棉花(Gossypium hirsutum L．)是我国重要的经济作物和纺织原料。由于耕地资源日益紧张，以及棉产区产业化发展的需求，原有轮作倒茬种植方式难以为继，导致棉花连作日益严重，部分植棉区连作面积达到60%—70%，最长连作年限达30a。随着连作年限的延长，棉花出现了大量死苗、生长不良、病虫害频发、早衰严重等问题，严重影响了棉花产量和品质，已成为我国棉花生产的一大制约因素^[1]。枯萎病为棉花生产中的世界性病害，是由尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)引起的维管束病害，靠土壤传播，防治难度较大，一旦发生，轻者致使棉花产量下降、纤维品质变劣，重者可造成绝产，一直是困扰我国棉花生产的难题^[2]。目前在连作对土壤理化性质、土壤酶活和土壤微生物的影响等方面已有大量研究^[3-5]，但连作后棉花对枯萎病抗性的变化鲜有报道。

到2013年，我国有750万农户种植420万hm²的Bt抗虫棉，种植面积已达棉花种植总面积的90%，平均每户农民种植0.5hm²的Bt棉花^[6]。由于抗虫棉的大面积推广应用，棉铃虫的危害得到了有效控制, 但是抗虫棉育种重视了抗虫与抗黄(萎病)，忽略了抗枯(萎病)的培育^[7]。特别是在长年连作棉区，棉花枯萎病菌逐年积累，危害逐显突出。由于抗虫基因的导入, 导致一些生育性状的改变^[8]，造成转基因抗虫棉的抗病性较常规棉差，可能是引起连作棉花抗病性下降的重要因素之一^[9-10]。另外，长期连作引起棉田土壤某些物理、化学性质的恶化、微生物群落失衡，进而可以引起植物体内活性氧(ROS)水平升高积累过多，影响超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性^[11]。SOD、POD和CAT作为细胞膜系统的保护酶，可在逆境胁迫时，参与活性氧清除及酚类、木质素和植保素等抗病相关物质的合成，能抵御体内ROS及氧自由基对细胞膜系统的伤害，增强植物对病害的抵抗能力，是植物忍耐外界不良环境的机理之一^[12-13]。因此，土壤环境的改变势必会引起棉花抗病性能的变化。许多学者对多种植物感病后上述各种酶活性的变化规律进行研究，发现其活性与植物抗病性有密切关系^{[12, 14]}。

因此，本文通过研究不同连作年限条件下棉花生长及其抗氧化酶活性和膜质过氧化产物对枯萎病菌侵染的响应差异，以期从棉花对枯萎病菌的生理生化响应的角度探讨连作棉花发病率上升的问题，从而为解决棉花连作问题提供新的理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料与设计

试验用土壤采自江苏省盐城市步凤镇盐城沿海地区农科所农场(33°37′N, 120°37′E)。选取连续种植棉花5a(L5)和15a(L15)的棉田，于2014年4月多点采集表层土(0—20cm)，并采集棉田周边近5a未种棉花的农田土壤(玉米/大豆-大麦轮作)作为对照(CK)。土样采集后，立即带回实验室，去除动植物残体、石块后，过2mm筛，用于盆栽试验。采用平板培养法测定CK、L5和L15土壤中枯萎病菌的数量，分别为0.4×10³、2×10³、11×10³ cfu/g土。同时分取一部分土样，测定土壤基本理化性质(表 1)。

供试棉花品种：抗枯萎病品种中棉38(Z-38)和耐枯萎病品种南农10号(N-10)，均为江苏棉区普遍种植的杂交转基因抗虫棉。棉花种子由江苏沿海地区农业科学研究所提供。

本研究使用的棉花枯萎病菌广泛分布于长江和黄河流域棉区，属于棉花枯萎病7号生理小种，由中国农业科学院棉花研究所提供。菌种经PDA培养基活化(30℃)5d后，孢子转入PDA液体培养基，摇床培养48h(30℃，180r/min)，4层无菌纱布过滤，无菌水稀释，使孢子液浓度达到约1.0×10⁷cfu/mL。

