石羊河流域中下游地区曾经是植被茂密、物种丰富、水草特别丰美的大片绿洲^[1]。但是，由于石羊河上游农业生产规模不断扩大，对水资源的需求逐年增加，流入石羊河中下游绿洲区内的水量急剧减少^[2]，下游地区不得不过量开采地下水来满足灌溉需水^[3]。造成土地大面积弃耕而撂荒，这部分土地如果不及时保护，就会风蚀沙化，成为新的沙尘源，形成恶性循环，使土壤系统遭到破环，其结果加剧和导致石羊河中下游成为全国沙尘源区和生态危机区，不利于《甘肃石羊河流域重点治理规划》国家生态建设项目工程的实施。因此，加强对石羊河下游土壤系统的研究，不仅对该区域的生物多样性保护具有积极作用，而且对我国干旱沙区生态系统研究具有重大指导意义。

土壤微生物是生态系统的重要组成部分，虽然只占土壤营养库的小部分，但它既是养分的“库”，又是养分的“源”，是土壤生态系统的核心，直接或间接参与调节土壤养分循环^[4]、能量流动^[5]、有机质转换^[6]、土壤肥力形成^[7]、污染物的降解及环境净化^[8]等，特别在生态系统物质转化和能量流动过程中起主导作用，具有巨大的生物化学活性^[9]。在一定程度上能反映土壤环境状况，能较早地指示生态系统功能的变化，是评价土壤环境质量的重要参数^[10]。土壤酶是土壤系统的生物催化剂，参与许多重要的生物化学过程，在土壤物质循环和能量转化过程中起着重要作用，是土壤功能的直接体现。与土壤理化性质、土壤类型、施肥、耕作以及其它农业措施等密切相关^[11-12]。土壤酶活性在一定程度上反映了土壤所处的状况，且对环境等外界因素引起的变化较敏感，成为土壤系统变化的预警和敏感指标^[13]，作为农业土壤质量和生态系统功能的生物活性指标已被广泛研究^[14-15]。土壤微生物与土壤酶活性一起推动着土壤生物化学过程，同时对土壤的演化具有重要影响。以前，对土壤演变的研究主要以土壤理化性质为目标^[16]，近年来，土壤微生物特性与土壤酶活性对土壤生态系统演变所起的作用也受到广泛的关注^{[14, 17-21]}，但在西北干旱沙区，退耕地自然恢复过程中土壤微生物与土壤酶活性相关性研究报道较少。

本研究以石羊河下游不同年限(1—31 a)退耕地为研究对象，旨在探讨其土壤微生物区系组成、土壤微生物生物量、土壤酶活性的变化特征以及它们之间的相互关系，为揭示石羊河下游退耕区土壤系统的结构和功能提供基础数据，同时为该地区的可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 研究区概况

研究区位于石羊河下游的甘肃省民勤县西渠镇(图 1)，海拔1297—1306 m，地理坐标为39°01′44″—39°03′28″ N、103°35′58″—103°37′54″ E，研究区均为退耕地，附近居民已经搬迁或者移民。年日照时数2832.1 h，年均温度7.4℃，极端最高气温38.1℃，极端最低气温-28.8℃，昼夜温差大；年均降水量110 mm，年内分布不均匀，73%的降雨量集中在7—9月；年均蒸发量2644 mm；年平均风速2.3 m/s；土壤类型为灰棕漠土。灌木种主要有盐爪爪(Kalidium foliatum)，苏枸杞(Lycium ruthenicum)，红砂(Reamuria soongoria)等；草本植物有藜(Chenopodium album)，骆驼蒿(Peganum nigellastrum)，盐生草(Halogeton arachnoideus)，骆驼蓬(Peganum harmala)，田旋花(Convolvulus arvensis)等。

1.2 样地布设

2011年11月，走访调查当地农户和查阅西渠镇煌辉村与志云村退耕土地使用记录。在此基础上采用空间替代时间的方法，在集中连片的退耕地上，选择植物生长均匀、微地形差异较小。并且土壤没有因自然因素而导致地形的变迁或因人为因素而引起的土壤物质再分配的地段，在保证样地沙土母质基本相同的情况下，分别选择退耕年限为1，2，3，4，5，8，15，24、31 a的9个样地(表 1)，用GPS定位，样地面积为1 hm²。在每个样地中以S形方法布设5个土样采集点，做好标记。试验区各样地之间相对高差约9 m(表 1)。

