由于矿山开采、金属冶炼、煤炭燃烧、工业生产以及废弃物填埋等，大量的锰(Mn)进入土壤和水体。目前，全世界每年平均排放1500万t Mn，造成严重的局部污染^[1]。此外，地壳平均含Mn量约为1%^[2]，几乎分布于所有的岩石和土壤矿物中。若土壤pH＜5.5，岩石和原生矿物中的Mn就会以Mn²⁺的形式进入土壤溶液，危害植物生长发育。值得注意的是，酸性土壤占全球耕地面积的40%以上^[3]，锰是仅次于铝的危害因素^[4]。我国南方也存在大面积的酸性森林土壤，pH值通常在4.0—5.5之间，土壤活性Mn²⁺含量较高，并因酸沉降呈逐渐增加的趋势^[5]。Mn²⁺对森林造成多方面的危害，如抑制树根吸收养分，降低树叶光合作用，妨碍树木生长发育和天然更新，导致森林大面积退化和衰亡^[6-9]。外生菌根真菌是森林生态系统中的重要成分，与树木根系形成外生菌根。在Hg、Cd、Cu浓度较高的培养液中，某些菌株表现出较强的抗性，仍能正常生长^[10-12]。树木接种外生菌根真菌，抗旱、抗病、抗重金属能力增强，在逆境中的成活率提高^[13-15]。在含Mn较高的煤矿废墟上，非菌根树木一般不能成活，而利用彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)接种松树幼苗之后，不仅提高成活率，并且促进生长^[16]。在Cu、Cd、Zn严重污染的矿区土壤上，种植桉树、松树和杉树的菌根苗能有效提高造林成功率^[17-18]。因此，利用菌根化苗木植树造林是绿化、美化、治理矿山和污染土壤的重要措施之一^[19-20]。

外生菌根真菌一方面能促进树木吸收养分，促进生长发育；另一方面通过吸附、络合、沉淀等作用减少重金属吸收^[21-23]。在重金属胁迫下，铆钉菇可分泌更多的酸性物质，螯合固定重金属，降低生物有效性^[24]；Ahonen-Jonnarth等报道，在Al胁迫下，接种菌根真菌的松树幼苗比非菌根苗能够分泌更多的有机酸^[25]；铝、锰胁迫提高外生菌根真菌Sl 13、Cg 04及Pt 715分泌草酸和氢离子的速率，有机酸与Al³⁺和Mn²⁺发生络合作用而减轻其毒害^[22]。为此，试验利用不同生态条件下获得的外生菌根真菌，液培研究了Mn²⁺对菌丝生长，养分吸收，有机酸和氢离子分泌的影响，以及锰在菌丝细胞内外的分布等，旨在筛选抗锰性较强的菌株，揭示其抗锰机理，为Mn污染土壤的植树造林和生态修复提供科学依据和手段。

1 材料与方法 1.1 材料准备

在初选试验的基础上，利用大白菇Rd Fr(Russula delica Fr.)、彩色豆马勃Pt 715(Pisolithus tinctorius 715)、土生空团菌Cg Fr(Cenococcum geophilum Fr.)和厚环粘盖牛肝菌Sg KlS(Suillus grevillei(Kl)Sing)为供试菌株。其中，Rd Fr来自于重庆金佛山马尾松林的强酸性黄壤(pH ≤ 4.0)；Pt 715从四川西昌干热河谷的桉树林(红壤，pH = 5.9)中分离获得；Cg Fr和Sg KlS源于内蒙古大青山的油松林土壤(pH ≈ 6.8—7.1)，由内蒙古农业大学的白淑兰教授提供。