试验于室内人工气候培养箱内进行。将不同连作年限的土壤分装在盆钵中，每盆400g。挑选饱满一致的棉花种子，50%的酒精浸泡5min，无菌蒸馏水冲洗5次，每盆播2粒，置于人工气候箱内培养，光照14h(30℃)、黑暗10h(25℃)，湿度60%—90%，每天及时浇水。待子叶长出后定苗，每盆定植1株。棉花生长至三叶期时，用无菌刀片划切伤根并接种棉花枯萎病菌孢子悬液5mL，补充水分保持湿度。两个棉花品种分别设置3个不同土壤处理：连作5a土壤(L5)、连作15a土壤(L15)以及非连作土壤(CK)，每个处理3次重复，每个重复5盆，共90盆。

1.2 测定指标与方法 1.2.1 棉花样品采集

分别在接菌前(0d)以及接菌后第2天、6天和第10天采集棉花植株样品，采样时每个处理随机选3株，将棉花幼苗连带土壤从盆子小心取出，浸入水中5—10min，流水将根部土壤小心冲洗干净，尽量不损坏根部，无菌双蒸水冲洗2—3次，置于-80℃冰箱保存，用于测定生理生化指标。并测定第10天采集的棉花样品的株高、主根长、地上鲜重和根系鲜重。

1.2.2 棉花生理生化指标测定

称取0.5g叶片，置于预冷的研钵中，加预冷的4.5mL磷酸盐缓冲液(0.1mol/mL，pH7.2)，在冰浴条件下研磨制备成10%的匀浆，3500r/min离心10min后，取上清液待测。可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法^[15]，超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用黄嘌呤氧化酶法^[16]，过氧化氢酶(CAT)活性测定采用可见光分光光度法^[17]，过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法^[15]，丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法^[18]。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel软件处理数据，用SPSS 16.0软件进行方差分析和LSD多重比较法进行统计分析(P＜0.05)。

2 结果与分析 2.1 连作土壤对棉花幼苗生长的影响

由图 1可知，与对照非连作土壤相比，棉花枯萎病菌接种10d后，连作土壤中棉花长势较差。长期连作土壤(L15)显著降低了棉花地上鲜重，南农10号和中棉38地上鲜重分别比对照降低39.69%、26.91%。随着连作年限的延长，根系鲜重呈下降趋势。连作土壤也显著抑制棉花主根的生长，种植在连作5a(L5)、15a(L15)土壤中的南农10号主根长分别比对照降低21.67%和28.33%，中棉38主根长分别比对照降低18.67%和16.33%。同时，连作土壤也显著影响了棉花幼苗株高。

2.2 连作土壤对棉花可溶性蛋白含量的影响

由图 2可以看出，病原菌接种前(第0天)，连作土壤中两种棉花体内可溶性蛋白的含量较高，种植在连作5a(L5)和连作15a(L15)土壤中的中棉38可溶性蛋白浓度分别比对照高30.72%、91.27%，南农10号分别比对照高42.74%、35.48%。病原菌接种后，第2天到第6天，中棉38的可溶性蛋白含量总体随连作年限增加而升高，种植在连作土壤(L5和L15)中的南农10号可溶性蛋白浓度显著高于对照。第10天中棉38可溶性蛋白含量在连作土壤处理和对照之间无显著差异。

2.3 连作土壤对棉花抗氧化酶活性的影响

由图 3可知，枯萎病菌接种前(第0天)，中棉38的SOD活性随土壤连作年限的延长显著升高，但是南农10号的SOD活性则随着土壤连作年限延长显著降低。接菌后第2天到第6天，两个棉花品种的SOD活性均随土壤连作年限的延长而降低，且不同连作年限土壤处理间均有显著性差异。接菌后10d，南农10号SOD活性在各不同土壤处理间没有显著差异，而种植在L15土壤处理中棉38的SOD活性显著高于L5和对照土壤处理。

不同连作土壤对两种棉花体内CAT活性的影响与SOD活性一致。从病菌接种第0天到第2天，中棉38的CAT活性随土壤连作年限延长而显著升高，但南农10号的CAT活性则随土壤连作年限延长而显著降低(图 4)。病菌接种后第6天到第10天，南农10号CAT活性依然随土壤连作年限的延长而降低，而中棉38的CAT活性呈现出随土壤连作年限的延长而降低的趋势。