1.3 土壤样品采集及预处理

2012年9月22—23日，在每个样地内布设的5个土样采集点，每样点3个重复，分别采集0—10 cm、10—20 cm、20—30 cm、30—40 cm深度的土壤样品，共108个。每个样品取重1 kg左右，装入无菌袋放于带冰块的泡沫箱内，带回实验室，贮存于4℃冰箱，用于土壤微生物数量、土壤微生物生物量及土壤酶活性的测定。

1.4 土壤分析测定 1.4.1 土壤微生物数量测定

细菌数量测定：采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，以平板表面涂抹法计数^[9]。

真菌数量测定：采用马丁-孟加拉红培养基，以平板表面涂抹法计数^[9]。

放线菌数量测定：采用改良高氏一号培养基^[22]，以平板表面涂抹法计数^[9]。

1.4.2 土壤微生物生物量测定

以氯仿熏蒸法^[9]测定。土壤微生物生物量碳(SMBC)测定^[23]。土样经氯仿熏蒸后用0.5 mol/L K₂SO₄溶液提取，浸提液中碳测定采用重铬酸钾硫酸外加热法。

土壤微生物生物量氮(SMBN)测定^[23]。土样经氯仿熏蒸后用0.5 mol/L K₂SO₄溶液提取，浸提液中氮测定采用凯氏定氮法。

土壤微生物生物量磷(SMBP)测定^[23]。土样经氯仿熏蒸后用0.5 mol/L NaHCO₃溶液提取，提取液中磷测定采用钼蓝比色法。

式中，Ec为熏蒸土壤浸提液中有机碳(氮、磷)量；Ec₀为不熏蒸土壤浸提液中有机碳(氮、磷)量；0.38(0.54、0.40)-校正系数。

1.4.3 土壤酶活性测定

过氧化氢酶活性的测定采用容量法^[15]，用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为B，用于滴定25 mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为A。(A-B)×T即为过氧化氢酶活性。

脲酶活性的测定采用靛酚蓝比色法^[24]，以24 h后1 g土壤中NH₃-N的毫克数表示。

蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水杨酸比色法^[24]，以24 h后1 g土壤葡萄糖的毫克数表示。

磷酸酶活性用磷酸苯二钠比色法^[24]，以24 h后1 g土壤中释出的酚的毫克数表示。

1.4.4 土壤微生物数量、微生物生物量和土壤酶活性加权平均值计算

将土壤生物数量、微生物生物量和土壤酶活性各性状记作Xik(i=1，2，…，n；其中n为处理个数；k表示土层深度，k=1，2，3，4分别表示0—10 cm、10—20 cm、20—30 cm、30—40 cm土层；m为土壤生物数量、微生物生物量和土壤酶活性指标数)；分别计算出∑ik与∑i；用公式，(ω_i为权重系数)得出土壤生物数量、微生物生物量和土壤酶活性加权平均值。

1.5 数据处理

试验数据先使用 Excel软件进行统计整理，然后将整理好的数据用SPSS 18.0软件进行分析处理。不同年代退耕地土壤微生物数量、微生物量及土壤酶活性差异显著性采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验。上述三者之间的相关性分析采用Pearson相关。

2 结果与分析 2.1 土壤微生物数量的变化

土壤三大类微生物数量反映了土壤中微生物的功能与活性。石羊河中下游不同年限退耕地土壤三大类微生物数量均表现为：细菌最高，放线菌次之，真菌最低。经方差分析，退耕年限对微生物数量无显著影响。而土层深度的变化对细菌、真菌及放线菌有极显著的差异(P<0.01)，同一退耕年限，土壤三大类微生物数量均为表层大于深层，如退耕1a表层细菌、真菌及放线菌的数量分别为30—40 cm土层中的51、5.6及8.1倍。