采用Pachlewski固体培养基，(25±1)℃暗培养供试菌株14d备用。培养基组成为(g/L)：0.5酒石酸铵、1.0 KH₂PO₄、0.5 MgSO₄·7H₂O、20葡萄糖、20琼脂、0.1维生素B₁、1.0 mL/L微量元素混合液(每L含8.45 mg H₃BO₃、5 mg MnSO₄7H₂O、6 mg FeSO₄·7H₂O、0.625 mg CuSO₄·5H₂O、2.77 mg ZnCl₂和0.27 mg (NH₄)₂Mo₄O₁₃·2H₂O，pH 5.5。

1.2 试验设计

在我国西南锰矿和有色金属矿区，土壤溶液中的活性锰变化于157.1— 824.50 mg/L，平均440.3 mg/L^[26]。因此，试验在Pachlewski液体培养基中(固体培养基除去琼脂)，分别加入不同浓度的MnCl₂·4H₂O(分析纯)，形成以下4个处理：0 mg Mn²⁺/L(无Mn²⁺，对照)、200 mg Mn²⁺/L(低Mn²⁺)、400 mg Mn²⁺/L(中Mn²⁺)和800 mg Mn²⁺/L(高Mn²⁺)。分别取25 mL含不同Mn²⁺浓度的液体培养基置于150mL三角瓶中，121℃ 高压灭菌30min。冷却后每瓶分别接种一块直径为6mm固体菌块，(25±1)℃暗培养21d，重复10次。

1.3 测定项目与方法

培养结束后，用精密酸度计测定培养液pH。然后，用0.1mol/L H₂SO₄酸化培养液至pH 3.0，过滤收集菌丝，高效液相色谱测定滤液中的有机酸。色谱条件为：Ion-300有机酸分析专用柱(Phenomenex，Torrance，CA，USA)，20 μL进样量，2.5 mmol/L硫酸为流动相，流速0.5mL/min，柱温35 ℃，压力450 psi，Diode Array L-7455 紫外检测器，检测波长210 nm。检测的有机酸包括草酸、柠檬酸、乙酸，其出峰时间(min) 依次为8.88、11.52、19.71。(80±1)℃烘干菌丝，测定生物量后用硫酸-高氯酸消化，依次用靛酚蓝比色法、钼蓝比色法、火焰光度计法、原子吸收光光度计法测定消化液中的氮(N)、磷(P)、钾(K)、锰(Mn)^[27]。另取部分400 mg Mn²⁺/L培养的新鲜菌丝，去离子水洗净，滤纸吸干，置于25 mmol HCl/L + 40 mmol Ca(NO)₂/L交换溶液中，振荡10 min(70 r/min)，过滤，重复3次，合并滤液，硫酸-高氯酸消化菌丝。用原子吸收光光度计分别测定滤液和消化液中Mn²⁺，前者为质外体中的Mn²⁺，后者为原生质中的Mn^2+[10]。

1.4 数据处理

用Excel 2013对试验数据进行基本计算，SPSS软件进行统计分析，Duncan法比较试验处理间的差异性，显著水准为5%和1%。

2 试验结果 2.1 外生菌根真菌的菌丝生物量

外生菌根真菌的菌丝生物量(干重)因菌株不同而异，平均值变化于4.27 mg/瓶(Cg Fr) — 44.25 mg/瓶 (Rd Fr)之间(图 1)。Mn²⁺对Rd Fr生长无显著影响；低浓度Mn²⁺刺激Sg KlS生长，中、高浓度无抑制作用；但是，Mn²⁺显著降低Pt 715和Cg Fr的菌丝生物量，最大降幅分别为22.75%和33.33%。

2.2 N、P、K含量和吸收量

N：Mn²⁺显著降低外生菌根真菌菌丝含N量和吸收量(表 1)。在800 mg Mn²⁺/L的培养液中，Rd Fr、Pt 715、Cg Fr和Sg KlS的菌丝含N量分别比对照降低了59.26%、46.37%、17.07%和79.87%，吸收量依次减少了60.00%、56.25%、50.00%和75.00%。

