-Wiener index (H′) 多样性指数和Margalef index (R) 丰富度指数,而均匀度指数Evenness index (E)恰相反。以下部叶片的内生真菌的多样性为最高(2.46),丰富度为最大(3.02),上部的内生真菌的多样性和丰富度为最小。附生真菌以上部叶片分离的真菌的多样性最高(2.41),丰富度为最大(3.16)。

2.4 青檀叶片内生和附生真菌菌群组成相似性分析

实验结果表明(表 5),青檀叶片内生和附生真菌菌群组成具有较高的相似性,相似性系数达0.70。从不同采样部位青檀叶片样本中分离的内生真菌菌群的相似性系数(Cs)在0.62—0.90之间,来自青檀向阳的样品和上部的样品分离的内生真菌菌群的相似性系数为最高(Cs=0.90),菌群组成相似性最低的存在于来自青檀向阳与向阴的样品之间,但相似性系数仍达0.62。青檀叶片样本分离的附生真菌菌群的相似性系数在0.68—0.88之间,菌群组成相似性最大的存在于来自下部和向阳的样品之间,相似性系数为0.88,菌群组成相似性最低的亦存在于来自青檀向阳与向阴的样品之间,但相似性系数至0.68。该结果与上述通过Fisher′s exact test分析的结果是吻合的,即青檀叶片内生和附生真菌菌群组成差异不明显,相似度较高。

3 讨论

研究结果显示,青檀叶片内生真菌以阳面样品分离的菌株数量为最多(495株),以阴面分离的菌株数量为最少(344株),青檀叶片附生真菌分离的菌株数量亦表现出了类似的规律。青檀内生真菌的Shannon-Wiener index (H′) 多样性指数(2.44)和Margalef index (R) 丰富度指数(2.88)均分别小于青檀附生真菌Shannon-Wiener index (H′) 多样性指数(2.57)和Margalef index (R) 丰富度指数(3.32),但两者的Evenness index (E) 均匀度指数几乎相等,说明菌群在青檀叶片内和叶片外分布的均匀程度基本一致。青檀叶片内生真菌菌群组成阴面和上部样品中存在显著差异 (P=0.029),这些现象暗示青檀叶片内生真菌和附生真菌菌群之间存在着密切的演化联系,内生真菌可能除了本身固有的种类以外,可能有些是来源于附生真菌侵染定殖的结果,与附生真菌的种类和数量多寡有关,也与植物叶片的生理状态、营养状况、空气的湿度、光照、紫外线、降水、风、温度和温差等诸多因素有关,同样某些内生真菌在合适的条件下亦可以跨过叶片细胞间隙在叶片的表面生长繁殖而成为叶片的附生真菌。本研究仅在夏季首次探究青檀叶片内生和附生真菌菌群的可能联系,其他季节和其它种类的植物中是否会表现出同样的现象,尚需要更多的深入研究。

青檀叶片内生真菌以下部分离的菌群数量为最多(27属),以上部分离的菌群数量为最少(18属),而青檀叶片附生真菌菌群数量表现的规律恰好与此相反。内生真菌以下部叶片的内生真菌的多样性为最高(2.46),丰富度为最大(3.02),而以上部的内生真菌的多样性和丰富度为最小。附生真菌以上部叶片分离的真菌的多样性为最高(2.41),丰富度为最大(3.16)。来自向阴和向阳青檀叶片样品分离的内生真菌的菌株数量、属数、Shannon-Wiener index (H′) 多样性指数和Margalef index (R) 丰富度指数均分别小于青檀附生真菌的菌株数量、属数、Shannon-Wiener index (H′) 多样性指数和Margalef index (R) 丰富度指数,而均匀度指数Evenness index (E)恰相反。这种结果可能说明外界环境因素(光照、温度、湿度、自然风、雨水、昼夜温差、其他动物等)对青檀叶围区域的附生真菌的影响是较大的。内生真菌生长在植物组织内部,微环境相对比较稳定,受外界因素的影响相对较小,菌群亦趋稳定,这也是“菌植”长期协同进化的结果。

青檀叶片内生和附生真菌菌群组成具有较高的相似性,相似性系数达0.70,这一结果再次暗示着青檀内生真菌与附生真菌之间存在着密切的演化关系,通过Fisher′s exact test分析也证实了这一结论。研究结果可为进一步探讨内生真菌与宿主附生真菌的协同演化和相互作用机制提供借鉴材料。从不同采样部位青檀叶片样本中分离的内生真菌菌群的相似性系数(Cs)在0.62—0.90之间,来自青檀向阳的样品和上部的样品分离的内生真菌菌群的相似性系数为最高(Cs=0.90),菌群组成相似性最低的存在于来自青檀向阳与向阴的样品之间。青檀叶片样本分离的附生真菌菌群的相似性系数在0.68—0.88之间,菌群组成相似性最大的存在于来自下部和向阳的样品之间,相似性系数达0.88,菌群组成相似性最低的亦存在于来自青檀向阳与向阴的样品之间。不同取样部位青檀叶片内生和附生真菌菌群相似性差异的原因可能较为复杂,真菌的组成既与宿主及其中附生和内生真菌的自然保存状态有关,也会与所处的生境条件有关,生境条件的变化是否有利于外界非专性内生真菌的侵入和增殖、专性和非专性真菌的竞争结果如何等^[16]。