不同退耕年限土壤微生物数量的变化，从图 2和表 2中可以看出，不同年限退耕地相同土层间细菌成阶梯式变化，加权平均值的最大值11.49×10⁵ cfu/g出现在第1年，加权平均值的最小值0.75×10⁵ cfu/g出现在第15年前后，从第2年到第4年、第5年到第8年以及第15年到第24年这几个时段都成阶梯式逐渐增大。真菌总体表现出随着退耕年限的增加波动式增大、再波动式减小的趋势。当退耕4 a时，达到加权平均值的最大值2.33×10³ cfu/g，然后随着退耕年限的增大，逐渐减小，最后趋于稳定。放线菌呈现出随着退耕年限的增加而波动式增大，最后波动式减小的趋势。在退耕1—4 a间逐渐增大，第5年时有所下降，到退耕8 a前后达到了加权平均值的最大值5.81×10⁵ cfu/g，退耕15 a期间，下降到加权平均值的最小值0.71×10⁵ cfu/g，而后逐渐趋于平稳。退耕1—31 a间，土壤微生物数量均表现出随土壤深度的增加而逐渐降低，不同层次间三大土壤微生物数量存在极显著差异(P<0.01)。

2.2 土壤微生物生物量的变化

土壤微生物生物量碳、氮、磷是土壤活性养分的储存库，能灵敏的反映环境因子的变化^[25]。土壤微生物生物量随着土层深度的增加，呈显出减少的变化趋势，经方差分析，各土层之间微生物生物量碳、氮、磷有极显著的差异(P<0.01)。不同退耕年限土壤微生物生物量氮差异显著(P<0.05)，即退耕年限不同，微生物生物量氮亦不同。但对微生物生物量碳和微生物生物量磷差异不显著。即随着退耕年限的变化，微生物生物量碳和磷无明显变化。

不同退耕年限土壤微生物数量的变化，从图 3和表 3中可以看出，不同年限退耕地相同土层间土壤微生物生物量碳成阶梯式变化，加权平均值的最大值629.88mg/kg出现在第24年期间，加权平均值的最小值177.79mg/kg出现在第3年，从第1年到第3年逐渐减小，然后成逐渐增大趋势，到24 a前后趋于平稳。土壤微生物生物量氮呈现出随着退耕年限的增加而波动式减小，再波动式增大，最后波动式减小的趋势，到24 a前后趋于平稳。在退耕1—2 a逐渐减小，而后显著增大，到退耕4 a时达到了加权平均值的最大值183.73 mg/kg，然后相对趋于平稳而下降，退耕15 a前后下降到加权平均值的最小值79.92 mg/kg。微生物量磷总体表现出随着退耕年限的增加波动式增大、再波动式减小的趋势。当退耕5—8 a时，达到加权平均值的最大值121.12mg/kg左右，然后随着退耕年限的增大，逐渐减小，最后趋于稳定。退耕1—31 a间，土壤微生物生物量均表现出随土壤深度的增加而逐渐降低，不同层次间土壤微生物生物量存在极显著差异(P<0.01)。

2.3 土壤酶活性的变化

从图 4可以看出，各层次土壤酶活性变化的总趋势为，随着土壤深度的增加而降低，即：0—10 cm>10—20 cm>20—30 cm>30—40 cm。经方差分析，退耕年限与土层深度的变化，对过氧化氢酶的活性无显著影响；而对蔗糖酶与脲酶活性有极显著的差异(P<0.01)；磷酸酶的活性随着退耕年限的变化不大，但随着土壤深度的增加显著减小(P<0.01)。

针对不同退耕年限土壤酶活性变化，从图 4和表 4中可以看出，不同年限退耕地相同土层间过氧化氢酶活性成波动式变化，加权平均值的最大值1.03 mL g^-1 20min^-1)出现在第2年，加权平均值的最小值0.94 mL g^-1 20 min^-1出现在第3年，总体来看，不同年限退耕地其活性变化不大，相对稳定，加权平均值都在1 mL g^-1 20 min^-1左右。脲酶活性呈现出随着退耕年限的增加而波动式减小趋势，最后趋于稳定。退耕5年后，波动幅度较大，明显减小，退耕15 a前后，达到加权平均值的最小值0.12 mg g^-1 d^-1，最后趋于相对平稳。蔗糖酶活性总体表现出随着退耕年限的增加波动式增大、再波动式减小的趋势。当退耕4 a时，蔗糖酶活性达到加权平均值的最大值16.51 mg g^-1 d^-1，当退耕时间达到15 a期间其活性逐渐减小，最后趋于稳定。磷酸酶活性呈现出随着退耕年限的增加而波动式减小，再波动式增大，最后相对的趋势。在退耕1 a到3 a间逐渐减小，而后显著增大，到退耕5—8 a时达到了加权平均值的最大值3.17 mg g^-1 d^-1左右，退耕15 a前后，磷酸酶活性相对平稳。