P：Mn²⁺对外生菌根真菌的菌丝含P量和吸收量的影响因菌株不同而表现出多样性。随培养液中的Mn²⁺浓度提高，Rd Fr的含P量和吸收量增加；Pt 715的含P量无显著变化，但吸收量降低；Cg Fr的含P量增加，吸收量无显著变化(低浓度Mn²⁺除外)；Sg KlS的含P量和吸收量均降低。

K：Mn²⁺显著降低外生菌根真菌菌丝含K量和吸收量。在800 mg Mn²⁺/L培养液中，Rd Fr、Pt 715、Cg Fr和Sg KlS的含K量分别比对照降低了57.57%、23.32%、47.26%、40.91%，吸收量依次减少了61.90%、41.67%、62.50%、50.00%。

2.3 有机酸和H⁺分泌 2.3.1 有机酸

草酸：在Mn²⁺胁迫下，外生菌根真菌菌丝分泌草酸的速率因菌株不同而异(表 2)。其中，低浓度Mn²⁺促进Rd Fr分泌草酸，但中、高浓度无显著影响；Mn²⁺浓度增加，Pt 715和Cg Fr分泌草酸的速率提高，Sg KlS则相反。此外，草酸分泌速率Cg Fr > Pt 715 > Sg KlS > Rd Fr，平均分泌速率高低相差6.39倍。

柠檬酸：Mn²⁺对外生菌根真菌菌丝分泌柠檬酸的影响也因菌株不同而异(表 2)。Mn²⁺促进Rd Fr分泌柠檬酸，但降低Pt 715、Cg Fr和Sg KlS的分泌速率。此外，分泌柠檬酸速率Cg Fr > Sg KlS > Rd Fr和Pt 715。

乙酸：在Rd Fr、Pt 715和Cg Fr的培养液中，未检测出乙酸(表 2),但是，Sg KlS分泌乙酸的速率随Mn²⁺浓度增加而降低。在800 mg Mn²⁺/L的培养液中，其分泌速率比对照降低了76.30%。

2.3.2 氢离子

表 2可见，随培养液中的Mn²⁺浓度提高，Rd Fr、Pt 715和Sg KlS分泌H⁺的速率持续降低(仅Rd Fr在高浓度Mn²⁺时例外，但仍显著低于对照)，但Cg Fr分泌H⁺的速率则相反。在800 mg Mn²⁺/L的培养液中，Rd Fr、Pt 715和Sg KlS分泌H⁺的速率分别比对照降低了17.58%、65.91%和48.89%，Cg Fr增加了38.39%。

2.4 菌丝Mn含量、吸收量及其分布 2.4.1 含量和吸收量

菌株不同，菌丝含Mn量和吸收量也不一样，平均含Mn量Cg Fr > Pt 715 > Rd Fr > Sg KlS；平均吸收量Rd Fr最高，Cg Fr最低。随培养液中的Mn²⁺浓度提高，菌丝含Mn量和吸收量显著增加。在800 mg Mn²⁺/L培养液中，菌丝含Mn量和吸收量分别比对照增加了6.57—96.67倍和6.58%—112.42%(图 2)。

2.4.2 Mn分布

表 3可见，菌丝原生质含Mn量变化于0.53—2.01mg/g之间，质外体含Mn量为4.88—10.52mg/g，后者是前者的的5.23—11.2倍。此外，原生质和质外体含Mn量Cg Fr最高，分别是其它菌株的2.45—3.79倍(原生质)和1.64—2.15倍(质外体)。

3 讨论

在逆境条件下，生物的生长状况是反映其抗性的最重要指标^[28-29]。Mn²⁺对Rd Fr生长无显著影响；低浓度Mn²⁺刺激Sg KlS生长，中、高浓度仍无抑制作用，说明Rd Fr和Sg KlS抗(耐)Mn的能力较强。继续开展Rd Fr和Sg KlS菌根植物抗(耐)Mn的研究，有益于它们的实际应用。