与非连作土壤相比，接菌前后，连作土壤对中棉38体内POD活性没有显著影响，但明显增加了南农10号的POD活性(图 5)，其中在第0天、2天和10天有显著差异。

2.4 连作土壤对棉花MDA含量的影响

由图 6可知，接菌前(第0天)，种植在连作土壤中的棉花体内MDA含量较高，并随连作年限延长呈增加趋势，说明连作土壤已经引起了棉花膜质过氧化反应。接菌后第2天到第10天，棉花体内MDA的含量升高，并随连作年限增加而增加；与对照和连作5a土壤处理相比，长期连作土壤(L15)显著增加了棉花体内的MDA含量(图 6)。

3 讨论

已有许多研究表明，连作抑制棉花(Gossypium hirsutum L．)^[19]、花生(Arachis hypogaea L.) ^[20]生长。郭红伟等对连作辣椒(Capsicum annuum L.)的研究结果表明，连作土壤导致辣椒植株株高、茎粗和地上部鲜重下降^[21]；王芳等发现连作茄子(Solanum melongena L.)幼苗株高、叶面积、主根长和总根长明显低于正茬^[22]。也有研究表明，连作土壤灭菌后，苹果幼苗的株高，鲜重和干重分别比不灭菌连作土的高83%、86%和91%^[23]。本实验结果表明，连作土壤中两种棉花的主根长显著减小、地上鲜重和株高显著降低，根系鲜重也有不同程度降低。试验期间棉花幼苗植株虽未出现明显的发病症状，但连作土壤处理的棉花地下根系已出现发黑的现象，一级侧根数目和根系鲜重明显下降；而对照土壤接种棉花枯萎病菌后没有类似现象出现。说明连作土壤首先对根部造成损害，影响了棉花生理生化代谢功能和正常生长，进而影响棉花的抗病能力。另外，棉花枯萎病菌是由棉花根部伤口侵入或根梢直接侵入，并由导管向上蔓延，引起整株棉花发病，因此连作土壤造成棉花根部的损伤可能引起棉花枯萎病发病率上升。

蛋白质是植物体生命过程中重要的结构物质和功能物质，其含量直接反映酶的含量，同时具有渗透调节的功能，影响植物的生理功能^[24]。本研究结果表明，接菌前(第0天)，连作土壤中棉花体内的可溶性蛋白含量上升，说明连作后棉花能够通过主动积累可溶性蛋白来降低细胞液的渗透势，以防止细胞损伤。接菌后第2天到第10天，中棉38的可溶性蛋白含量随连作年限增加而升高。虽然连作土壤引起南农10号可溶性蛋白含量升高，但连作15a土壤中的棉花可溶性蛋白含量显著低于连作5a土壤处理。这种差异可能与不同棉花品种的抗病性有关：抗病品种中棉38种植在连作15a土壤中仍具有渗透调节能力，能够积累蛋白调节渗透势；而相比之下，耐病品种南农10号的调节能力则降低或失去，使细胞合成可溶性蛋白的能力降低。说明连作土壤严重影响了棉花体内的蛋白质代谢，长期连作(L15)条件下，病原菌的胁迫破坏了南农10号体内蛋白质的正常代谢功能，进而降低了棉花的抗病能力。

在植物正常生长情况下，通常在细胞中产生活性氧(ROS)，植物在长期进化过程中形成了多种防御策略(如抗氧化酶系统和非酶类抗氧化物)来抵御活性氧造成的损伤，以保持生理平衡状态^[25]。但当植物遭受逆境胁迫时，使得活性氧积累过多，致使植物组织受到伤害，活性氧作为信号分子还能诱导植物抵御外界环境胁迫。抗氧化酶可以清除活性氧，有利于提高植物耐受能力和减轻对生物、非生物胁迫的影响^[26]。如，SOD作为清除活性氧的第一道防线，能将有毒的O₂^-·转化为更稳定的H₂O₂^[27]，H₂O₂又被CAT和POD分解^[25]。有研究表明，植株受到胁迫后，抗氧化物酶活性相对降低^[28-29]。本研究结果表明，接菌前(第0天)，抗病品种中棉38体内的SOD和CAT活性随着土壤连作年限的延长逐渐升高，说明了连作土壤诱导棉花抗性反应，通过增强体内SOD和CAT活性，清除有毒物质，减轻对细胞的损害。但耐病品种南农10号体内中的SOD和CAT活性则随着连作年限的延长逐渐降低，POD活性却则随连作年限的延长逐渐升高，说明连作土壤抑制了南农10号的SOD和CAT的活性，却诱导POD活性升高，这与金明红等^[30]研究结果一致。