3 讨论与结论 3.1 土壤微生物数量的变化规律

土壤微生物数量与其所处土壤各相关因子的变化密不可分。本研究中，土壤三大类微生物数量基本都是细菌最高，放线菌次之，真菌最低，这说明细菌是优势菌，这个结论印证了谭宏伟^[18]、马文文^[20]、王少昆^[21]、逄蕾^[26]等的观点。石羊河下游流域土壤中性偏碱性，同时生长的植被分泌物，适宜细菌的生长繁殖，而不利于真菌的生存，因此细菌数量远大于真菌数量。不同退耕年限9个样地相比较，退耕1 a的土地中细菌数量最多，而真菌数量最少，放线菌数量居中，这与总的微生物数量的变化趋势相一致；退耕4 a的土地中真菌数量最大，细菌与放线菌数量居中；退耕8 a期间土地中放线菌数量最大，细菌与真菌数量居中。总体来看，三大土壤微生物的加权平均值的最大值均在退耕后的前8 a，这是由于，退耕1—8 a耕作施肥等农业管理措施刚停止或者停止时间不长，土壤有机质含量和其他相关因子较高^[27]，1 a生草本植物迅速生长，占据优势^[28]，土壤微生物生长旺盛；随着退耕年限的增加，特别是退耕4—5 a后，土壤湿度减小，土壤全氮、铵态氮和有机质等其它因子含量下降^{[27, 29-30]}，限制了土壤微生物的活动。

在土壤层次上，除退耕2 a土壤中真菌的加权平均值的最大值出现在20—30 cm土层外，其余各退耕年限三大土壤微生物的加权平均值的最大值均出现在0—10 cm及10—20 cm土壤层，总的变化趋势是随土壤深度的增加三大土壤微生物数量逐渐减小。该结果与谭宏伟^[18]、马文文^[20]、文都日乐等^[31]研究得出的土壤微生物空间变化规律相似。其原因与各土层中有机质含量以及土壤的水分含量直接相关^[32]。

3.2 土壤微生物微生物量的变化规律

土壤微生物生物量反映了土壤中微生物的功能与活性，同时，微生物量与其所处土壤各相关因子的变化密不可分。对研究区9个样地相比较，土壤微生物生物量碳的加权平均值的最大值629.88 mg/kg出现在退耕后24 a期间，而此时土壤微生物生物量氮与土壤微生物生物量磷居中；退耕4 a的土地中微生物量氮值(183.73 mg/kg)最大，微生物量碳与微生物量磷居中；退耕8 a左右土地中微生物量磷值(121.12 mg/kg)最大，微生物量碳与微生物量居中。土壤微生物生物量是土壤中活的有机质，是土壤养分重要来源。土壤微生物生物量碳加权平均值的最大值出现在退耕后的24 a期间，说明土壤微生物生物量碳的聚集是一个漫长的过程，到24 a前后才能达到加权平均值的最大值；土壤微生物生物量氮的加权平均值的最大值出现在退耕后的4 a，说明退耕4 a时，土壤肥力水平达到了最好状态，到退耕5 a时，又恢复到退耕3 a时的状况，可能与退耕最后一年种植的不同农作物有关，退耕4 a的土地，最后一年种植豆科的紫花苜蓿(Medicago sativa L.)，其余土地种植的农作物是西瓜(Citrullus lanatus)、茴香(Foeniculumvulgare)、棉花(Gossypiumspp)等，这一现象的出现，正好与种植豆科植物可以改良土壤相吻合，说明退耕地土壤肥力的状况与退耕最后一年种植的农作物有密切的关系；土壤微生物生物量磷加权平均值的最大值虽然出现在退耕后的5—8 a，但变化不在，退耕3 a到15 a期间都在加权平均值110 mg/kg与120 mg/kg上下波动，说明土壤微生物生物量磷受退耕年限的影响不明显，可能原因是磷在土壤中的形态较为复杂，并且土壤磷素分布受到成土母质中矿物成分、地貌、土地利用方式等多种因素的影响，几乎不受自然环境和植被的影响^{[20, 33]}。其具体原因有待进一步的研究。