Blaudez等认为，外生菌根真菌对重金属抗性的差异与它们的来源地有关^[30]。供试菌株Rd Fr生长于重庆市金佛山马尾松林下强酸性土壤(pH≤4.0)，活性Mn²⁺含量高，为了适应生存环境，物竞天择，逐渐进化出抗(耐)Mn能力较强的生物学特性。但是，Sg KlS则来源于内蒙古大青山油松林的中性土壤(pH 6.8—7.1)，活性锰含量较低^[9]，推测Sg KlS抗锰性较强可能为固有生物学特性。在培养基中添加不同浓度的Mn²⁺，均未抑制Rd Fr和Sg KlS生长。推测在Mn²⁺含量较高的土壤中，Rd Fr和Sg KlS也可能较好的生长。当它们与树木根系形成外生菌根之后，生长良好的外延菌丝广泛深入土壤，有益于扩大养分吸收空间，维持养分吸收，保持寄主植物健康，增强抗逆能力^[31]。

外生菌根真菌通过固定、钝化、分隔、抑制吸收和解毒等多种途径拮抗重金属危害^[32-33]。PO₃^3-与Mn²⁺形成难溶性磷酸盐[Mn₃(PO₄)₂·nH₂O，Ksp = 6.13×10^-32]，有效地固定Mn²⁺。因此，菌根真菌组织中的磷酸盐或聚磷酸能结合固定重金属，降低有效浓度，减轻锰害^[34]。在Mn²⁺胁迫条件下，外生菌根真菌增加P的吸收可能是减轻Mn²⁺毒的原因之一^[9]。尽管Rd Fr和Sg KlS同属抗(耐)性较强的菌株，但培养液中的Mn²⁺使Rd Fr含P量和吸收量增加，Sg KlS则相反，故增加 P吸收可能是Rd Fr而非Sg KlS减轻Mn²⁺毒的策略。此外，[Mn(C₂O₄)₃]^3-和Mn₃(C₆H₅O₇)₂的稳定常数(lgβ)分别为19.4和11.4，故外生菌根真菌增加草酸和柠檬酸分泌能降低Mn²⁺的有效浓度，有益于减轻Mn毒。但是，Mn²⁺对供试菌株分泌草酸和柠檬酸的影响也表现出多样性，说明它们通过分泌有机酸络合Mn²⁺而减轻毒害的作用因菌株不同而异。

值得注意的是，培养液中的Mn²⁺显著降低Rd Fr和Sg KlS分泌氢离子的速率。在土壤pH 3—9范围内，每提高一个pH值单位，Mn²⁺浓度下降100倍，故pH对活性Mn含量影响巨大^[35]。因此，在Mn²⁺胁迫条件下，外生菌根真菌减少氢离子分泌可降低Mn的活性，是防止Mn²⁺进入菌丝的有效的途径之一。在Rd Fr和Sg KlS的菌丝和原生质中，含Mn量显著低于Cg Fr和Pt 715，说明抗(耐)Mn能力较强的菌株能有效地阻止Mn²⁺进入菌丝和原生质，减轻Mn毒。松树幼苗接种彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)之后，Mn主要存在于根系表面的菌套中，仅有少量进入根系和运输到地上部，由此减轻Mn的毒害作用^[16]。此外，无论抗Mn²⁺性强弱，外生菌根真菌吸收Mn²⁺后，大量存在于质外体，仅少量进入原生质，类似Bidwell等^[36]的研究结果。说明原生质膜是防御Mn²⁺进入细胞的重要屏障。

总之，Rd Fr和Sg KlS具有较强的抗(耐)Mn²⁺性。在Mn²⁺胁迫的条件下，外生菌根真菌吸收P和分泌有机酸表现出多样性，但减少氢离子分泌和Mn²⁺进入菌丝和原生质是抗性菌株的共同特性，可视为拮抗Mn²⁺害的重要机制之一。