作物遭受病菌侵染后，感病品种体内的SOD活性水平显著低于抗病品种^[31-32]，即使是同种植物，感病时期的SOD活性比抗病时期的活性低^[33]。向妙莲^[34]等研究了接种白叶枯病菌对不同抗性水稻的抗氧化酶的影响，结果表明抗病品种的SOD和CAT活性高于感病品种。接菌后第2天到第10天，病原菌侵染引起了两种棉花的SOD和CAT活性随连作年限延长而降低，说明连作后棉花的抗病性降低。然而，接菌后耐病品种南农10号POD活性则随连作年限延长而升高，而抗病品种中棉38的POD活性各处理间无显著变化，这可能与两棉花品种对病原菌抗性差异有一定关系。病原菌接种后造成了种植在连作土壤中的耐病品种南农10号CAT活性显著低于非连作土壤处理，引起其体内H₂O₂水平上升，导致过氧化物积累，进而可能诱导了体内POD酶活升高；而抗病品种中棉38体内相对较高的CAT活性能分解H₂O₂，可能没有诱导POD活性升高。本研究表明，连作土壤显著降低了棉花应对病原菌侵染引起的过氧化反应的能力，说明连作下棉花体内消除ROS的效率显著降低，进而降低了棉花的抗病性。但是连作条件下不同棉花品种对枯萎病菌抗氧化反应存在差异，也为棉花引种和棉花轮作倒茬提供理论依据。

丙二醛作为膜脂过氧化作用的最终产物，其含量是膜脂过氧化程度的一个重要标志^[35]。很多研究表明，植物受到病菌侵染后感病品种体内的MDA含量明显高于抗病品种^[31]。本研究结果发现种植在长期连作土壤中两种棉花的MDA含量均显著高于种植在短期连作和非连作对照土壤，说明连作引起细胞的膜质过氧化损伤。中棉38体内MDA含量在接菌后呈现波动性增长，而南农10号的MDA含量一直增加，且升高幅度大于中棉38，也说明了抗病品种中棉38通过体内的调节机制减轻过氧化损伤的能力更强。连作条件下，棉花枯萎病菌的胁迫造成棉花幼苗叶片的SOD、CAT活性降低，体内抗氧化酶代谢失衡，活性氧增多，致使膜脂发生过氧化过程加重，丙二醛含量升高。南农10号POD活性虽升高，但由于POD具有IAA氧化酶的性质^[36]，在逆境胁迫下CAT活性的降低和POD活性的增加都不利于对活性氧的清除，造成机体内活性氧增加，加速了O₂^-·、H₂O₂向毒性更强的·OH转化，从而也会加速膜脂过氧化过程^[35]，降低棉花幼苗的抗病性。

4 结论

综上所述，长期连作土壤显著影响了棉花正常生长，改变了棉花抗枯萎病菌生理生化特性，其中可溶性蛋白和MDA含量显著升高，SOD和CAT活性显著降低，两种棉花的POD活性对枯萎病菌响应的差异，也反映了不同品种之间的抗病性能的差异。研究结果表明，长期连作对棉花的生长和生理生化代谢造成影响，进而降低了棉花的抗枯萎病性，这可能是连作条件下棉花发病上升的重要原因之一。但连作条件下不同棉花品种对枯萎病的生理生化响应存在差异，因此在棉花引种时重视抗虫性的同时也应重视棉花的抗病性能，种植过程中应尽量避免非抗病品种连作。