在土壤层次上，微生物量磷呈现出随着土层深度增加而土壤微生物生物量减小的趋势。同时也发现，0—10 cm土层的微生物量在4层总的微生物量中占有较大的比例。谭宏伟^[18]、马文文^[20]、文都日乐等^[31]研究也发现了相似的规律。主要是由于土壤表层有少量的枯枝落叶和腐殖质，有机质含量高，再加上表层温度条件和通气状况良好，微生物旺盛生长，代谢活跃，使表层的土壤微生物生物量增加^[19-20]。

3.3 土壤酶活性的变化规律

对9个样地相比较，退耕2 a的土壤中过氧化氢酶与脲酶的活性最强，而蔗糖酶与磷酸酶活性居中；退耕4 a的土壤中蔗糖酶与脲酶活性最强，过氧化氢酶与磷酸酶活性居中；退耕5 a的土壤中磷酸酶活性最强，蔗糖酶活性较弱，过氧化氢酶与脲酶活性居中。因此，根据各种酶的功能特征，退耕2 a的土壤对防止H₂O₂的毒害最为有效，最有利于土壤含氮化合物的水解与转化；退耕4 a的土壤熟化程度最高；退耕5 a的土壤有利于加快有机磷的脱磷速度。总体来看，四种土壤酶的加权平均值的最大值均在退耕后的前5 a，这是由于，退耕1—5 a耕作施肥刚刚停止，土壤有机质含量和其他相关因子较高^{[27, 29]}，土壤酶的活性较强；退耕4—5 a后，全氮、铵态氮、土壤有机质、全磷等其他因子含量下降^[29]，脲酶、磷酸酶的活性功能也随之减小。根据退耕年限与四种酶活性的相关性分析，蔗糖酶与退耕年限表现出极显著的正相关，相关系数为53.4%；脲酶与退耕年限表现出极显著的负相关，相关系数达到86.2%。这说明土壤酶活性用来表征干旱区土壤肥力状况是可行的，同时说明，退耕4—5 a后虽然土壤的熟化程度越大，但土壤的肥力呈下降的趋势^[30]，这一现象的出现与草原撂荒地土壤理化特性随着撂荒时间延长而增加的现象相反^[34]。石羊河下游地区，土层浅薄，退耕4年后，土壤团聚性降低，土壤质地变粗^[30]，就会风蚀沙化，生态环境一旦遭到破坏，则难以恢复。因此，退耕4—5 a撂荒地合理利用与修复值得高度重视。

在土壤层次上，随土壤深度的增加四种土壤酶活性逐渐减小。同时也发现，0—10 cm土层的酶活性在4层总酶活性中占有较大的比例。该结果与文都日乐等^[31]、符裕红^[35]、秦燕等^[36]、王理德^[37]研究得出的土壤酶活性垂直变化的特点相一致。其原因，由于石羊河下游土壤肥力较差，只有表层有少量的枯枝落叶和腐殖质，可以支持微生物的生长，表层温度条件和通气状况良好，一旦遇到降雨，微生物旺盛生长，代谢活跃，使表层的土壤酶活性提高。研究区干旱少雨，自然降雨只能贮藏于土壤表层，随着土壤剖面的加深，土壤水分显著减少，土壤温度降低，土壤密度增加，有机质和腐殖质数量减少，限制了土壤微生物的正常活动及代谢产酶能力^[38]。由于这些因素的综合作用，使得土壤酶活性随着土层的加深而逐渐降低，而且，表层土壤酶活性所占比例较大。

也有学者研究认为土壤脲酶活性^[39]与土壤氧化氢酶活性^[40]随土层的增加而逐渐升高，还有学者认为它们的变化不明显，没有表现出规律性^[41]。研究结果相异，主要是因为研究区土壤、气象及环境不同而不同。

3.4 土壤微生物数量、微生物量及酶活性的相关性

对石羊河流域下游退耕地土壤微生物数量、微生物量和土壤酶活性进行相关性分析结果如表 5所示。土壤微生物数量与土壤微生物生物量之间的相关性结果显示，土壤微生物生物量碳与放线菌呈显著正相关(P<0.05)；土壤微生物生物量氮与三大土壤微生物数量均呈显正相关，并与真菌呈现出极显著正相关(P<0.01)，相关系数达到了90%以上；土壤微生物生物量磷与细菌呈显著负相关、与放线菌呈显著正相关(P<0.05)，而与真菌无显著相关性。

土壤微生物数量与土壤酶之间的相关性结果表明，土壤细菌与脲酶呈显著正相关(P<0.05)，而与其它3种土壤酶无显著的相关性；真菌与蔗糖酶呈极显著正相关(P<0.01)，与脲酶呈显著正相关(P<0.05)，而与过氧化氢酶和磷酸酶无显著相关性；放线菌与过氧化氢酶和蔗糖酶呈极显著正相关(P<0.01)，与磷酸酶呈显著正相关(P<0.05)。

土壤微生物生物量与土壤酶之间的相关性结果表明，土壤微生物碳只与磷酸酶呈现出极显著正相关(P<0.01)，而与其余3种酶无显著的相关性；土壤微生物氮与脲酶呈极显著正相关(P<0.01)，与蔗糖酶呈显著正相关(P<0.05)，而与过氧化氢酶和磷酸酶呈负相关；微生物磷只与蔗糖酶呈现出极显著正相关(P<0.01)，而与其余3种酶无显著相关性。

三大类微生物之间只有真菌与放线菌呈极显著正相关(P<0.01)，其它之间都没有显著相关性；微生物量碳、氮、磷之间也只有微生物量碳与微生物量氮呈显著负相关(P<0.05)，其余之间也无显著相关性；四种酶彼此之间只有过氧化氢酶与蔗糖酶和磷酸酶呈现出显著的正相关(P<0.05)，其余各土壤酶之间也无显著相关性。

土壤微生物数量、土壤微生物生物量和土壤酶活性反映了土壤的营养状况，三者在一定程度上可以反映土壤肥力状况及其生产力水平^[42]。石羊河下游退耕地土壤微生物数量、微生物量和酶活性之间有不同程度的相关性。特别是真菌与放线菌、微生物量氮、蔗糖酶，放线菌与过氧化氢酶、蔗糖酶，微生物量碳与磷酸酶，微生物量氮与脲酶，微生物量磷与蔗糖酶均存在极显著的相关性。微生物数量、微生物量和酶活性对土壤养分的转化和供应起重要作用^[43]，且三者之间密切联系、彼此影响。放线菌与土壤磷酸酶存在显著的正相关(P<0.05)，表明微生物促进胞外磷酸酶的分泌^[44]。土壤微生物生物量氮与脲酶活性呈极显著正相关(P<0.01)，这表明土壤中存在着一些固氮微生物，其数量的增加将促进对土壤氮的固定，从而为脲酶提供了底物，提高了脲酶活性，使其矿化成无机氮，土壤微生物吸收后转化成土壤微生物生物量氮，微生物量氮是土壤有机—无机态氮转化的一个关键环节^[44]。

土壤演变是极其复杂而又缓慢的过程，石羊河流域下游退耕地在31 a的自然恢复过程中，土壤微生物数量表现为细菌数量最多，是该地区的优势菌，放线菌数量次之，真菌数量最少。退耕4 a时，土壤的熟化程度和土壤肥力水平达到了最好状态。土壤微生物数量、土壤微生物生物量碳、氮、磷含量及土壤酶活性随土层的加深而降低，两两之间都存在不同程度的相关性。退耕4—5 a年后，土壤的肥力呈下降的趋势。因此，退耕4—5 a后，土地修复、利用及荒漠化治理是关键时候。

致谢: 北京林业大学吴江梅教授对写作给予帮助，特此致谢。